金钗石斛菌根_茎和叶内生真菌的分离与鉴定_黎勇
金钗石斛菌根、茎和叶内生真菌的分离与鉴定
黎勇，罗培凤，朱丹丽，齐泽民
*
（内江师范学院生命科学学院，四川内江641000）
摘要［目的］分离鉴定铁皮石斛不同组织内生真菌，以期为提高其组培苗的大田定植成活率提供试验依据。［方法］以改良PDA －抗
生素酸性培养基为基础分离培养基，分别从金钗石斛菌根、茎和叶中分离内生真菌，利用切片法对分离得到的菌株进行纯化，并观察其
菌落形态。［结果］通过菌落形态观察，初步鉴定所纯化的6个内生菌株分别为：NJJG-1，NJJG-2，NJJR-1，NJJR-2，NJJR-3和NJYJ-1。试验结果表明材料表面消毒条件和方法以及分离培养基的选用，均直接影响真菌的分离纯化效果和分离得到的内生菌的多样性，其中以
75%酒精处理30s ，再用0．1%升汞处理7min 的表面消毒效果稳定，再配合改良的PDA －抗生素酸性培养基分离内生菌，可以分离出较
多的内生菌种类。［
结论］该研究结果为铁皮石斛不同组织内生真菌的分离鉴定提供了指导方法，同时为提高其组培苗的大田定植成活率提供了试验依据。
关键词金钗石斛；铁皮石斛；内生真菌中图分类号S188文献标识码A 文章编号0517－6611（2012）23－11598－03Isolation and Identification of Endophytic Fungi in the Root ，Stem and Leaves of Dendrobium nobile Lindl．LI Yong et al （College of Life Sciences ，Neijiang Normal University ，Neijiang ，Sichuan 641000）Abstract ［Objective ］To isolate and identify the endophytic fungi in different tissues of Dendrobium nobile Lindl．，so as to provide experimen-tal basis for its plants survival rate．［Method ］The endophytic fungi was isolated from the root ，stem and leaves of Dendrobium nobile Lindl．on the improved PDA-antiobiotic acidic medium ，and the isolated strains were purified by the slicing method ，and their colony morphology was ob-served．［Result ］Through the observation of colony morphology ，the six endophytic fungi were identified as NJJG-1，NJJG-2，NJJR-1，NJJR-2，NJJR-3，NJYJ-1，respectively．The experimental results indicated that the purification results and diversity of endophytic fungi were directly influ-enced by the surface disinfection conditions and methods of materials and the screening of separating medium．The treatment effect of 75%alcohol
