PCR扩增常见问题及特点
PCR 扩增常见问题及特点
PCR产物的电泳检测时间
一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。假阴性，不出现扩增条带。
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR 循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20 ul、30 ul、50 ul。或100 ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20 ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方
法来减轻或消除。
出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。
出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。
（1）PCR产物是否需要用凝胶纯化？
如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。
（2）如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？
A. 涂布未转化的感受态细胞。
如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。
B. 转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。
例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为：产生菌落的总数/铺板DNA的总量。铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为：
1000克隆X10（3次方）ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞
如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。
C. 如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug 感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。
D. 用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。
（3）对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？
A. 连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4℃过夜。
B. 插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T 正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。
C. 插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。
D. 带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy 载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。
E. 高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株。
PCR反应特点
特异性强PCR反应的特异性决定因素为：
①引物与模板DNA特异正确的结合；
②碱基配对原则；
③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；
④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR 的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
简便、快速PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA 扩增检测。
PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR 产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。
琼脂糖凝胶电泳：通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。
聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。
酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。
分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。
Southern印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。
斑点杂交：将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。
氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200 umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现
非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置：
基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100～300 bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性）。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR 失败。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4（G+C）+2（A+T）
复性温度=Tm值-（5～10℃）
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃150核苷酸/S/酶分子
70℃60核苷酸/S/酶分子
55℃24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1 Kb以内的DNA片段，延伸时间1 min是足够的。3～4 kb的靶序列需3～4 min；扩增10 Kb需延伸至15 min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
PCR扩增原理及操作
PCR扩增反应的操作 第一节PCR扩增反应的基本原理 一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成 PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。 PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA 膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA 在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。 1．模板DNA的变性 模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR 中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。 2．模板DNA与引物的退火 将反应混合物温度降低至37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为1～2min。 3．引物的延伸 DNA模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72℃条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40～60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需2～4min，一次PCR经过30～40次循环，约2～3h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和，便出现所谓的“平台效应”，即靶DNA产物的浓度不再增加。 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y ＝（1＋X）n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，
