细胞的培养-传代-计数-冻存-复苏
一、细胞复苏
（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液放在37℃水浴锅中预热备用。
（2）快速从液氮罐中取出细胞冻存管，即刻放入37℃水浴锅中解冻，1000r/min 离心5分钟。
（3）吸取弃去上清液，在冻存管中加入培养基混悬细胞，移液器转移至细胞培养皿中，反复两次用培养液清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。
（4）加入足量的培养液，放在CO
培养箱中细胞培养，第二天换液。
2
二、细胞冻存
（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液，DMSO放在37℃水浴锅中预热备用。
生长状态良好的细胞铺满培养瓶底的约80%时，换液后 12～24h 换液培养。吸去培养液，D-Hanks溶液冲洗瓶底一次再吸弃。加入 0.25％胰酶到培养瓶，覆盖瓶底，来回转动培养瓶，观察等待细胞消化至多数细胞形状变圆或从瓶底脱落下来。
（2）加入 5ml 含血清的培养液中止消化。反复吸取瓶内培养液吹打细胞，形成细胞悬液。进行细胞计数，细胞悬液移植15ml离心管中，3500r/min 离心 5 min。（3）静置吸弃上清液，然后加入冻存液（73% DMEM 培养液，20％FBS，最后添加 7％DMSO 二甲基亚砜），细胞计数达到2×106/ml 以上。细胞混匀后加入冻存管中，每管 1ml。注明细胞种类、代数、冻存时间、名字，检查密封性。降温程序：冷冻管置于4℃ 10 分钟→-80℃ 16～18 小时（或隔夜）→液氮槽（-196℃）长期储存。
三、细胞传代
（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液放在37℃水浴锅中预热备用。当细胞长满培养瓶底的约80%时，吸弃原先的培养液。
（2）加D-Hanks溶液洗涤一次瓶底，吸弃。加入 0.25％胰酶到培养瓶，覆盖瓶底，来回转动培养瓶，观察等待细胞消化至多数细胞形状变圆或从瓶底脱落下来。（3）加入 5ml 含血清的培养液中止消化。反复吸取瓶内培养液吹打细胞，形成细胞悬液。进行细胞计数，根据实验需要将适量单细胞悬液转至培养瓶或孔板中。
的培养箱内继续培养。第二天观察贴壁生长情况。
（4）置37℃、5% CO
2
（5）将细胞按1×106 /mL接种于培养皿，培养脐静脉内皮细胞时加入含10%胎牛血清的M199培养基，内含谷氨酰胺10 g/L、维生素C 10 g/L和双抗100 U/mL。常规培养，2-3天换一次液，显微镜下观察细胞形态、生长状况等。
通常情况下，HUVECs在培养2至3天后可传代，传代时可根据细胞计数结果来确定传代比例。本次实验用到的HUVECs均在第2代和第5代之间，未超过5代。因为细胞传代次数太多后会影响细胞的形态及功能，将不利于进行细胞实验。同时，如果在传代过程中，培养的细胞太多时，可将多余细胞置于液氮中进行长期冻存，为后续实验备存足够细胞。
四、细胞计数
实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定
体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
细胞计数
（1）先用巴氏管将细胞悬液混匀
（2）将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。用枪吸取54ul细胞悬液放在一片塑料纸上。（3）再吸取6ul 台盼蓝染色液混入吸出的细胞悬液中。
（4）用枪头混匀混合液
（5）准备好细胞计数板，酒精棉球擦拭一遍。吸10ul 细胞悬液沿盖玻片吹入，冲入池中，注意不要冲到两边的沟里。
（6）用20倍的显微镜计数，计数原则数上不数下，数左不数右。（7）稀释倍数计算60/54=1.1
（8）计数公式=（4个大方格细胞总数/4）×104 ×稀释倍数（1.1）=个/ml
（9）说明：公式中除以4，因为计数了4个大格的细胞数。公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）
×1.0mm（宽）×0.1mm（高）=0.1mm3而1ml=1000mm3
（10）注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液）
细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏
细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。
细胞的冻存和复苏
背景知识： 细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜(DMSO)作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 细胞冻存 操作步骤： 1. 配制含6-10%DMSO的10%小牛血清的冻存培养液，冰上预冷； 2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管； 3. 离心500rpm，5min； 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，由慢至快，滴入配制好的冻存培养液，用吸管轻柔吹打使细胞均匀（在冰上进行）；一般一个小方瓶冻一支或者一个10cm培养皿冻2支。 5. 将细胞分装入冻存管中，每管1ml（若冻存多于1支，则每支要均匀分装）； 6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者； 7. 冻存：放入装有异丙醇的程序降温盒中，-70℃冰箱中放3天左右，取出冻存管，移入液氮容器内。 注意事项： 1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液； 2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
细胞冻存和复苏
细胞冻存和复苏 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。 冻存和复苏的原则 冻存细胞的理论基础 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 细胞冻存方法 预先配制冻存液：20%血清培养基 10%DMSO （二甲基亚砜） 取对数生长期细胞1ml于冻存管中，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1×106—5×106细胞/ml)，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。 慢冻程序 标准程序（放哪里？） 当温度在-25 ℃以上时，1-2 ℃/min