for 30seconds plus 0．1%mercuric chloride for 7minutes was stable ，and more species of endophytic fungi were isolated combined with the im-proved PDA-antiobiotic acidic medium．［Conclusion ］The study provided a guidance for the isolation and identification of endophytic fungi in dif-ferent tissues of Dendrobium nobile Lindl．，and provided experimental basis for the survival rate of its field plants．
Key words Dendrobium nobile Lindl．；Dendrobium Officinale ；Endophytic fungi
基金项目
内江师范学院科研项目（07NJZ －03）资助。
作者简介
黎勇（1968－），男，四川内江人，硕士，副教授，从事微生物
学及应用技术教学科研工作，
E-mail ：dongminjun813@163．com 。*通讯作者，教授，博士后，从事生态学研究，E-mail ：zmin918@sina．com 。
收稿日期2012-03-30金钗石斛Dendrobium nobile Lindl．是兰科多年生草本植物，具有强阴益精、补肾益力、厚肠胃和壮筋骨的作用，是一种药用范围较广的传统名贵中药。现代药理研究证明，金钗石斛具有增强免疫、抗肿瘤、抗辐射、增强体力、扩张血管和保肝等作用
［1］
。
石斛属植物根部的真菌在分布上具有一定的多样性。首先，在同一植株上，不同真菌可分布于根围土壤、根部表面和根内部；有时同一真菌既可分布于根表，又可分布于根内
［2］
。其次，不同产地、不同生境的同一物种也可能拥有不
同的菌根真菌［3］
。石斛属植物的内生真菌不仅分布于植株
的根部，在植株的茎和叶等部位也有分布［4］
。内生真菌对提高植物的营养和抗性等均具有一定的作用，
同时，研究表明许多石斛属植物的内生菌对于铁皮石斛组培苗的培养及其大田驯化有一定的促进作用，故收集不同产地、不同生境的野生植株，对于研究石斛属植物菌根共生真菌的多样性以及石斛属植物组培苗的生产具有重要意义。
四川夹江县歇马乡自文革期间以来一直栽种石斛，已经有数十年历史，主要采用石穴和盆养的方式进行大田种植。现代化的生物技术公司石斛生产中主要以无菌组培菌为主，但其组培苗的大田驯化一直是生产上的难题，尤其对于目前
最为热门的铁皮石斛，该问题尤其突出，故分离、研究金钗石斛内生真菌对于金钗石斛、尤其是铁皮石斛组培苗的大田定植成活具有非常重要的意义。
该试验选取野生金钗石斛的菌根、茎和叶为试验材料，通过分离出金钗石斛不同部位的菌株，并对其进行比较鉴别，
分析野生金钗石斛不同组织部位的内生真菌，以期为提高铁皮石斛组培苗的大田定植成活率提供试验依据。1材料与方法1．1材料
1．1．1
试验材料。试验材料为多年生野生金钗石斛大田植
株，采自四川夹江县歇马乡种植区（以松树皮作为种植介质培育）。1．1．2
试剂及仪器设备。无菌水：蒸馏水灭菌后置于冰箱
中保存备用；表面消毒剂：75%酒精和0．1%升汞。试验所用仪器主要有：烧杯，锥形瓶，玻璃棒，培养皿，滤纸，酒精灯，镊子，
解剖刀，解剖剪，口罩，DNP-9272-1A 电热恒温培养箱，BL-50立式压力蒸汽灭菌器筒，SW-CJ-1CU 双人单面净化工作台以及微波炉等。1．2方法
1．2．1
培养基的配置及准备。分离培养基（即改良PDA-抗
生素酸性培养基）：去皮马铃薯200g ，琼脂20g ，蛋白栋10g ，磷酸氢二钾（K 2HPO 4）1g ，MgSO 4·7H 2O 0．1g ，水1000ml ，0．5g 酒石酸铵以及1ml 微量元素溶液。将制作好PDA-抗生素酸性培养基以及试验过程中所用的相关器械用品在灭菌锅内进行高温高压灭菌，以备使用。1．2．2