pcr扩增的原理和步骤
PCR 扩增的原理和步骤 聚合酶链反应(polymerasechain reaction PCR)技术是20世纪80年代中期发 展起来的一项基因检测即一种体外核酸扩增技术。它具有许多优点：特异性、易重复、高效性等，可以在几个小时完成过去几天或者更长时间完成的实验，因此这项技术在生物医学领域具有划时代的意义。但是，传统PCR技术有它的缺点，它通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析而不能对起始模板准确定量，同时也无法对扩增反应实时检测且在实验过程中易污染而出现假阳性。人们为了寻找更为灵敏、快速、简便、高特异性的方法进行了许多探索研究，直到1996 年由美国Applied Biosystems公司推出了一种新的定量试验技术—荧光定量PCR(F lurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR；real-time quantitati ve PCR,RT-qPCR or qPCR)，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记 跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计 算待测样品模板的初始浓度，实现了PCR 从定性到定量质的跨越，具有里程碑 意义。目前，此项技术已应用于干细胞研究、肿瘤学和遗传疾病研究、病原体检 测和传染病研究、药物分析、药物基因组学、植物学研究和农业生物科技等多领 域研究中。本文对实时荧光定量PCR 的原理、分类和应用进行阐述。 一、实时荧光定量PCR技术的原理 real-time quantitative PCR 技术是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，通过 荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中有2个概念比较重要。(1)荧光域值(t hreshold)的设定： PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15 个循环的荧光信号标准偏差的10 倍。(2)Ct 值：C 代表Cycle，t 代表 threshold，Ct 值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值 时所经历的循环数。在实时荧光定量PCR中，对全程PCR扩增过程进行实时检测，根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。一般来说，整条曲线可以分3个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号与背景无法区分，无法判断产物量的变化。在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，所以反应终产物量与起始模板量之间已 经不存在线性关系，通过反应终产物也算不出起始DNA 拷贝数。只有在荧光产
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PCR扩增的原理和步骤 聚合酶链反应(polymerasechain reaction PCR)技术是20世纪80年代中期发展起来的一项基因检测即一种体外核酸扩增技术。它具有许多优点：特异性、易重复、高效性等，可以在几个小时完成过去几天或者更长时间完成的实验，因此这项技术在生物医学领域具有划时代的意义。但是，传统PCR技术有它的缺点，它通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析而不能对起始模板准确定量，同时也无法对扩增反应实时检测且在实验过程中易污染而出现假阳性。人们为了寻找更为灵敏、快速、简便、高特异性的方法进行了许多探索研究，直到1996年由美国Applied Biosystems公司推出了一种新的定量试验技术—荧光定量PCR(F lurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR；real-time quantitati ve PCR,RT-qPCR or qPCR)，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度，实现了PCR从定性到定量质的跨越，具有里程碑意义。目前，此项技术已应用于干细胞研究、肿瘤学和遗传疾病研究、病原体检测和传染病研究、药物分析、药物基因组学、植物学研究和农业生物科技等多领域研究中。本文对实时荧光定量PCR的原理、分类和应用进行阐述。 一、实时荧光定量PCR技术的原理 real-time quantitative PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中有2个概念比较重要。(1)荧光域值(t hreshold)的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号标准偏差的10倍。(2)Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。在实时荧光定量PCR中，对全程PCR扩增过程进行实时检测，根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。一般来说，整条曲线可以分3个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号与背景无法区分，无法判断产物量的变化。在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，所以反应终产物量与起始模板量之间已经不存在线性关系，通过反应终产物也算不出起始DNA拷贝数。只有在荧光产生进入指数期，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，所以在P CR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，由此来推断模板最初的含
PCR各步骤的目的
P C R各步骤的目的 Prepared on 22 November 2020
PCR各步骤的目的 （一）预变性： 破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。使DNA充分变性，减少DNA复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。 （二）变性--退火--延伸循环： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。 （三）用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因： 1.延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用taq DNA聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。 2.根据延伸速率推得，扩增1kb以内的dna片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。 3.继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。
PCR扩增实验操作步骤
PCR扩增反应 一、实验原理 PCR：是一种选择性扩增DNA或RNA的方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中的DNA半保留复制机理，以及在体外dNTP分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链DNA；单链DNA与人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。 PCR反应分3步：①变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；②退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA 双链之间互补的机会较少。③延伸：在DNA聚合酶和4 种dNTP底物及Mg2+存在的条件下，5'→3'的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2×106~7拷贝。 变性 退火 延伸 图反应历程