当温度达-25 ℃以下时，5-10℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中 简易程序 将冻存管于4℃放置1小时，于-20℃放置1小时，通过线绳将装有冷冻管的纱布袋固定于液氮罐罐口（-70℃），放置1小时，后直接投入液氮中（-196℃） 细胞复苏方法 从液氮中取出冻存管，迅速投入37℃水浴中，使其融化（1分钟左右）注意防护（冻存管爆炸）！ 5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上 低速离心10分钟 去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞 低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 注意事项：
RD细胞复苏、传代、冻存
RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞培养操作 1）复苏细胞：将含有1mL 细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL 培养基混合均匀。在1000RPM 条件下离心4 分钟，弃去上清液，加1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm 皿中，加入约8ml 培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。 2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。 1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS 润洗细胞1-2 次。 2. 加1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。 3. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM 条件下离心4 min，弃去上清液，补加1-2mL 培养液后吹匀。 4. 将细胞悬液按1：2 比例分到新的含8ml 培养基的新皿中或者瓶中。 3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25 瓶为类； 1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入1ml 胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。加1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml 细胞悬液，注意冻存管做好标识。 3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80℃冰箱，2h以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
细胞冻存方法
细胞冻存方法 一、概述 目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。 二、主要冷冻设备和材料 常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有35L3和50L3两种。使用时要注意以下几点：（1）一般两周需充液氮一次，至少一个月充氮一次。液氮温度达-196℃，使用时注意勿让液氮溅到皮肤上，以免引起冻伤。 （2）液氮容器为双层结构，中间为真空层，瓶口有双层焊接处，应防止焊接部裂开。（3）在装入液氮时，要注意缓慢小心，并用厚纸卷筒或特制漏斗作引导，使液氮直达瓶底，如有专用液氮灌注装置则更好。若为初次使用，加液氮时更要缓慢，以免温度骤降而使容器损坏。 细胞冻存时常备的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%～20%的血清培养液，DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121°C蒸气高压消毒)，2mL安瓿（或专用细胞冻存管）、吸管、离心管、喷灯、纱布袋（或冻存管架）等。 三、细胞冻存方法 主要操作步骤为： （1）选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。 （2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/mL之间。（3）将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5mL在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。 （4）将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，再移至冰箱冷冻室内3～4小时（此步可省略），再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最后沉入液氮中。 细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一只安瓿细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。
细胞培养基础知识详解-细胞的复苏、传代和冻存
细胞培养基础知识详解 细胞的复苏、传代和冻存实验操作指导 整理：江耀伦李美娣 1 细胞复苏 细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 1.1实验前准备 （1）将水浴锅预热至37℃ （2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的生物安全柜内部台面。 （3）在生物安全柜中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。 1.2 细胞复苏培养 （1）根据细胞冻存记录取出需要复苏的细胞。 （2）迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。 （3）约1-2 min后冻存管内液体完全溶解，取出放入离心机中以1000 rpm/min速度离心3~5 min。 （4）用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入生物安全柜内。吸弃上清液，向离心管内加入1 mL培养液，吹打制成细胞悬液。 （5）将细胞悬液分装入培养瓶或者培养皿内，将培养瓶/培养皿放入37℃，5％ CO2的培养箱内过夜后换液继续培养，换液的时间由细胞情况而定。 1.3 初学者易犯错误 （1）水浴锅未预热或者未预热到37℃。 （2）水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。 （3）离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。 （4）一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。 1.4 细胞传代 1.4.1 传代前准备 （1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶
子放入37℃水浴锅内预热。 （2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的生物安全柜内台面和双手。 （3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 1.4.2 细胞传代 （1）取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入生物安全柜内。 （2）从培养箱内取出细胞：注意培养瓶取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 （3）将培养瓶放入生物安全柜后打开瓶口，同时用酒精棉擦拭瓶口消毒。 （4）加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。 （5）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 （6）弃去胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液终止反应。小心吹打成细胞悬液。 （7）将细胞悬液吸入10 mL离心管中。平衡后将离心管放入离心机中，以1000 rpm/min离心5 min。 （8）弃去上清液，加入适当体积的培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 （9）将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 （10）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/mL。最后要做好标记。 （11）继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养，传代细胞2-4 h后开始贴附在瓶壁上。 1.4.3 注意事项 （1）严格的无菌操作 （2）适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，
细胞冻存的方法与步骤
细胞冻存的方法与步骤文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）
细胞冻存、解冻方法与细胞计数 江苏大学附属医院风湿科李晶??????〖〗 一、细胞冷冻保存 1.材料： 生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(SigmaD-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4％（w/v）trypanblue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII) 2、冷冻保存方法： （1）传统方法:冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。 -20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 （2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。 3、步骤： （1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。 （2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。 （3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。
细胞冻存和复苏实验
实验步骤一、材料准备 1. 仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。 2. 玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、培养瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、废液缸。 3. 塑料器皿：吸头、枪头、胶塞、移液管（10ml）、15ml离心管、冻存管（1～2ml）。 4. 其他物品：微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。 5. 试剂：D-Hanks液、小牛血清、培养液、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油。 二、细胞冻存 1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液。 2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中。 3. 离心1 000 rpm，5 min。 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml。 5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml。 6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。 7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。 三、细胞复苏 1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。 2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀。 3. 离心，1 000 rpm，5 min。
细胞复苏、传代、冻存过程