内生真菌的分离与培养。主要参照陈玉栋
［5］
以及郭
责任编辑王春艳责任校对况玲玲
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri．Sci．2012，40（23）：11598－11600，11618DOI:10.13989/https://www.360docs.net/doc/575428213.html,ki.0517-6611.2012.23.105
顺星等［6］的关于菌根菌的分离方法，稍作改进，具体过程如下：
分别取健康野生金钗石斛植株菌根、茎和叶，用自来水冲洗干净，晾干水分，转到无菌超净台上进行下一步处理：自根尖取石斛新鲜营养根数条，用蒸馏水洗净，滤纸吸干水分，再用75%酒精处理30s，用无菌水冲洗3次，滤纸吸干，之后，将所有根分为4组，分别用0．1%的升汞溶液处理3、5、7和9min，处理后用无菌水冲洗3次，滤纸吸干水分，此时注意，最后1次洗液备用，用以对照灭菌程度高低。用解剖刀在培养皿中将已灭菌的根切成1cm左右的小段，用镊子将根段置于PDA-抗生素酸性培养基上，每皿2 3个，分布均匀，每个时间梯度接种10套，最后1次洗液各接种10套平板，置于27?恒温培养箱培养。
茎内生真菌的分离与培养操作步骤同菌根，但注意将茎切成0．5cm左右的薄片。
叶内生真菌的分离与培养：取健康的叶，操作步骤同菌根。
各个试验均重复3次，试验中观察平板菌落的形态及成长状况。
1．2．3数据分析。数据统计、分析以3次重复试验为基础，通过软件计算出平均值及其标准差，并绘制表格分析试验结果。
2结果与分析
2．1金钗石斛菌根、茎、叶内生真菌的分离由表1可知，0．1%升汞灭菌不同的时间处理，内生真菌分离和感染杂菌的概率有明显差异，菌根、茎和叶内生真菌的分离结果均表现出以下现象：在0．1%升汞处理3、5和9min的条件下，在接种培养皿内分离真菌较少或少，且均有不同程度的感杂情况，主要为细菌，其次为霉菌，存在真菌－细菌共处一皿的现象；在0．1%升汞处理3和5min情况下，明显可见灭菌不彻底，感杂情况严重；在0．1%升汞处理9min的条件下，灭菌时间足够，但分离情况并不良好，具体原因还有待进一步确定；在0．1%升汞处理7min的条件下，分离出的真菌最多，且感杂的较少。
上述结果充分说明了在灭菌时间较短和过长的情况下，都不利于金钗石斛内生真菌的分离，只有在最佳灭菌时间的条件下，真菌的分离情况才能较为理想，同时也表明菌根、茎和叶对灭菌时间的要求不尽相同以及3个不同组织部位内生真菌的含量不同，菌根与茎的内生真菌较叶所含内生真菌的种类多，且菌根、茎、叶的内生真菌种类也不尽相同。
由于真菌与菌根共生，存在于植株体内部，其他微生物主要存在于外部，因而消毒主要是针对其表面，合理的进行表面消毒处理，是该试验的一个重点，同时也是难点之一。试验结果表明，灭菌时间对灭菌效果有非常大的影响，且灭菌效果的好坏关系到内生真菌分离情况的好坏。
综上所述，不同的消毒时间处理对内生真菌的多样性有显著影响。该试验中采用7min处理得到了较好的分离效果。但采用的0．1%HgCl2与75%乙醇相结合的灭菌方式，还存在很大的问题，因为升汞本身有毒，并不为灭菌的最佳选择。试验中，可能由于菌根、茎、叶对灭菌的要求存在差异，故各自的灭菌效果存在一定差异，关于植株不同取材部位的最佳灭菌要求还有待于更进一步的探究。
表1表面消毒处理的金钗石斛不同组织部位内生真菌菌落形成情况
消毒时
间∥min
菌根内生真菌分离情况
长真菌
皿数∥个
出菌
率∥%
菌株种
类∥株
感染杂
菌情况30．59?0．420．67?0．58较少大部分感染51．89?1．2135．00?11．602轻微感染72．01?1．4638．00?27．103轻微感染90．65?0．720．54?0．47较少极少部分感染
消毒时
间∥min
茎内生真菌分离情况
长真菌
皿数∥个
出菌
率∥%
菌株种
类∥株
感染杂
