PCR引物设计

NCBI引物设计

1.请设计PCR引物需要注意哪些问题？请以小鼠脂肪合成基因(FAS)为例，设计一对引物（用于小鼠FAS基因real time PCR 表达测定的PCR引物），使用NCBI上的引物设计软件（https://www.360docs.net/doc/5b2419840.html,/tools/primer-

blast/index.cgi?LINK-LOC=BlastHome),列出设计引物时各个参数的设置条件，引物的结合位点及PCR产物长度。基因在ncbi的gene下面找。

注意事项：

1.引物长度一般在15-30bp之间，引物长度常用的是18-27bp，但不应大于

38bp，因为过长会导致其延伸温度大于72℃，即Taq DNA聚合酶最适温度。2.2.引物GC含量在40%-60%之间，45%-55%为宜。GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。

3.如果两个引物的Tm值不同，最好差异在10℃以内。

4.引物3′端比5′端重要，引物3′端一般不含A，因为A引发错配率高，另外若3′端形成二聚体或发夹结构也会导致PCR的失败。

进入NCBI主页，选nucleotide,输入基因名称，最后点击search搜索

页面往下滑，会看到gene,exon,cds等信息，选中cds目的基因，点击右上侧的pick primers

进入如下页面，设计引物的参数条件

设置好后，点击get primiers。进入下个页面后点击check。然后出现了很多引物，选一对合适的即可，这里选pair 3.