海芦笋黄酮类化合物抗氧化活性研究_李仁伟

海芦笋黄酮类化合物抗氧化活性研究

李仁伟1，何键东2，徐青2，吴冬梅

2

（1．浙江北极品水产有限公司，浙江杭州311215；2．浙江海洋学院食品与药学学院，浙江舟山316004）

摘要［目的］为海芦笋的进一步开发利用提供一定的理论依据。［方法］以海芦笋为原料，研究其中的黄酮类化合物抑制植物油脂的自氧化和清除DPPH 自由基、羟自由基、氧自由基的效果，评价海芦笋黄酮类化合物的体外抗氧化活性。［结果］海芦笋黄酮类化合物具

有较强的抑制植物油自氧化、

清除DPPH 自由基、Fenton 反应中产生的羟自由基、邻苯三酚氧化产生的氧自由基的作用，且抑制作用与海芦笋黄酮类化合物的浓度呈正相关。［

结论］海芦笋黄酮类化合物可以作为天然的食品抗氧化剂进行开发。关键词海芦笋；黄酮类化合物；油脂自氧化；自由基；抗氧化中图分类号S188文献标识码A 文章编号0517－6611（2012）28－13989－04Study on Anti-oxidative Activities of Flavones Extract from Sea Asparagus LI Ren-wei et al （Zhejiang North Supreme Seafood Co．Ltd．，Hangzhou ，Zhejiang 311215）

Abstract ［Objective ］To provide references for the development and utilization of sea asparagus．［Method ］Anti-oxidative activity of fla-vones from sea asparagus was investigated by the inhibitions on auto-oxidation of plant oil and the scavenging effects on DPPH radicals ，hy-droxyl radicals （·OH ）and superoxide anion （O 2－

·）．［Result ］The flavones from sea asparagus can remarkably inhibit auto-oxidation

plant oil and had significant scavenging functions to DPPH radical ，hydroxyl free radical and superoxide anion free radical ，and the scavenging effect and content of flavones from sea asparagus are positively correlated．［Conclusion ］The flavones from sea asparagus had the potential to be a natural antioxidant．

Key words Sea asparagus ；Flavones ；Oil auto-oxidation ；Free radical ；Anti-oxidative

作者简介

李仁伟（1964－），男，浙江舟山人，高级工程师，从事水产加

工与管理研究，

E-mail ：LiRW6866@163．com 。收稿日期2012-05-19自由基是指能够独立存在的，含有1个或多个未成对电子的分子或分子的一部分。由于自由基中含有未成对电子，因此大多数自由基都很活泼，具有高度的化学活性。自由基产生过多或清除过慢，

便会通过攻击生命大分子物质及各种细胞，造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病

［1］

。通过适当

补充外源性抗氧化剂，

可有效抑制生物体内的过氧化自由基，阻断由其参与的不良反应。目前，尽管许多人工合成的抗氧化剂如2，6-二叔丁基对甲酚（BHT ）和丁基羟基茴香醚（BHA ）等可以抑制过氧化自由基反应的发生，但随着人们对其潜在危害的不断认识，研究开发安全可靠，且兼有营养作用的天然抗氧化剂倍受关注

［2］

。近年大量研究表明，天然植

物中的黄酮类化合物具有抗炎、

抗菌、抗病毒、抗过敏、抗肿瘤、

降血压、降血脂和保肝等作用，在医学上对治疗冠心病、癌症、脑血栓、消除自由基以及抗衰老等方面有显著效果。笔者课题组的前期研究表明，海芦笋中富含抗氧化活性的黄酮类物质，是一种潜在优良的外源性抗氧化剂原料

［3－4］

。

海芦笋（Sea Asparagus ）为藜科（Chenopodiaceae ）盐角草属（Salico rnia ）的无叶茎肉质化的真盐生植物，耐盐度高（5%NaCl 浓度），多见于盐沼地、盐湖旁及海滩。笔者以海芦笋为原料，

