微生物生态学研究方法进展
第!"卷第#期!$$"年#月
生态学报
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4563!$$"
微生物生态学研究方法进展
张洪勋3王晓谊3齐鸿雁
7
中国科学院生态环境研究中心环境生物技术研究室3北京8$$$9#:
基金项目;国家<十五=科技攻关重点项目7!$$8>%?$">:收稿日期;!$$!@$?@$?A 修订日期;!$$!@$"@8#
作者简介;张洪勋78?#"B:3男3吉林人3博士3研究员3主要从事微生物生态学3环境生物技术的研究C (@D 5E 1;F G H F 5I J K D 5E 12L M N N O 25M 2M I
P Q R S T U V W Q SW V X Y ;’F N .5Z E 0I 51<’N I Z F[E \N @6N 5L ]15I =^N 6’N M F I 010J E N O _‘a ]L 0J L 5D D N 7!$$8>%?$">:b X c X W d X TT U V X ;!$$!@$?@$?A e c c X f V X TT U V X
;!$$"@$"@8#g W Q h i U f j k ;l m %.+m 0I J @n o I 3]F 2a 23]L 0p N O O 0L 3D 5E I L N O N 5L M F 5L N 5O ;D E M L 0q E 51N M 010J 65I r N I \E L 0I D N I Z 51
q E 0Z N M F I 010J 62(@D 5E 1;F G H F 5I J K D 5E 12L M N N O 25M 2M I
摘要;微生物培养及显微技术作为鉴定微生物种群的手段有很大的局限性3因为环境中大多数微生物处于<
存活但不能培养=的状态C 因此3不依赖于微生物培养的生物化学以及分子生物学方法正被广泛地用于微生物生态学研究C 主要介绍了荧光技术3基于]&_的分析技术和]*[%等技术在表征微生物多样性研究中的某些进展C
关键词;微生物生态A 荧光标记蛋白A [,-m A ]&_@_[*]A ]&_@--&]A ]&_@a ++(A ]*[%
s X d X t Q f Y X S V W Si X u X U i c jY X V j Q T u Q v Y W c i Q w W U t X c Q t Q h k
l m %.+m 0I J @n o I 3x%.+n E 50@y E 3z ,m 0I J @y 5I
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e w u V i U c V ;’F N M o 1Z E \5Z E 0I 0pD E M L 0q N O 5I r D E M L 0O M 0H 6Z N M F I E I o N O 5O 5D N 5I O Z 0E r N I Z E p 6D E M L 0q E 51M 0D D o I E Z E N OF 5\NO N \N L N1E D E Z 5Z E 0I O 3O E I M NZ F ND 5J 0L E Z 60p D E M L 0q N OE IZ F NN I \E L 0I D N I Z5L N\E 5q 1Nq o Z I 0I M o 1Z o L 5q 1N 2[0L Z F E O L N 5O 0I 3Z F N D N Z F 0r O 0p q E 0M F N D E O Z L 65I r D 01N M o 15L q E 010J 6Z F 5Z 5L N E I r N H N I r N I Z 0p M o 1Z o L E I J5L Nq N E I J K E r N 16o O N rE IZ F NO Z o r E N O 0p D E M L 0q E 51N M 010J 62,IZ F E O H 5H N L 3p 1o 0L N O M N I Z Z N M F I E I o N 3]&_@q 5O N r Z N M F I E I o N 3]*[%Z N M F I E I o N 5I r 0Z F N L O Z 0M F 5L 5M Z N L E H N r E \N L O E Z 60pD E M L 00L J 5I E O D O 5L N L N \E N K N r