一、细胞培养（复苏、换液、传代、冻存）（已正） 进行细胞培养前，将所用物品放入超净台中，打开紫外开关，照射20-30分钟。紫外结束后，打开鼓风，使超净台自净5-10分钟左右后开始操作。 1.细胞培养液的配制： 配制50ml培养液(45ml基础培养液+5ml的胎牛血清+500ul的青霉素/链霉素)（如果基础培养基中自带青/链霉素就无需添加） 2.细胞复苏： 将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解，大约1min。将溶解好的细胞冻存管喷上75%的乙醇消毒后拿到超净台中，用1ml的无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的15ml离心管中，这时向其中缓慢滴加配好的培养液2ml，混匀，1000rpm, 3分钟。然后弃掉上清，加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基，然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。（将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解。1000rpm, 离心3分钟。弃掉上清，然后加入1ml配置好的培养基使沉淀的细胞重悬。此时将其转移到T25瓶内，再加入4ml配好的培养基，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。） 3.细胞换液： 复苏的细胞在37℃ 5%CO2的孵箱内孵育4-6个小时后就应该给细胞换液，去除未贴壁的死细胞（贴壁生长的细胞）。贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去，然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次，每次3-5ml，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS，小心的用1ml无菌的大枪头加入5ml新鲜培养基，喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。悬浮生长的细胞具体过程如下:将培养瓶内的培养液混匀，用1ml无菌的大枪头将培养液小心的转移至15ml 无菌的离心管中，1000rpm,3分钟去上清，加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基，然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。 4.细胞传代： 当细胞生长到80%-90%时，其的生长状态和细胞形态都比较好时，即只要判断细胞处于生长对数期，这时就可以进行细胞传代了。贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去，然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次，每次3-5ml，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS，小心的用1ml无菌的大枪头加入1ml 0.25%胰酶消化，放入孵箱，1-2分钟后取出，在倒置显微镜下观察细胞形态变化，如果观察到细胞开始由长梭形变成圆球形时，喷上75%的乙醇，拿到超净台里，加入2ml培养基终止消化，用1ml无菌的大枪头或无菌的塑料吸管反复吹打，尽
细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项
培养细胞的冷冻保存与复苏 ?概述?冻存过程 ?冷冻保存与复苏的原理?冻存结果 ?冷冻速率?讨论 ?冷冻保存温度?冻存细胞的复苏 ?复温速率?非玻璃化冻存细胞的复 苏 ?冷冻保护剂?主要材料 ?冷冻保存方法?复苏过程 ?非玻璃化冻存方法?结果 ?主要材料?讨论 ?冻存过程?玻璃化冻存细胞的复苏 ?冻存结果?主要材料 ?讨论?复苏过程 ?玻璃化冻存方法?结果 ?主要材料?讨论
? Ｐolge等人(１9４9)发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用,她们仍 然以精子进行研究发现,加入甘油能够大大提高贮存于-７９0C下精子的存活率。接下来的重大进展就是Luyｅｔ(１9５1)与Ｌoveｌock(1953)等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。她们的结论就是,电解质浓度增大就是造成贮存细胞损伤的主要原因。冷冻理论后来得到Ｍerryman(１９5６)、Reｙ(195７)以及Ｓmｉtｈ(1９61)等学者的继续与发展。 １94９年至1９６0年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”,这一时期对生物材料的冷冻保存一般都就是以甘油作为保护剂。Lovｅｌock(１95９)等人发现了一种新的化学保护剂,这就就是人们熟悉的二甲基亚砜(ＤMSＯ)。而且,用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。目前,无论就是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品与设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟与完备。 返回页首 ?冷冻保存与复苏原理 在低于-70０C的超低温条件下,有机体细胞内部的生化反应极其缓慢,甚至终止。水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中,随着温度的降低,细胞内外的水分都会结冰,所形成的冰晶会造成细胞膜与细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中,随着温度的降低,细胞外部的水分会首先结冰,从而使得未结 冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长,
细胞冻存和复苏标准操作规程(SOP)
细胞冻存和复苏标准操作规程(SOP) 背景知识： 细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特*都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。 原理： 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透*，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 主体内容（操作步骤）： 一、材料 （一）仪器 1. 净化工作台 2. 离心机 3. 恒温水浴箱 4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃） 5. 倒置相差显微镜 6. 培养箱 7. 液氮冰箱 （二）玻璃器皿 1. 吸管（弯头、直头） 2. 培养瓶 3. 玻璃瓶（250ml、100ml） 4. 废液缸 （三）塑料器皿 1. 吸头 2. 枪头 3. 胶塞 4. 移液管（10ml） 5. 15ml离心管 6. 冻存管（1～2ml） （四）其他物品 1. 微量加样枪 2. 红血球计数板 3. 记号笔 4. 医用橡皮膏 5. 移液枪 （五）试剂 1. D-Hanks液