菌情况30．36?0．580．56?0．56较少大部分感染51．75?1．3232．00?12．583轻微感染71．87?1．2434．00?25．303轻微感染90．63?0．530．57?0．59较少极少部分感染
消毒时
间∥min
叶内生真菌分离情况
长真菌
皿数∥个
出菌
率∥%
菌株种
类∥株
感染杂
菌情况30．27?0．670．42?0．57较少大部分感染51．83?0．6831．00?11．21少轻微感染71．96?0．6233．00?12．303轻微感染90．32?0．450．54?0．69较少极少部分感染
2．2平板菌落形态
2．2．1菌根内生真菌平板菌落形态。从以根为材料的组织块中分离的内生真菌经打孔法纯化后得到2株真菌，分别命名为NJJG-1（图1A、B）和NJJG-2（图1C、D）。
NJJG-1菌落呈晦白色，整个菌落簇拥成团状，菌落边缘整齐，菌丝体粗壮有力，气生菌丝发达，菌丝密集且较短，生长速度慢。
NJJG-2菌落呈纯白色，整个菌落簇拥成团，菌落边缘整齐，菌丝密集纤长，绒毛状生长极慢。
2．2．2茎内生真菌平板菌落形态。茎内分离的真菌表现出较大多样性，经打孔法多次纯化得到3株不同真菌（图2A、B 和C），分别命名为NJJR-1、NJJR-2和NJJR-3。
由图2A可知，NJJR-1菌落呈桃红色，边缘整齐，气生菌丝发达，菌丝短小，整个菌落较小，菌丝分布于中间与外周部，两者之间较少，背部观察呈微黄透明状。
由图2B可知，NJJR-2菌落呈白色，边缘较淡，大量气生菌丝，呈毛状，菌丝较长，中间部分菌丝较外围长且浓，整个菌落菌丝呈族拥状，边缘较整齐，菌丝老化呈淡黄色。
NJJR-3菌落呈白色，大量气生菌丝，绒毛状，中空，菌丝不长，中间部分菌丝单薄，匍匐生长，外围长且浓，整个菌落菌丝分布中间成簇拥状，外围成向外辐射状，边缘较整齐（图2C）。
99511
40卷23期黎勇等金钗石斛菌根、茎和叶内生真菌的分离与鉴定
注：A 和B 为生长7d 的菌株NJJG-1；C 和D 为生长7d 的菌株NJJG-2。图1
纯化得到的2
株菌根内生真菌菌落形态
注：A 、
B 和
C 分别为生长9d 的菌株NJJR-1、NJJR-2和NJJR-3。图2
纯化得到的3株茎内生真菌菌落形态
2．2．3叶内生真菌平板菌落形态。叶内分离得到的真菌比较单一，
仅得1株，暂定名为NJYJ-1（图3A 、B ）。由图3可知，菌株NJYJ-1整个菌落成辐射状，菌落边缘
整齐，
有大量气生菌丝，外围呈白色，菌丝短，毛状，浓密，菌丝匍匐生长，
生长速度快，迅速长满平皿，无爬壁现象
。注：A 为叶组织分离图；B 为生长9d 的NJYJ-1菌株形态。图3
纯化得到的1株叶内生真菌菌落形态
3结论与讨论
该试验中，采用PDA-抗生素酸性培养基分离野生金钗
石斛内生真菌，根据笔者曾利用PDA-抗生素酸性培养基和PDA-抗生素培养基对铁皮石斛内生真菌的分离研究，结果显示PDA-抗生素酸性培养基所分离出的真菌比PDA-抗生素培养基分离的真菌菌种多且长势较好，
故在该试验过程中，笔者采用PDA-抗生素酸性培养基为分离真菌的基础培养基。该试验结果表明所分离得到的菌株生长较好且菌种也较多，
这也说明了培养基的pH 值为酸性可能有利于内生真菌的生长，但其具体的机理仍需要进一步的研究探讨。
该研究中，从野生金钗石斛植株的菌根、茎、叶中均分离出了真菌，其中，从根中得到2个菌株，分别命名为NJJG-
1和NJJG-2，茎与叶中也均分离得到了新的菌种，茎中的3株分别为NJJR-1、NJJR-2和NJJR-3，叶内的1株为NJYJ-1。由菌根、茎和叶中分离出的真菌种类不尽相同且数量不等，通过其菌落形态及显微观察均不能判断为相同菌株。在从叶中分离真菌时，
笔者也曾分别采用老叶与嫩叶为材料，结果显示，
以老叶为材料分离出的真菌比嫩叶分离出的真菌种类少，其原因可能是植株嫩叶部分所含真菌比其老叶要多，但具体情况仍需进一步研究。该试验再次证实石斛属植物的内生真菌在植株的菌根、茎、叶中均有分布［4］