研究其中的黄酮类化合物抑制植物油脂的自氧化和清除自由基的活性，为海芦笋的进一步开发利用提供一定的理论基础。1材料与方法1．1材料

1．1．1

样品。新鲜海芦笋采摘于浙江省舟山市朱家尖滩涂，

由舟山市农业科学研究所引种。将海芦笋洗净置于60?烘箱中干燥，粉碎，制得海芦笋干粉，备用。1．1．2

药品。芦丁标准品（含量≥95．0%）、氢氧化钠、无水

乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、硫代硫酸钠、碘化钾、淀粉、冰醋酸、氯仿、二苯代苦味肼基自由基（DPPH ·）、抗坏血酸（V C ）、邻二氮菲、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、双氧水、邻苯三酚，均为国药集团化学试剂有限公司。1．1．3

仪器。循环水式多用真空泵SHB-ⅢA ，河南省太康

科教器材厂；XH-100A 微波催化合成/萃取仪，北京祥鹄科技发展有限公司；722N 可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；FW100高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司。1．2方法

1．2．1黄酮提取液的制备与黄酮含量的测定。

1．2．1．1

黄酮粗提液的制备。称取一定量海芦笋粉末浸于

60%乙醇溶液中，微波辅助提取（15min ，60?，700W ，1?40g /ml 料液比），真空抽滤除去滤渣，得到海芦笋黄酮类化合物乙醇粗提液。1．2．1．2

标准曲线的制作。精确称取芦丁对照品10mg ，置

100ml 容量瓶中，加60%乙醇溶解，定容，精密吸取0、1、2、3、4、5ml ，分置于10ml 容量瓶中，加5%亚硝酸钠0．3ml ，放置6min ，再加10%硝酸铝0．3ml ，放置6min ，加4%氢氧化钠4ml ，加水至刻度，摇匀，放置15min 。以波长510nm 处测得的吸光度值A ，求得A 对浓度C 的回归方程，并做标准曲线，如图1。1．2．1．3

样品测定。取0．2ml 粗提液，用蒸馏水定容至10

ml ，用其代替芦丁，其余步骤同“1．2．1．2”，在波长510nm 处

测定其吸光度，由回归方程计算样品中黄酮类化合物含量。计算公式如下：

安徽农业科学，Journal of Anhui Agri．Sci．2012，40（28）：13989－13992责任编辑李菲菲责任校对况玲玲

DOI:10.13989/https://www.360docs.net/doc/525390307.html,ki.0517-6611.2012.28.083

图1芦丁浓度吸光度标准曲线

黄酮类化合物的含量（以芦丁计）（%）=C?V?50/m

式中，C，质量浓度（g/L）；V，滤液体积（L）；50，为稀释倍数；m，海芦笋质量（g）。

1．2．1．4过氧化值的测定。GB/T5009．37-2003，食用植物油卫生标准的分析方法。

1．2．2抗氧化试验。

1．2．2．1海芦笋黄酮类化合物对植物油抗氧化的性能［4－5］。称取30g植物油5份置于容器中，1份为空白对照组，3份分别按油重的0．05%、0．10%、0．50%添加海芦笋黄酮粗提液，另1份按油重的0．10%添加抗坏血酸（V C）为对照组。各组均混匀，置于（60?0．5）?的恒温烘箱中，每隔12 h搅拌1次，并交换其在烘箱中的位置。定时取样检测植物油的过氧化值（Peroxide Value，POV），做3次平行样取平均值。

1．2．2．2海芦笋黄酮类化合物对DPPH·的清除能力［6－7］。用60%的乙醇分别配制质量浓度为0．25、0．50、0．75、1．00 mg/ml的海芦笋黄酮化合物溶液。精确吸取各溶液2．0ml 于试管中，加入2?10－4mol/L的DPPH·溶液2．0ml，摇匀，静置30min，在517nm处，分别测定试样的吸光度A i、2．0ml 试样与2．0ml60%乙醇混合液的吸光度A j、2．0ml DPPH·溶液与2．0ml60%乙醇混合液的吸光度A c。每组平行测定3次取平均值，按下式计算样品对DPPH·的清除率：清除率=［1－（A i－A j）/A c］?100%

式中，A i为试样的吸光度；A j为试样与乙醇混合液的吸光度；A

c

为DPPH·溶液与乙醇混合液的吸光度。同法测定抗坏血酸（V C）对DPPH·的清除率。

1．2．2．3海芦笋黄酮类化合物对羟自由基的清除能力［8］。用60%的乙醇分别配制质量浓度为0．25、0．50、1．00、2．00 mg/ml的海芦笋黄酮类化合物溶液。取浓度为0．75mmol/L 邻二氮菲溶液1ml于试管中，依次加入2ml0．2mol/L磷酸缓冲液（pH7．40）、1ml双蒸水，充分混匀后，加入1ml浓度为0．75mmol/L的FeSO4溶液，混匀，加入1ml质量分数为