二、实验材料 1·模板：细菌DNA 2·TsgDNA聚合酶3·dNTP混合液 4·10倍浓度PCR缓冲液5·2.5mmol/LMgCl2 6·RAPD引物：S14 S15 S18 S66 S74 S88 S97 S103 S110 S115 7·提取细菌DNA的相关试剂 三、操作步骤 1．细菌染色体DNA的提取（见上一组） 3·反应程序： 将RAPD反应试剂加入EP管中 轻混后用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加热-冷却的过程中蒸发，盖好盖子 打开PCR反应仪输入以下反应数据 ●94 摄氏度预变性5min ●94摄氏度变性40s ●40摄氏度退火40s ●72摄氏度延伸1min 将EP管放入仪器开始扩增，循环35次；72摄氏度延伸10min 仪器为Model MyGene 25 Plus 三、注意事项 1、PCR反应体系中DNA样品及各种试剂的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性 及全部放入反应体系中。 2、为避免污染凡是用在PCR反应中的Tip尖、离心管、蒸馏水都要灭菌；吸每种试剂 时都要换新的灭菌Tip尖。 3、加试剂时先加消毒三蒸水，最后加DNA模板和Taq DNA聚合酶。 4、置PCR仪进行PCR反应前，PCR管要盖紧，否则使液体蒸发影响PCR反应。 5.引物条件首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定二聚 体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。
pcr扩增的原理和步骤
pcr扩增的原理和步骤 一、基本原理：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。 在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA 聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 二、PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。 2、模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA 聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。
重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 扩展： 在实践中，聚合酶链式反应（PCR）可以因各种原因而失败，部分原因是由于其对于污染的敏感性，导致扩增错误的DNA产物。正因为如此，人们已经开发了一些技术和步骤来优化聚合酶链式反应条件。将聚合酶链式反应前的混合物与潜在DNA污染物分开的实验室方案和流程解决了外源DNA的污染问题。 这通常包括从用于分析的区域分理出聚合酶链式反应的设定区域或者说聚合酶链式反应产物的纯化，一次性塑料制品的使用，及对反应装置之间的工作台面彻底清洁。引物的设计技术在改善聚合酶链式反应产物产率和避免杂产物的形成是很重要的。
PCR的基本步骤及注意
（DNApolymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的（Thermusaquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似修复复制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe提出。他发表了第一个单纯且短暂复制（类似PCR 前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年化学奖。 PCR原理 DNA的是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计，DNA 聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。 发现耐热DNA聚合酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩扩增放大几百万倍。 [PCR反应体系与反应条件] 1.标准的PCR反应体系 10×扩增缓冲液10μl 4种dNTP混合物200μl 引物10～100μl 模板DNA ～2μg
RTPCR原理和实验步骤
RT—PCR原理与实验步骤 一、知识背景： 1、基因表达：DNA RNA Protein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d,可以合成105个丝心蛋白) 共合成109个丝心蛋白。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 2、PCR技术(Polymerase chain reaction）：即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步： A。变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA； B.退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合. C。延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5’3’方向延伸。以上三步为一个循环,如此反复。 3、逆转录酶和RT-PCR 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶,至少具有以下三种活性： 1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链; 2、Rnase水解活性：水解RNA：DNA杂合体中的RNA； 3、依赖DNA的DNA聚合酶活性:以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA。 二、RT—PCR的准备: 1。引物的设计及其原则： 1）引物的特异性决定PCR反应特异性.因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型,不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物,或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。 2) 引物设计原则的把握 引物设计原则包括： a、引物长度：一般为15～30bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度,也影响反应的特异性。 b、碱基分布:四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。GC含量（Tm值）:40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度.
pcr扩增的原理和步骤
PCR扩增反应的操作 第一节PCR扩増反应的基本原理 一、聚合魄式反应(PCR)的基本构成 PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板(克隆或基因组DNA)的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等. PCR基本原理：是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3,末墙有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微鼠的模板DNA得到极大程度的扩增.在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端己知序列分别互补的两个引物、适量的緩冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热TaqDNA聚合醇、Mg2件.反应时先将上述溶液加热, 使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态：然后降低溶液温度,使合成引物在低温下与其祀序列配对，形成部分双链，称为堰火；再将温度升至合适温度.在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重夏改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩増.因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、痢稳定DNA 聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成(见图)。 1.模板DNA的变性 模板DNA加热到90^5-C时,双螺旋结构的级键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合.为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关，GC间由三个氢键连接，而A-T间只有两个狙键相连.所以Gt含量较高的模板，其解链温度相对要高些. 