，就金钗石斛而
言，茎中的含量最为丰富。
该研究中，对比了消毒处理条件对分离内生真菌的影
（下转第11618页）
图2所示。结果显示，
5个样本聚类形成泸州桂圆和广西桂圆2支：泸州桂圆支的相似系数为0．67，
包括黄舣－潮河和海潮－张坝姐妹支（相似系数分别为0．80和0．78）。广西桂圆支的相似系数为0．62，
位于聚类图基部
。图25个不同产区桂圆品种的聚类分析结果
3结论与讨论
RAPD 技术已被用于桂圆品种间的亲缘关系、遗传差异
和遗传多样性分析［7－9］
，利用该技术进行泸州桂圆的分子鉴
定和亲缘关系研究尚未见报道。该研究中，
分析结果表明：泸州桂圆样本间亲缘关系较近，它们与广西桂圆间的RAPD 遗传位点差异较大，这构成区分泸州道地桂圆与广西桂圆的遗传基础。引物SBS －I1在泸州桂圆中产生的共有RAPD 条带以及在广西桂圆中产生的特征条带，可明显区分泸州道地桂圆和广西桂圆。泸州黄舣和潮河桂圆首先聚成一支，而海潮和张坝桂圆亲缘关系更近，这表明选育的泸州桂圆品种隶属于黄舣和张坝两大基因池。
影响RAPD 技术可重复性的因素较多
［10］
，傅俊江等
［5］
在对蜘蛛DNA 的RAPD 研究时发现，通过降低PCR 仪从退火到延伸的ramp 参数可以明显提高RAPD 技术的分辨率和产物量。该研究将PCR 仪从退火到延伸的默认ramp 参数降到最低，结果也表明：桂圆RAPD 分析的分辨率提高，条带产物量增加。其可能的原因是，通过降低从退火到延伸的升降温速率，
有利于引物和模板DNA 的结合，低升降温速率又有利于增加引物与模板DNA 结合的稳定性，从而增加PCR 产物的产量和条带数
［5］
。
因此，RAPD 技术具有简单快捷的优点，用于不同植物的亲缘关系分析和分子鉴定的前景广阔，
特别是可以通过降低从退火到延伸的ramp 参数来提高RAPD 技术的分辨率和可重复性，这一改良的RAPD 技术具有较大的推广价值。参考文献
［1］徐颖，郑炜，吴薇，等．RAPD 技术在泰国香米品种纯度检测中的应用
［J ］．安徽农业科学，2011，39（4）：1939－1941．［2］苗佳敏，张新全，陈智华，等．青藏高原和新疆地区垂穗披碱草种质的
SRAP 及RAPD 分析［J ］．草地学报，2011，19（2）：306－316．［3］刘荣霞，于林清，张宇，等．利用RAPD 标记对不同秋眠级苜蓿种质的
聚类和评价
［J ］．草地学报，2010，18（1）：108－114．［4］李勇，丁万隆．我国部分金莲花种质资源遗传多样性的RAPD 研究
［J ］．植物遗传资源学报，2009，10（4）：535－539．［5］傅俊江，李麓云，徐湘，等．一种提高RAPD 技术扩增效率的有效方法
［J ］．遗传，2000，22（4）：251－252．［6］肖璇，孙一铭，王心燕，等．龙眼基因组DNA 提取及RAPD 反应体系优
化的研究
［J ］．西南师范大学学报：自然科学版，2006，31（2）：129－132．［7］林同香，陈振光，戴思兰，等．RAPD 技术在桂圆品种分类中的应用研究
［J ］．植物学报，1998，40（2）：1159－1165．［8］钟伟，林晓东，朱芳德，等．应用RAPD 技术分析热带龙眼四季蜜与常
规龙眼品种的遗传差异
［J ］．中山大学学报：自然科学版，2004，43（S1）：65－68．［9］YOSHIMI Y ，KASHEM C A ，HIDENORI K ，et al．Cultivars identification
and theire genetic relationships in Dimocorpus longana subspecies based
on RAPD markers ［
J ］．Sci Hort ，2006，109（2）：147－152．［10］袁勇芳，李思光，许杨，等．RAPD 技术重复性的影响因素［