2. 小牛血清 3. 培养液 4. 双抗（青霉素、链霉素） 5. 胰蛋白酶（0.08%） 6. 1NHCl 7. 7.4%NaHCO3 8. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油 四、操作步骤 （一）细胞冻存 1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液； 2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、； 3. 离心1000rpm，5min； 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml； 5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml； 6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者； 7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/ min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。（二）细胞复苏 1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。 2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀； 3. 离心，1000rpm，5min； 4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养； 5. 次日更换一次培养液，继续培养。 五、注意事项 1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液； 2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤； 3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。
细胞冻存的方法与步骤
细胞冻存、解冻方法与细胞计数 江苏大学附属医院风湿科李晶〖返回主页〗 一、细胞冷冻保存 1、材料： 生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sｉｇma D-2６５0）、无菌塑料冷冻保存管(Naｌgene 5０0０—00２0)、0、４％（w／ｖ)tryｐan blue(GibcoBＲL1５250-061）、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KＲYＯ10Sｅri ｅsIＩ) 2、冷冻保存方法： （１)传统方法：冷存管置于4℃１0分钟－--＞-20℃3０分钟--－>-80℃１6~18小时（或隔夜)——->液氮槽ｖaｐorphａsｅ长期储存. -20℃不可超过１小时,以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入—80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。 (２）程序降温:利用已设定程序得等速降温机以—１～-3℃／分钟之速度由室温降至（－8０℃以下）-12０℃，再放在液氮槽vａｐｏrphａｓｅ长期储存。适用于悬浮型细胞与hybｒidoｍａ之保存。 ３、步骤： （1）冷冻前2４－4８小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。 （2)配制冷冻保存溶液（使用前配制）：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMＳO）至20％浓度,即制成双倍得冻存液，置于室温下待用。 (3）离心收集培养之细胞，用加血清得培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约０、1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）取与细胞悬液等量得冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管,制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×１0６cｅlls/ｍl，混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中，1~2mｌ/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测.严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。 4、注意事项: （１）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（lｏgphase）且存活率高之状态，约为80~90%致密度。冷冻前检测细胞就是否仍保有其特有性质,例如hｙbrｉdoｍa应在冷冻保存前一至二日测试就是否有抗体之产生。
细胞冻存与复苏-注意事项
方法： 冻存液最好现配：按1：3：6（或1：2：7）配冻存液1份DMSO3份血清和6份培养基(养细胞时用什么培养基冻存时就用什么培养基)。取生长状态量好的细胞进行冻存处理，对于贴壁细胞： 1 吸出旧培养液加PBS冲洗一次 2胰酶消化 3加培养基中止消化，有的细胞是加血清中止 4离心收集细胞，不同细胞离心率不一样（以上仅为贴壁细胞，悬浮细胞收集就用第四部）5吸出离心管上清液，加1ML 的冻存液重悬细胞，移到冻存管，放4度半小时，-20 度两小时，-70度过夜，再放液氮长期保存 悬浮细胞：直接离心收集，PBS洗涤 注意事项： 1.错误的时机： 细胞状态不好（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已经开始凋亡或崩解； 连续培养超过二个月，细胞性状已有改变改变）。
最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内。 1.细胞太少： 冻存时细胞浓度低于1-5×1000,000/ml。（复苏很难成功）。 解决： 离心后调整细胞浓度。（不要重新洗细胞）。 1.盖子不紧： 冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。 解决： 选择原配的管子和盖子（不同牌子/型号的颜色会有差别）。 1.单薄的冻存盒： 放在－80度的冻存盒，壁太薄，细胞在被迅速降温。 解决： 选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。（冻存的原则：缓降！） 1.-80度太久： 放在－80度冰箱的时间超过半年。（冰箱的温度难以恒定:开门/关门，电压不稳等）解决：