故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G_C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚破(DMSO),并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用 97-C,时间适当延长，即所谓的热启动. 2.模板DNA与引物的退火 将反应混合物温度降低至37-65C时，寡核昔酸引物与单链模板杂交，形成DNA棋板?引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核昔酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于棋板DNA的浓度，井由于引物的长度显著短于棋板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为I ?2min。 3.引物的延伸 DNA模板-引物复合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板. 按基困对与半保留复制原理,合成一条与模板DNA鮭互补的新链。重复循环变性-退火?延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制鮭”，而且这种新鮭又可成为下次循环的模板.延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72*C条件下,Taq DNA聚合醪催化的合成速度大约为40?60个碱基,秒.经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中, 新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就増加一倍.每完成一个循环需2?4min, 一次PCR经过30?40次循环，约2?3丄扩増初期，扩増的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时.酶的催化反应趋于抱和，便出现所谓的“平台效应”.即爬DNA 产物的浓度不再増加. PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩増暈呈指数上升.反应最终的DNA扩増量可用Y= (1+X) ■*计算.Y代表DNA片段扩増后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩増效率，n 代表循环次数。平均扩増效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的増加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩増的DNA片段不
普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤
普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的 基本原理和操作步骤 普通PCR 1概述 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR 则于1983由Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与Saiki 等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。 2 PCR原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 3 PCR反应体系与反应条件 3.1标准的PCR反应体系 10×扩增缓冲液10μl 4种dNTP混合物200μl 引物10～100μl 模板DNA 0.1～2μg
PCR原理及过程
PCR技术原理、实验步骤和应用 来源：易生物实验浏览次数：3623 网友评论0 条 PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。 关键词：PCR技术PCR聚合酶链反应 一、实验目的 1.掌握聚合酶链式反应的原理。 2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。 二、实验原理 PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA 重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。 PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；
pcr扩增的原理和步骤
pcr扩增的原理和步骤 聚合酶链反应( CR)是分子生物学中的一种科学技术，将一段DNA的一个或几个拷贝跨越几个数量级，产生数千到数百万个特定DNA序列的拷贝。目前，PCR是一种常见的、经常不可缺少的技术，用于医学和生物研究实验室的各种应用。PCR技术涉及三个主要步骤：变性、退火和扩展。PCR技术有助于对越来越多的疾病进行调查和诊断。定性PCR不仅可以检测人类基因，还可以检测细菌和病毒的基因。PCR也被用于法医实验室，并且特别有用，因为只需要少量的原始DNA。PCR可以识别与癌症发展有关的基因。分子克隆得益于PCR作为一种技术的出现。 基本概念 PCR基本原理简单。顾名思义，它是一个链式反应：一个DNA分子被用来产生两个拷贝，然后是四个，然后是八个等等。这种连续的加倍是由特定的蛋白质完成的，称为聚合酶，这种酶能够将单个DNA构建块串在一起形成长分子链。要完成他们的工作聚合酶需要提供DNA构建块，即由腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)组成的核苷酸。他们还需要一个小的DNA片段，称为引物，他们将构建块以及一个较长的DNA分子连接起来，作为构建新链的模板。如果提供这三种成分，酶将构建模板的精确副本。PCR是一种用于获取任何特定核酸链的许多拷贝的方法。这是一种选择性地扩增DNA特定片段的手段。该片段可能代表DNA大而复杂的混合物的一小部分。人类基因的特定外显子。它可以被认为是分子复印机。PCR可以在~2小时内扩增出可用数量的DNA（通过凝胶电泳可见）。模板DNA不需要高度纯化一个煮沸的细菌菌落。可用限制性内切酶对PC R产物进行酶切，测序或克隆。PCR可以扩增单个DNA分子，例如，从一个精子聚合酶链反应依赖于DNA复制酶在高温下保持稳定的能力。PCR 已经改变了几乎所有需要操纵DNA片段的研究都可能由于其简单和有用而进行的方式。在Mullis的原始PCR过程中，该酶被用于体外。将双链DNA加热至96°C，分离成两条单链DNA。然而，在这个温度下，大肠杆菌DNA聚合酶被破坏，因此在每个循环的加热阶段后，酶必须补充新的新鲜酶。穆利斯最初的PCR 过程非常低效，因为它需要大量的时间、大量的DNA聚合酶，以及整个PCR过程中的持续关注。 PCR技术的步骤
PCR扩增的原理和操作步骤 有哪些
PCR扩增的原理和操作步骤有哪些 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经高温变性;--;低温退火;--;引物 PCR扩增仪 延伸三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。 在环境检测中，靶核酸序列往往存在于;-;个复杂的混合物如细胞提取液中，且含量很低，对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。使用PCR技术可将靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。PCR技术常与其他技术结合起来使用，如RT-PCR、竞争PCR、槽式PCR、RAPf)、ARDRA等。 到如今，PCR方法愈发趋向自动化，并从中衍生出更多的新技术方法，可以说，PCR技术是支撑现代分子生物学发展的一块重要基石。这种技术的广泛应用催生了一个庞大的市场，多个公司均有各种类型的商品化PCR仪出售。 PCR原理：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的作用下，以单链为模版，根据碱基互补配对原则复制成新的单链，与模版配对成为双链分子拷贝。在体外实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计与模板DNA的5端结合的两条引物，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制，多次重复变性解链-退火-合成延伸的循环就可以以几何级数大量扩增特定的基因。而发现耐热DNA聚合酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该类酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技
pcr扩增的原理和步骤