2[1o 0L N O M N I M N @q 5O N r D E M L 0O M 0H 6Z N M F I E I o N O5L N K E r N 16o O N r E I D E M L 0q E 51N M 010J 62-o M F Z N M F I E I o N O E I M 1o r N p 1o 0L N O M N I Z H L 0Z N E I 3p 1o 0L N O M N I M N O Z 5E I E I Jp 0L Z 0Z 51M 0o I Z O 3\E 5q E 1E Z 6M 0o I Z O 5I rp 1o 0L N O M N I M N E IO E Z o F 6q L E r E H 5E 0I 7[,-m :2’F N 5r \5I Z 5J N 0p [,-m E O Z F 5Z E Z r 0N O I 0Z I N N r M N 1116O E O 5I r N 5O 6Z 0H N L p 0L D 2>o Z Z F N L N O o 1Z 5p p N M Z N rq 6Z F N r E p p N L N I M N 0p Z F N M N 11D N D q L 5I N L O H N I N Z L 5Z E 0I5q E 1E Z 62,Z E O H 0K N L p o 1Z 001p 0L O Z o r 6E I J H 0H o 15Z E 0I r 6I 5D E M O 3Z L 5M M E I J D E M L 00L J 5I E O D O L N 1N 5O N r E I Z 0Z F N N I \E L 0I D N I Z q o Z M 5I L Z E r N I Z E p 6D E M L 00L J 5I E O D O F 5O I 0Z q N N IM o 1Z o L N r
2]&_@q 5O N rZ N M F I E I o N O E I M 1o r N ]&_@_[*]3]&_@--&]3]&_@a ++(2’F N 6F 5\N q N N IZ F N D 0O Z o O N p o 1E I H L 0\E r E I J E I p 0L D 5Z E 0I5q 0o Z D E M L 0q E 51M 0D D o I E Z E N O 2’F N J L N 5Z N O Z 5r \5I Z 5J N 0p Z F 0O N D N Z F 0r O E O 5\0E r E I J M o 1Z E \5Z E 0I K F E M FO 01\N O Z F N q E J0q O Z 5M 1N &=2’F N Z N M F I 010J 6F 5O q N N I K N 11N O Z 5q 1E O F N r5I r5H H 1E N r E I Z 0D E M L 0q E 51M 0D D o I E Z E N O L N O N 5L M F N O 0p O 0E 13q E 0p E 1D O 3O N 5K 5Z N L 3K N Z 15I r O 5I r $%&’2’F N r E O 5r \5I Z 5J N O M 5o O N rq 6Z F N O Z 0L 5J N 3N G Z L 5M Z E 0IN p p E M E N I M 6316O E O N p p E M E N I M 65I r]&_N p p E M E N I M 6F 5\Nq N N IO 01\N rE IO 0D N N G Z N I Z q o Z O Z E 11I N N rp o L Z F N L O Z o r 6
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N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N 2万方数据
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文章编号M U V V V S V W X X Y Z V V X [V \S V W ]]S V ]中图分类号M ^W X ]_U 文献标识码M $
微生物生态学作为一门学科出现在Z V 世纪‘V 年代早期aZ V 世纪b V 年代后期>随着人们对环境问题
的日益关注>微生物生态学得到了迅速的发展c U d
aW V 年代引入分子生物学技术之后>
微生物生态学的研究更加深入a 许多研究已经证实>通过传统的分离方法鉴定的微生物只占环境微生物总数的V :U ef
U V e c Z >X d
>远远不能满足微生物生态学研究的需要a
应用现代生物化学和分子生物学方法>克服了传统微生物生态学研究技术的局限性>获取更加丰富的微生物多样性信息>推动着当今微生物生态学研究的进一步发展a 下面介绍近年来微生物生态学研究的主要方法a g 荧光技术
以荧光为基础的显微技术在微生物生态学研究中应用广泛>主要包括荧光标记蛋白的应用N 测定总菌数h 活菌数以及荧光定位杂交Y #./7*+0-+&51&015/?39*1’1B %517&>#D ;P [a g _g 荧光标记蛋白的应用
许多微生物在环境变化过程中表现出一种i 存活但不能被培养j Y 21%9.+9/5&7&-/.5/*%9.+>k A l Q [的状态a 在这种状态下>细胞不能在传统的培养基上生长>但仍然处于存活状态>并在一定条件下可以恢复代
谢活性并转入可培养的状态c m d