尽快转入液氮。 1.液氮不足： 液面不能漫过所有细胞。 解决： 定期测量液氮储备，保证细胞全部浸在液面下。 1.取错细胞： 找不到/拿错冻存管。 解决： 每支冻存管都标上细胞的名称，冻存时间，并记录在册。 二、细胞复苏： 方法： 1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。 2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以 上培养液，混匀； 3.离心，1000rpm，5min； 4.弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶， 37℃培养箱静置培养； 5.次日更换一次培养液，继续培养。
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编
细胞培养程序 材料 A、仪器 1. 净化工作台， 2. 离心机， 3. 恒温水浴箱， 4. 冰箱（4℃） 5. 倒置相差显微镜， 6. CO2培养箱， 7. 振荡混合仪 8. 酶联免疫检测仪，9. 移液枪，10. 电磁力搅拌机，11. 微孔滤器 B、玻璃器皿 1. 吸管， 2. 小烧杯（100ml）， 3. 废液缸， C、塑料器皿 1. 吸头， 2. 枪头， 3. 96孔培养板， 4. 15ml离心管， 5. 50ml离心管， 6. 胶塞， D、其他物品 1. 微量加样枪， 2. 红血球计数板， F、试剂 1. D-Hanks液， 2. 小牛血清， 3. RPMI1640， 4. 双抗（青霉素、链霉素）， 5. 0.25%胰酶， 6.0.025% EDTA 7. 二甲基亚砜（DMSO）， 8. MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存备用，两周内有效。 一、原代细胞培养或细胞株（系）复苏培养： （一）细胞原代培养 1.贴壁细胞培养法： 1）、组织块培养法 将所取得的组织用含青霉素、链霉素400U/ml和400ug/ml的生理盐水漂洗2此，5分钟/次。取出组织尽可能的取出液滴，置青霉素小瓶中，加两滴小牛血清，用剪刀尽可能将其剪碎，用吸管将其泥状的组织点种在培养瓶壁，倒置于37°、5%CO2条件下30分钟后将培养瓶正置，从培养瓶的一端缓缓加入完全培养液（小
牛血清15%、青霉素、链霉素各100U、100ug/ml），使组织块有培养液与其接触为准，轻轻放置于37°培养。待24小时候补液。 或小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。 其他方法：消化分离法、器官培养略 2.悬浮细胞培养法 对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。 （二）细胞株(系)细胞复苏培养 细胞复苏的主要操作步骤 (1)佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。 (2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。 (3) 然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。 (4)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为106，则稀释10倍使细胞达到105即可。 注意事项 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生
细胞复苏传代冻存过程
一、细胞培养(复苏、换液、传代、冻存)(已正) 进行细胞培养前,将所用物品放入超净台中,打开紫外开关,照射20-3０分钟。紫外结束后,打开鼓风,使超净台自净5-10分钟左右后开始操作。 １、细胞培养液的配制: 配制50mｌ培养液(45mｌ基础培养液＋5ml的胎牛血清+５０0ｕｌ的青霉素/链霉素)(如果基础培养基中自带青/链霉素就无需添加) 2、细胞复苏: 将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴,不停地晃动使其迅速溶解,大约1mｉｎ。将溶解好的细胞冻存管喷上75%的乙醇消毒后拿到超净台中,用1ml的无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的15mｌ离心管中,这时向其中缓慢滴加配好的培养液2ml,混匀,１０00rpm, 3分钟。然后弃掉上清,加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。在T２５的培养瓶中加入4mｌ配好的培养基,然后用１ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T２5瓶内,使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀,从超净台中将Ｔ２５取出,拿到倒置显微镜下观察细胞就是否铺匀,如铺匀了喷上7５%的乙醇,放入３7℃ 5%CO2的孵箱内。(将细胞冻存管从液氮或者－8０℃取出后迅速置于3７℃水浴箱中水浴,不停地晃动使其迅速溶解。1000rpm, 离心３分钟。弃掉上清,然后加入１mｌ配置好的培养基使沉淀的细胞重悬。此时将其转移到T25瓶内,再加入４ml配好的培养基,使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀,从超净台中将T ２5取出,拿到倒置显微镜下观察细胞就是否铺匀,如铺匀了喷上75%的乙醇,放入3７℃5%CO2的孵箱内。) 3、细胞换液: 复苏的细胞在３7℃ 5％CO2的孵箱内孵育4-６个小时后就应该给细胞换液,去除未贴壁的死细胞(贴壁生长的细胞)。贴壁生长的细胞具体过程如下:将原培养基弃去,然后用高压无菌的PBＳ冲洗1-2次,每次3－5ml,最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS,小心的用1ml无菌的大枪头加入５mｌ新鲜培养基,喷上75%的乙醇,放入3７℃5%CＯ２的孵箱内。悬浮生长的细胞具体过程如下:将培养瓶内的培养液混匀,用1ｍｌ无菌的大枪头将培养液小心的转移至１5ml无菌的离心管中,1000rpｍ,3分钟去上清,加入1ｍｌ配制好的培基使沉淀的细胞重悬。在T2５的培养瓶中加入4ｍｌ配好的培养基,然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶 内,使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀,从超净台中将T25取出,拿到倒置显微镜下观察细胞就是否铺匀,如铺匀了喷上75%的乙醇,放入37℃ 5%CO2的孵箱内。 4、细胞传代: 当细胞生长到８0%-90％时,其的生长状态与细胞形态都比较好时,即只要判断细胞处于生长对数期,这时就可以进行细胞传代了。贴壁生长的细胞具体过程如下:将原培养基弃去,然后用高压无菌的PBＳ冲洗１-２次,每次3-５ｍl,最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PＢS,小心的用1ml无菌的大枪头加入1ml 0.25%胰酶消化,放入孵箱,1-2分钟后取出,在倒置显微镜下观察细胞形态变化,如果观察到细胞开始由长梭形变成圆球形时,喷上75％的乙醇,拿到超