1 PCR扩增反应的操作 第一节PCR扩增反应的基本原理 一、聚合酶链式反应PCR的基本构成 PCR是聚合酶链式反应的简称指在引物指导下由酶催化的对特定模板克隆或基因组DNA 的扩增反应是模拟体内DNA复制过程在体外特异性扩增DNA片段的一种技术在分子生物 学中有广泛的应用包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。 PCR基本原理是以单链DNA为模板4种dNTP 为底物在模板3’末端有引物存在的情况下 用酶进行互补链的延伸多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心 管中加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA 膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热使模板DNA 在高温下变性双链解开为单链状态然后降低溶液温度使合成引物在低温下与其靶序列配对 形成部分双链称为退火再将温度升至合适温度
在Taq DNA聚合酶的催化下以dNTP为原 料引物沿5’→3’方向延伸形成新的DNA片段该片段又可作为下一轮反应的模板如此重复 改变温度由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期反复循环使目的基因得以迅速扩 增。因此PCR循环过程为三部分构成模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下 催化DNA链延伸合成见图。 1模板DNA的变性 模板DNA加热到90~95℃时双螺旋结构的氢键断裂双链解开成为单链称为DNA的变 性以便它与引物结合为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关G-C间由三个氢 键连接而A-T间只有两个氢键相连所以G-C含量较高的模板其解链温度相对要高些。故PCR 中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于 高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜DMSO并且在PCR循环中起始阶 段热变性温度可以采用97℃时间适当延长即所谓的热启动。 2模板DNA与引物的退火
pcr扩增的原理和步骤
PCR技术的原理与反应步骤 20世纪70年代末，随着DNA重组技术的产生和发展，如何快速获得目的基因（待检测或待研究的特定基因）片段已经成为瓶颈问题。1983年K.Mullis发明了聚合酶链反应（PCR）技术。该技术可将微量DNA片段大量扩增，使微量DNA或RNA的操作变得简单易行。PCR技术的高敏感、高特异、高产率、可重复、快速简便等优点使其迅速成为分子生物学研究中应用最为广泛的方法，许多以往无法解决的分子生物学研究难题得以解决。PCR技术的发明是分子生物学的一项革命，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展，成为分子生物学与医学的支撑技术。PCR技术的发明者Kary Mullis为此获得了1993年的诺贝尔化学奖。 近年来，PCR技术不断改进，从手工操作发展到自动化仪器，从定性分析发展到定量测定。该方法与其他分子生物学技术相结合，其用途日益广泛。新的PCR技术类型层出不穷。 一、PCR技术的工作原理 PCR的基本工作原理是在体外模拟体内DNA复制的过程。以待扩增的DNA分子为模板，用两条寡核苷酸片段作为引物，分别在拟扩增片段的DNA两侧与模板DNA链互补结合，提供3'-0H末端；在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成两条新链的合成。不断重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。PCR反应的特异性依赖于与模板DNA两端互补的寡核苷酸引物。组成PCR反应体系的基本成分包括模板DNA、特异引物、耐热性DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）、dNTP以及含有Mg2+的缓冲液。 PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法。每个PCR体系均包括4种主要成分：含有待扩增序列的DNA模板、引物（primer）、TaqDNA聚合酶（TaqDNA polymerase）和脱氧核糖核酸三磷酸（dNTP）。 PCR的基本反应步骤包括高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成： ①高温变性：将反应体系加热至95℃，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以消除； ②低温退火：将温度下降至适宜温度（一般较Tm低5℃，约50-65℃），两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链，使引物与模板DNA结合； ③适温延伸：将温度升至TaqDNA聚合酶的最适温度72℃，DNA聚合酶以引物3'端为合成的起点，以单核苷酸dNTP为原料，沿模板以5'→3'方向延伸，催化DNA的合成反应，合成DNA新链。
pcr扩增的原理和步骤
PCR扩增的原理和步骤 pcr扩增原理： DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。 因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。 耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”。 而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 pcr扩增步骤 标准的PCR过程分为三步： DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA 退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。 延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。 每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。
RT-PCR原理与实验操作步骤讲解
RT-PCR原理与实验操作步骤 关键词：RT-PCR 逆转录酶reversetranscriptase 聚合酶链式反应引物设计DNA 聚合酶 一、知识背景： 1、基因表达：DNA RNA Protein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白）共合成109个丝心蛋白。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。2、PCR技术(olymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA 聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步： A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA； B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。
C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5' 3'方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。 3、逆转录酶和RT-PCR 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA 第一条链； 2、Rnase水解活性：水解RNANA杂合体中的RNA； 3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA. 二、RT-PCR的准备： 1、引物的设计及其原则： 1）引物的特异性决定PCR反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性
pcr扩增的原理和步骤
PCR扩增的原理和步骤 普通PCR 1概述 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA 聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE 公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与Saiki 等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。 2 PCR原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 3 PCR反应体系与反应条件