a (:"7@’+*等人他们用绿色荧光蛋白Y 6*++&=./7*+0-+&54*75+1&>O #![的一种短半衰期突变株作为新陈代谢的指示>对这种状态的微生物进行了研究a 这种不稳定的蛋白不同于一
般的O #!>在i 饥饿j 或者k A l Q 状态下很快失去荧光a 这样>就可以用O #!作为指示剂监测由于环境变化
而引起微生物新陈代谢的变化c \d a
根瘤菌在植物的根部形成有固氮作用的瘤状物a Q :n 1h U O :T 1*1,c ‘d
等人利用一个合成的双标记微
oo C &\转座子Y 该转座子包含一个连续表达的O #!基因和一个没有启动子的p q r s 基因[找到了一个有效共生所需要的新基因a p q r s 基因是用来检测在半模拟共生环境下不同的靶基因的表达水平N 而O #!的作用是确定微生物在共生体系中的位置a 这个方法可以通过基因突变株在植物共生体系中的位置来确定有关共生的重要基因>也可以推广用于研究其它植物微生物共生体系a g _t 荧光染色计算菌数
A 7/.70"
:提出了一种简便h 快速计量活菌u 死菌的方法c b d
a 他用两种染料对样品染色a 一种是
;v C w W >分子量约为U V T %的绿色染料>它可以进入活的或死的细胞中N 另一种是!*741’1/8D 7’1’+
>分子量约为‘‘]T %
的红色染料>它只进入死的细胞a 活菌率即为M 活菌ex
绿色细胞记数
Y
绿色细胞记数y 红色细胞记数[zU V V e g _{荧光定位杂交荧光定位杂交主要是用于研究原核生物>它可以直接鉴定以及定量分析样品中的特定的微生物或者
W
]W \期张洪勋等M 微生物生态学研究方法进展
万方数据
是分类群!该方法中"整个细胞是被固定的!它的#$%或者&’%()*+与荧光标记的特异性寡核苷酸探针杂交!再由扫描共焦激光显微镜,%-.//0/1-2/32-.44.56(70-(25-289"%:;<=观察固定的细胞!由于杂交的是整个细胞"省去了提取>*+"?:)扩增以及克隆等步骤!@.44和?.(A B 6最早描述了荧光定位杂交技
术C D E !这项技术最早应用是放射性的互补序列作探针对>*+靶序列进行研究!后来<.//0/1等人首次将
非放射性的定位杂交技术应用于细胞遗传学的研究C F E
!而荧光定位杂交,34B 2(65-6/-60/G 50H B
I 9J (0A 0K .H 02/"L M %N =
"就像*2(H I 6(/O %2B H I 6(/印记一样"是基于两个寡核敢酸通过互补序列配对!但是对L M %N 来说"靶序列是留在组织中而没有必要要象*2(H I 6(/O %2B H I 6(/技术一样在杂交之前首先要分离核
酸C #P E !N Q R Q R 8I 233等人在研究海洋微小浮游生物的时候应用L M %N 技术来确定群落的丰度C ##E
!)B 55644
:2//.449等人应用时段荧光显微技术,S 076G (6524T 6A34B 2(65-6/-670-(25-289"S )L <=
检测环境微生物样品"解决了藻类以及矿务颗粒的自荧光对免疫荧光以及L M %N 的干扰C #&E
!
L M %N 技术的应用受到环境样品微生物的生理状态的影响"
芽孢O 放线菌及休眠时期的细胞的细胞膜的通透性低"影响群落中部分种属丰度的错误估计!而且"L M %N 由于事先要根据已知种属设计探针"
不能检测出环境样品中的未知种属C #’E
!
U 基于V W X 的研究方法U Y Z ?:)G )L ;?方法
限制性内切核酸酶"又称限制酶,)65H (0-H 02/6/A 2/B -46.56="特异的结合于一段>*+的识别序列或其
附近的特异位点上"并在此切割双链>*+C #[E
!因此"特定的限制性酶谱图可以对群落中的微生物加以区分!?:)G )L ;?,?:)G (65H (0-H 02/3(.176/H 46/1H I824972(8I 0575=法是将?:)引物中的一条加以荧光标记"反应后用合适的限制酶切O 电泳分析"再根据片断的大小不同以及标记片断种类和数量的不同分析群
落的结构及组成多样性C #\E !现在很多研究人员利用#$%()*+来研究土壤微生物的多样性
C #$]#F E !该技术还可以用来监测因环境改变而引起的微生物种群的变化!耕作过的土壤中的微生物种群结构的变化越来越
多的引起人们的重视">Q N Q ^B -_469C &P E 等人提取土壤中微生物的)*+"通过标记过的不同引物扩增"确定#$%()*+的丰度!同时可以根据?:)扩增的#$%(>*+的荧光标记末端多形态限制性片断,34B 2(65-6/H 49
H .116AH 6(70/.4(65H (0-H 02/3(.176/H 46/1H I824972(8I 0575"S G )L ;?=来判断微生物群落的生态状况!U Y U ?:)G %%:?方法?:)G 单链构象多态性研究,50/1465H (./A-2/32(7.H 02/.4824972(8I 057"?:)G %%:?