细胞复苏与冻存
细胞冻存与复苏 原则：慢冻快融 在超低温的液氮中进行冻存（-196度）。在冻存过程中，随着温度的改变，细胞内部结构讲发生一系列的变化。细胞快速冻存时，将会受到很大的损伤，甚至导致细胞的死亡。温度急速下降时细胞脱水少，还会使细胞内结冰。细胞内冰晶的形成会造成蛋白质和酶的变性，以及细胞器的损伤，并最终导致细胞的死亡。因此，冰冻细胞时，应使温度缓慢下降，从而使细胞内水分渐渐脱出，使细胞内不结冰。由于冰冻细胞体中的冰晶体很小，融化时必须快，以防这些微小晶体转化为较大的冰晶体。因此，细胞的冻存和融化过程要在缓冰速融”下进行。一般冷冻时，在-30度之前药缓慢降温，速度控制在每分钟下降1度，—30度以下可快速冷冻，使温度降至—196度。 冰冻时还要加入5?10 %的甘油或二甲基亚砜作为冷冻保护剂。因为二者分子量小，容易穿透细胞降低细胞内的冰点，并提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冻存，可使细胞内的水分渗出在细胞外形成冰晶，从而避免细胞损伤。 在细胞复苏过程中，必须快速溶解,否则容易造成细胞外溶解的水分进入细胞内重新形成冰晶，造成细胞死亡。 一、细胞复苏 如果冻存前细胞状态好，而且冻存时间长，复苏用的培养液没问题的话，复苏细胞出现问题最可能的原因是解冻时间过长和解冻后没 有及时稀释接种
KEY： 1．冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。 2．细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常（例如产生单株抗体或是其它蛋白质）。 Protocal （以贴壁细胞系tsA201 为例） 1. ?准备材料：37C?40 C水浴，37 C预热培养液，离心管、血球计数盘与盖玻片 2. 细胞实验室进行常规消毒，紫外照射30 min 以上，超净台开启通风10 min。培养液孵温至于37 °C 3. 培养液回温后喷以70 % 酒精并擦拭，移入无菌操作台内。将7-10 ml 左右新鲜培养基移入离心管中，备用。 4. 带上厚手套用镊子将冻存管从液氮保存罐中取出（操作人员 应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害），检查盖子是否旋紧（由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉）。立即放入40 C水浴中，轻摇冷冻管使其在快速全部融化（如果冻存管封闭不严格,在水中出现气泡,那么细胞无法继续使用），以70 % 酒精擦拭冻存管外部，移入无菌操作台内。 5. 将细胞悬液移入已加培养基的离心管中，稍微吹打混匀，低速离心（1000rpm ，4min ）去除上清，加入适量培养液重悬，计数，调整细胞浓
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤 点击次数：3337 发布时间：2011-4-12 细胞的冻存 一、概述 目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。 二、细胞冻存操作步骤： (1)选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。 (2)去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/mL之间。(3)将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5mL在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)。 (4)将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，再移至冰箱冷冻室内3～4小时(此步可省略)，再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最后沉入液氮中。 细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一只安瓿细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。
细胞冻存方法
冷冻保存方法： （1）传统方法：冷存管置于4℃10分钟→ -20℃30分钟→ -80℃16～18小时（或隔夜）→液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 （2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。 3、步骤： （1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。 （2）配制冷冻保存溶液（使用前配制）：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5～10％，混合均匀，置于室温下待用。 （3）依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液（约0.1ml）计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。 4、注意事项： （1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（logphase）且存活率高之状态，约为80–90％致密度。 （2）冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。 （3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色（以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650），以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。 这是我的实验记录，经过实践检验的，成功率很高。 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入1.5ml新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与1ml的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