0．12%的H

2O

2

，37?水浴90min，于536nm处测定吸光度为

A p ，用1ml双蒸水代替1ml H

2

O

2

测定吸光度为A b；用试样

溶液代替1ml的双蒸水测定吸光度为A s，每组平行测定3次取平均值，按下式计算样品对羟基的清除率，用不同浓度V C 溶液代替试样作为对照组。

清除率=（A s－A p）/（A b－A p）?100%

1．2．2．4海芦笋黄酮类化合物对氧自由基的清除能力［9］。用60%的乙醇分别配制质量浓度为0．25、0．50、1．00、2．00 mg/ml的海芦笋黄酮类化合物溶液。取0．05mol/L pH8．2的Tris－HCl缓冲液4．5ml，置于25?水浴中预热20min，分别加入1．0ml试样溶液和0．4ml25mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀后于25?水浴中反应5min，加入8mol/L HCl 1．0ml终止反应，以Tris－HCl缓冲液作参比，在325nm处测定吸光度，计算清除率。空白对照组以1．0ml乙醇溶液代替试样溶液。每组平行测定3次取平均值，按下式计算样品对超氧阴离子自由基的清除率，用不同浓度V C溶液代替试样作为对照组。

清除率（%）=（A1－A2）/A1?100%

式中，A1为空白的平均吸光度，A2为试样的平均吸光度。

2结果与分析

2．1海芦笋黄酮化合物对植物油的抗氧化作用油脂在通常的贮存条件下，由于受到光、热和某些金属等因素的影响，极易发生氧化酸败，特别是自动氧化（auto-oxidation），生成过氧化物和氢过氧化物等中间产物，其氧化酸败的程度可用过氧化值（POV）的数值来反映［10］。海芦笋黄酮类化合物对油脂的抗氧化能力的试验结果见图2

。

图2植物油的抗氧化曲线

试验表明，随贮藏时间的延长，各组植物油的POV值均逐渐增大，但样品组的POV值都低于空白组，这说明海芦笋黄酮化合物和抗坏血酸（V C）都具有明显的抗氧化作用。从图2可见，空白组在60?下保存时，其POV值随时间的变化显示出较陡的趋势，而添加有抗氧化剂的油样，其POV值则变化较为平缓，说明在同样的贮藏条件下，植物油中添加海芦笋黄酮类化合物具有明显的抑制油脂氧化的作用，且抗氧化能力与黄酮的浓度呈正相关。黄酮浓度0．10%时，其抗油脂氧化的能力与0．10%V C相当。

2．2海芦笋黄酮化合物对DPPH自由基清除作用［11］DP-PH·是一种稳定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517nm处有最大吸收。当在DPPH·溶液中加入自由基清除剂后，溶液颜色变浅，吸光度变小，且吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系，故可用于检测DPPH·被清除的程度。

由图3可见，海芦笋黄酮类化合物对DPPH·有较好的清除作用，当黄酮浓度小于0．25mg/ml时，随浓度增加，清

09931安徽农业科学2012年

除作用显著增大；但当黄酮浓度大于0．75mg /ml 后，各试样组清除DPPH ·的能力没有显著性差异（P ＞0．1），各组清除DPPH ·的能力均不如抗坏血酸V C