=方法本来是用于临床鉴定基因突变"近年来被应用到微生物生态学的研究C &#]&’E
!单链>*+片段呈复杂的空间折叠构象"这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的!当有一个碱基发生改变时"会或多或少地影响其空间构象"使构象发生改变!空间构象有差异的单链>*+分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻
大小不同!因此"通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,?+@‘="可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开!%%:?技术刚建立时是将同位素掺入?:)扩增物中"通过放射自显影来显示结果!这给该技术的推广造成一定的困难!随着>*+银染方法与?:)G %%:?结合"尤其是直接溴化乙锭染色方法的应用"使得该方法大大简化!由于)*+有着更精细的二级和三级构象"这些构象对单个碱基的突变很敏感"而且)*+不易结合成双链"可以较大量的进行电泳"有利于用溴化乙锭染色"一部分研究人员转而利用)*+来研究!但该方法增加了一个反转录过程"还需要一个较长的引物"内含有启动)*+聚合酶的启动序列"从而相对地增加了该方法的难度!%%:?方法包括\个步骤a b 提取样品基因组>*+c d 用真细菌通用的扩增#$%(>*+的引物,\e G +@+@S S S @+S ::S @@:S :+@G ’e 和\e G S S +::@:@@:,S f @=@:S @@:+:G ’e "相应于#$%(>*+序列的D 到&g 和\’’到\#\=扩增#$%(>*+c h 将扩增后的产物变性"形成单链的>*+c i 用聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同的片断分离c j 回收>*+"测定不同条带的序列"同基因文库的#$%(>*+序列比较"确定微生物的种属!L (./_%-I k 0616(等人通过对根系微生物的分析表明?:)G %%:?可以很好
的分析微生物群落的动态变化"并应用此方法研究了种植对土壤微生物群落的影响C &[E !%.J 0/6?6H 6(5
等人用该法研究群落的演替和菌种的多样性"并同传统的培养方法比较指出?:)G %%:?方法避免了传统培养的费时费力以及误差大的干扰"适合对微生物群落结构和演替的分析C &\E !
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F F 生态学报
&’卷
万方数据
!"#$%&’())*方法
同$%&’++%$法一样,$%&’变性梯度凝胶电泳,-$%&’(./01234/5)3064./1).7*7.8139:;93.<4<,$%&’())*=或$%&’温度梯度凝胶电泳-$%&’>.?:.30123.)3064./1).7*7.8139:;93.<4<,$%&’>))*
=一开始也是在医学上用来检测基因突变,后来被广泛应用于微生物生态的研究@同样大小的(A B 序列由于含有的碱基不同,各片断的>?也就不同@甚至一个碱基对的不同,都会引起>?很大的差异@(
))*或>))*就是应用这种差异来区分不同的基因序列@这种电泳方法在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺-())*=,从正极到负极梯度递加-浓度可随试验要求改变=,或是形成温度梯度->))*=@电泳中的(A B 到达它的变
性甲酰胺浓度或温度时,双链部分解开,造成泳动速度发生变化,从而达到分离效果@而且染色后的凝胶用成像系统分析,还可以半定量地测定样品(A B 浓度的大小,反映微生物群落组成的变化@该方法扩增环境样品的C D +3&A B 的部分基因序列-C E E FG E E H :=,通过())*或>))*分离,收集不同条带的(A B 测序,再同基因文库中的现有序列比较,即可确定微生物的种类@该方法的要点在于$%&引物的选择@由于扩增的环境样品成分复杂,所以研究人员都选择了核糖体小亚基的(A B 的保守序列作为引物@由于电泳的限制,被分析的片断不能大于G E E H :@为了便于电泳的分析,提高分辨率,引物的I J 端有一个G E H :左右的发夹结构,提高了引物合成的成本@
K 280898974/等人用$%&’())*方法监测了意大利香肠的自然发酵过程中微生物群落结构的变化@通过对不同引物的比较,确定了$C L $
M 这对引物@他们的试验打破了研究传统发酵中由于不能被培养微生物无法分离而导致的阻滞不前的状况N M D O @P ./ -R S T U V W S T X Y Y Z [=L 微球菌-\]^X V T V T T Z [=L 明串珠菌-R ]Z T V _V [U V T =以及魏斯氏菌-‘][[]Y Y S =@他们选用的引物为708C L 708M )%,试验表明,这对引物可以很好的分离不同的(A B 片断@ 该法提供了检测肠道微生物菌群状态以及演替的简便L 快捷又可靠的方法N M a O @K b (b &0 选取了不同的引物@结果表明,该法对亦可以用于研究环境中的原生动物的群落结构和多样性N M d O @基于$%&的方法有很多,以上例举的几种是现代微生物生态学常用的方法@他们的共同点是首先提取环境样品的核酸,然后用合适的引物扩增@环境样品的核酸提取效率迄今仍是研究是重点之一,这在土壤微生物生态中尤其重要@很多工作者都将研究重点放在提高核酸的提取效率上@最初采用的方法主要是 剧烈的机械打碎以及超声波破碎细胞N M e ,f E O @但是这种方法得到的(A B 片断一般在I c FC E c 大小, 不适合作微生物的群落分析N f C O @微生物细胞与环境中的土壤颗粒L 粘土以及有机物接合紧密,这对高效率提取核酸造成了很大的困难@同时,腐植酸对(A B 的检测和定量也有很大的影响,主要表现在抑制(A B 高温聚 合酶的活性N f M ,f f O ,干扰限制酶的位点识别N f G O ,降低转化效率N f I O 以及(A B 杂交的特异性N f D O @由于腐植酸难以去除,(A B 样品的纯化也成为研究的重点之一@P 4g ;9/5h ;92等人研究了各种提取方法,他们将土壤样品(A B 提取分为细胞裂解粗提(A B 和纯化两个步骤, 并将几种方法进行比较,建立了一种对大多数土壤样品简单L 快速L 高效的基于+(+的提取方法N f a O @很多实验表明, 现在能够从土壤样品中提取出超过e E i 的3(A B N f d O @ 基于$%&技术的方法解决了由于j A k %状态而导致大部分环境微生物不能被鉴定出来的状况,各个方法已经建立了比较成熟的技术@几种方法的应用大大推进了微生物生态学的研究,是当今该领域应用最 为广泛的方法@但是它们也存在着共同的不足l m 环境样品在提取核酸前的厌氧或室温存放不可避免的导致其样品中微生物的变化,冷冻可以减缓变化,但是不能存放时间过长,真菌在E FG 摄氏度仍可以观察到 明显的生长现象N f e O @n 每次提取(A B 的效率不同, 造成结果重复性差N G E O @o 某些原核生物细胞比其他细胞容易裂解,引起裂解程度不均一,使得不易裂解的细胞的丰度估计过低N f e O @p 引物对不同样品的扩增效率不同,引起丰度估计偏差N G C ,G M O @q 理论上, 对真核生物的分析应该象原核生物一样进行,但是由于真核生物的核糖体的编码基因以及调节机制比较复杂,对其的研究还不够透彻,现今应用在真核微生物生态学的 分析上还是比较少N G f O @ #r s t u 谱图分析 C e e I 期张洪勋等l 微生物生态学研究方法进展 万方数据 磷脂脂肪酸!"#$%"#$&’"’()*++,*-’(./0123谱图分析4脂肪酸!1*++,*-’(.5123谱图以及甲基脂肪酸酯!)*++,*-’(67+#,&7%+78.12593谱图分析在群落动态分析上的应用也是十分广泛:磷脂是构成生物细胞膜的主要组分.约占细胞干重的;<.!07-#7=*&’785/>?@@0’"’(%’A B *-+78’*&+*C $A $6,D *+*C $A $6’%+E %=’7F G H 8’+’-I 7=5’-8$B ’$&;J >K ?LM >K 3在细胞死亡时.细胞膜很快被降解.磷脂脂肪酸被迅速的代谢掉.因此它只在活细胞中存在.十分适合于微生物群落的动态监测:另一个重要因素是脂肪酸具有属的特异性.特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生物分类的依据:磷脂脂肪酸谱图分析法首先将磷脂脂肪 酸部分用N &’O #和P ,78法提取出来Q R R S .然后用气象色谱分析.得出/012谱图:群落的微生物结构发生变 化.即可以通过谱图的变化得到快速有效的监测:甲基脂肪酸酯是细胞膜磷脂水解产物.该法是利用5T P T 系统!一种气相色谱分析系统3分析出全细胞的1259谱图:U G H G V’&W ’A %$A 等人用/012谱图法找出了微生物群落结构与树木根系的关系Q R ;S :P G 9G 0*A O F $8+#,等人利用/012谱图.