。

图3

DPPH ·清除曲线

2．3海芦笋黄酮化合物对羟自由基清除作用

［12］

Fenton

反应产生羟自由基：H 2O 2+Fe 2+

→·OH +OH －

+Fe 3+

，体系中的Fe 2+

与邻二氮菲生成红色配合物，在536nm 处有最大吸收值。加入抗氧化剂后，抑制了Fe 2+

的氧化，从而减少了·OH 的产生，并改变了Fe 2+

邻二氮菲的反应程度，引起吸光度变化。

由图4可见，海芦笋黄酮类化合物和抗坏血酸（V C ）对羟自由基都有显著的清除作用，清除能力随海芦笋黄酮浓度的增加而增强，

当海芦笋黄酮化合物质量浓度为1．00mg /ml 时，对羟自由基的清除率可达到89．5%，与浓度为0．4mg /ml V C 溶液的清除能力基本相当

。

图4

羟自由基清除曲线

2．4海芦笋黄酮化合物对氧自由基清除作用

［13］

邻苯三酚

在弱碱性介质中自氧化分解产生O 2－，

利用O 2－

清除剂能使邻苯三酚自氧化产物在325nm 处的吸收峰受到抑制这一特点进行测定，其反应原理如下

：

海芦笋黄酮化合对氧自由基清除的试验结果见图5。由图5可见，海芦笋黄酮类化合物和抗坏血酸（V C ）对氧自由基都有较好的清除作用，随着黄酮浓度的增加，清除作用加强，当海芦笋黄酮化合物质量浓度为1．00mg /ml 时，对氧自由基的清除率可达到95．75%，

0．8mg /ml 的海芦笋黄酮试样与浓度为0．4mg /ml 的V C 溶液的清除能力相当

。

图5氧自由基清除曲线

3结论与讨论

海芦笋黄酮类化合物有明显的抗油脂氧化作用，黄酮浓

度为0．10%时，抗油脂氧化的能力与0．10%的V C 溶液相

当。海芦笋黄酮类化合物对羟自由基和氧自由基有显著的

清除作用，清除能力均与浓度呈正相关，当海芦笋黄酮类化合物浓度为1．00mg /ml 时，对羟自由基和氧自由基的清除率分别达到89．50%和95．75%，与浓度为0．4mg /ml 的V C 溶液的清除能力相当。海芦笋黄酮类化合物对DPPH ·也有较好的清除作用，但不如抗坏血酸V C 。

现代医学研究证明，体内自由基水平与多种疾病密切相关

［14］

，参与了包括骨质疏松症、肌萎缩性侧索硬化症及癌症

等在内的多个病理演变过程［15］

。生物体由于劳损等原因出

现组织局部氧自由基增加［16］

，引起机体内氧自由基代谢平衡系统紊乱，损伤细胞DNA

［17］

，同时氧化应激反应增强，降

低细胞合成RNA 的能力［18］

，影响细胞的生长。已有研究表

明，

自由基对细胞会造成氧化损伤［19］

，引起细胞的异常变

化。在抗氧化酶与内源抗氧化剂的合成量降低的情况下，如果不及时从体外补充外源性抗氧化剂以提高机体抗氧化能力，

人体就会加速衰老、易患疾病。油脂氧化后分解产生的醛、

酮、酸等小分子不仅影响品质，不适宜食用，而且氧化生成的二级氧化产物在人体中很难代谢，有损肝脏功能，氧化产生的聚合物也很难消化吸收，长期积累于体内造成损害。因此，该研究测定了从海芦笋中提取的黄酮类化合物对油脂

氧化的抑制及多种自由基的清除能力。

抗氧化剂能有效阻止或延缓自动氧化过程，被广泛应用于油脂、含油食品等的加工中，目前食品中常用的抗氧化剂有BHA 、

BHT 、TBHQ 等合成抗氧化剂，由于人们不断发现合成抗氧化剂有一定的毒性，甚至致畸致癌［20］

，许多国家已停

止或严格限制使用。

黄酮类化合物广泛地分布于植物中，天然赋予其无毒的特性，具有抑制体内自由基、促进体内抗氧化酶与内源性抗氧化剂合成的作用。不同结构的黄酮化合物对不同体系的抗氧化作用不同，对不同自由基的清除和不同组织的修复作用存在一定的选择性。黄酮类化合物结构中含有酚羟基，有学者提出，酚羟基越多，其抗氧化活性越强

［21］；有报道指出，

黄酮类化合物在清除羟自由基与超氧阴离子自由基时的活性部位和作用机制不完全相同，认为B 环4'-OH 和母核上9-（3）双键是清除氧自由基的主要部位，而B 环邻二羟基则是清除羟自由基的关键功能基团，如果4'-

OH 甲基化后则清除1

993140卷28期李仁伟等海芦笋黄酮类化合物抗氧化活性研究

羟自由基活力下降［22］。该研究结果表明，海芦笋黄酮类化合物具有较强和广谱的抗氧化性能，且海芦笋在沿海滩涂易于大规模种植，种植技术已经成熟，价格便宜。因此，海芦笋作为一种天然的食品抗氧化剂开发前景广阔。

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29931安徽农业科学2012年