分析了多环芳香碳水化合物!/$&,-,-&’-*8$6*+’-#,(8$-*8B $A %/2X 3在环境中的微生物降解Q R Y S :U #78’(*AZ ’((X **-W 等人通过试验 验证了1259谱图法分析土壤微生物群落的可行性. 还同时进行了生物量4分类结构的试验.结果表明1259谱图法能够检测出土壤微生物群落细微变化. 为人们提供了一个检测土壤微生物群落的常规方法Q R @S :2G [G V78W 78.9G I G X *&&等人利用512谱图分析法来估计生物方法处理废水时固体颗粒的微生物 群落的生态结构:他们从固体颗粒提取脂肪部分.用毛细管气象色谱仪分析脂肪酸包含的酯类.得出微生 物生物量及其细微群落结构Q R \S : /012方法适合跟踪研究微生物群落的动态变化.能够快速有效的从环境样品种提取大部分脂肪酸.但是也有其局限性:第一.他不能从种的水品上鉴定微生物.只能鉴定到属]第二.这种方法强烈的依赖于标记脂肪酸.标记脂肪酸变化导致错误的群落变化估计.因此操作过程需要十分谨慎.防止人为因素的干 扰:第三.细菌和真菌在不同的生长时期以及环境压力下的脂肪酸含量有所变化.给监测带来困难Q R ^S : _其他分析方法 [*8&*A (和5’&&% 提出了一种研究异养微生物群落代谢多样性的方法‘‘N ’$&$O6’-8$"&*+7%Q R ?.;K S :这种方法是基于微生物群落对?;种不同碳源的利用度来描述群落中微生物动态变化:微平板中有氧化还原 指示剂和?;种不同的碳源.加入样品后.由于样品对每种碳源的呼吸能力不同.导致的氧化剂颜色变化不同.用分析系统分析结果.就可以得出群落代谢的变化情况:这样.这种碳源利用度的信息就可以用来研究不同环境条件引起的微生物群落的变化: 2G a G /*&$6*87% 等人建立了一个和真核生物荧光素酶基因耦合的热调系统分析质粒转移Q ;>S :他们将b c d 4b c d e f 基因与g 噬菌体右启动子g h i 融合.在温度敏感抑制子d b \;@的控制下表达:微生物适应新环境以及新的环境选择压力的能力很大程度上是通过基因的水平传播来改变的.这是远远多于微生物由于点突变的积累而形成的基因功能的改变从而适应环境的情况:现在人们越来越多关注致病菌的对抗生素抗性.而这种情况的产生和一些基因改造过的微生物被释放到环境中有很大的关系:在对微生物进行基因改造的时候.经常用抗生素法来筛选目的菌株.这样就将很多抗抗生素的基因传播到环境中:2G a G /*&$6*87% 建立的系统成功的避免了抗生素筛选转化结合子带来的环境微生物生态的变化:j 组合应用 以上几种方法是近几年来常用的微生物生态学研究的方法:在解决实际问题的过程中.往往不拘泥于一种方法:k G I $%%等人收集了地下水中的微生物.让它们在陶瓷表面形成生物膜.并分别分析地下水中的微生物群落以及生物膜的微生物群落:他们采用U U H /方法和N ’$&$O6’-8$"&*+7% 法研究它们的遗传多样性和代谢多样性Q ;M S :2G 5*8WT B 7W F 7等人研究薰剂对土壤微生物的影响时同时采用了/H I D P [[9法和 /012谱图法Q ^@S :各种方法组合应用. 避免了由于方法原理本身所带来的不可避免的偏差.提供了更加全面的群落组成4 变化方面的信息.必将成为今后研究的有力工具:l 总结 一系列现代生物化学以及分子生物学技术应用于微生物生态学研究.大大加速了该学科的发展速度:综上所述.可知微生物生态学向纵深发展过程中方法学的重要性:可以预见.新的研究方法的灵活运用.必 M ??生态学报 M ^卷 万方数据 将为这门学科带来繁荣的未来!"#$#%#&’#( )*+,-./01234-5670829:;<=>?@ :+J J K :*L ,98.6MN O :N 7I P H G 2Q .F R 568..8S 0/5P R P 5/P 5H G )T 8.S 8I P P 0/2T 8.U 1I R P :V Q R T :W ?=:X Y Z Y ;<=>?@ :4+J [K 4\])+^+K : *_,‘R 0//-a 4b G 2c 5Sd 4V 671I 5F I 8e f :g 7Q 1.S I /I H 5652I /H 5F 560H 5./0/25/P 5H G2I H I 6H 5./.F 5/25h 52G 01R 568.U 501 6I 11P c 5H 7.G H 6G 1H 5h 0H 5./:;<=>?@ :4+J J k 4l m n +o )+p _^+q J :*p ,r 15h I 8sO :g 8.U 1I R P5/2I H I 6H 5/S2.8R 0/H n t 9u v o 6I 11P0/2H 7I8.1I.F O u ‘I 1I R I /H P5/H 75P8I P T ./P I :a / )s 0/P P ./s e 4h 0/w 1P 0P s O 49051I Q 3s 3s I 2P :x >A =y 4!I .8S I H .c /4N "4L ###:*k ,b .c 2I 834r 15h I 8sO :N 7IG P I.F R .25F 5I 2! $g 0P08I T .8H I 8F .8R I H 0U .15606H 5h 5H Q5/%}Y &|?~?Z A }’&z <|A :;<=>?@:C =?B :4L ##+4\])_+#^_+_:*q ,"5v 4O 585(!4f .F M I /P s 4Y z A B :)P I .F 2G 01R 08M I 8H 80/P T .P ./P H .52I /H 5F Q/I c P Q R U 5.P 5P S I /I P 5/i *<+?@<&~: ;<=>?@:C =?B :4L ##+4\])_L k ^__L :*K ,9.G 1.Pb 4g 8I 5,h .P H 34908U I 0G94Y z A B :b 5h I -2I 0290615S 7H )‘T T 1560H 5./.F 0/I c 80T 52P H 05/5/SR I H 7.2F .8 258I 6H I /G R I 80H 5./.F h 50U 1I 0/2H .H 01U 06H I 8505/285/M 5/Sc 0H I 8:;<=>?@ 4+J J J 4./)K K ^[q :*[,!011s !4g 082G I3b :$.8R 0H 5./.F -u ‘{O u ‘7Q U 852R .1I 6G 1I P5/6Q H .S I /I H 5601T 8I T 080H 5./P :%>?=:0A z B :1=A |:W =<:2W 14 +J q J 43.)_K [^_[_:*J ,30//5/Ss w 4f I 8P 7I Qu O 498..M I 8N -4Y z A B :‘/I c R I H 7.2.F 5/P 5H G7Q U 852540H 5./:5*>?~?}?~A :+J K k 4l .)+ #K ^++K :*+#,u 0H 7s 4s .7/P ./e b‘8I h 5I c.F F 1G .8I P 6I /6I :6 4L ###4/l )k p ^K [:*++,)T 7.F F f )4$I 1P M I ‘4$I 78d 4Y z A B :N 7I R 568.U 50125h I 8P 5H Q5/T 56.T 10/M H ./I /8567R I /H 6G 1H G 8I P )0R .1I 6G 108 P 68I I /5/S.F R 085/I 5P .10H I P :8C ;W;<=>?@ 4L ##+4.l )L p J ^L k [:*+L ,v .//011Q-4t I 01O 4g 5T Is :f 5S 78I P .1G H 5./2I H I 6H 5./.F F G .8I P 6I /H 1Q10U I 1I 2R 568..8S 0/5P R P5/I /h 58./R I /H 01 P 0R T 1I P G P 5/SH 5R I {8I P .1h I 2F 1G .8I P 6I /6I R 568.P 6.T Q :8C ;W;<=>?@ 4L ##L4\])L _J ^L p k :*+_,$I 1P M I ‘4‘M M I 8R 0/P ‘O b :g 8.R 5/I /H.66G 88I /6I.F85U .P .R I P F 8.R 0/G /6G 1H G 8I 2U 06H I 85G R .FH 7I t I 88G 6.R 568.U 501I P 61G P H I 85/S 80P P 10/2P .51P :b I H H :1’’B :;<=>?@ :4+J J [493)L +J ^L L _:*+p ,V 0R U 8..Ms 4$85H P 67w $430/50H 5P N :;?B Y =&B A >=B ?Z :4+J J q 439)L L L [^L L _k :*+q ,9.8/I R 0/s 4V M 8.67g d 4r