J ］．江西科学，2000，18（2）：120－124．［11］叶开玉，卢美英，于萍，等．龙眼组织总RNA 提取与纯化方法的研究［J ］．西南农业学报，2008（3）：745－748．［12］XIAO L ，XU M Z ，CUI M ，et al．Optimization of RAPD reaction system of
Taxus cuspidate Sieb．et Zucc ［J ］．Agricultural Science ＆Technology ，2010，11（3）：47－49．［13］谭雪，郭爽，郑少薇，等．菜薹种质资源亲缘关系的RAPD 分析
［J ］．华北农学报，
2011（S1）：18－22．［14］DENG L Q ，ZHANG K ，HUANG K F ，et al．RAPD analysis for genetic di-versity of nineteen common and tartary buckwheat varieties ［J ］．Agricul-tural Science ＆Technology ，2011，12（1）：65－69．［15］段永红，牛西午，李素清，等．锦鸡儿属植物遗传多样性的RAPD 分析
［J ］．华北农学报，2009（1）：143－148．［16］朱永群，庞良玉，林超文，等．苏丹草品种间的RAPD 分析
［J ］．西南农业学报，
2011（6）：2410－2413．［17］SHENG J Q ，CAO J ，LI J H．Research on genetic diversities between Xi-aogan water chestnut and wild chestnut by randomly amplified polymor-phic DNA technology ［J ］．Agricultural Science ＆Technology ，2010，11
（8）：84－86．［18］梅志强，李春红，段承刚，等．ramp 在提高桂圆RAPD 分析效率中的应
用研究
［J ］．安徽农业科学，2012，40（7）：檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
3903－3905．（上接第11600页）
响，结果表明75%酒精处理30s 后，再用0．1%升汞处理7
min 的消毒效果最好，该结果与张延威［7］
等的研究类似，其在
研究茎部内生菌时，证明金钗石斛茎部处理时间达到10min 时，菌落数量很少。
该研究结果为金钗石斛内生真菌的研究带来了新的成果与研究方向，
但将其内生真菌完全分离纯化为单独的菌种后，
单菌种培养比较困难，通常菌株生长较弱，迅速老化变色，试验中曾多次尝试纯化培养，但均未得到理想的培养效果，这说明单菌种培养的培养基及相关培养条件仍有待优化。
参考文献
［1］王康正，高文远，范磊．石斛属药用植物研究进展［
J ］．中草药，1997，28（10）：633－635．［2］卢东升，黄新华，陈玉栋．野生铁皮石斛根围真菌的种类与特点［
J ］．江苏农业科学，
2009（2）：288－290．［3］郭顺星，曹文芩，高微微，等．铁皮石斛及金钗石斛菌根真菌的分离及
其生物活性测定
［J ］．中国中药杂志，2000，25（6）：338－341．［4］侯晓强．石斛属植物菌根生物学研究［D ］．北京：中国协和医科大学，
2007．［5］梁宇，高玉葆．内生真菌对植物生长发育及抗逆性的影响［
J ］．植物学通报，
2000，17（1）：52－59．［6］高微微，郭顺星．内生真菌菌丝及代谢物对铁皮石斛及金线莲生长的
影响［J ］．中国医学科学院学报，
2001，23（6）：556－559．［7］石晶盈，陈维信，刘爱媛．植物内生菌及其防治植物病害的研究进展
［J ］．生态学报，2006，26（7）：2396－2461．
川芎内生真菌的分离与鉴定
川芎内生真菌的分离与鉴定 汪杨丽，严铸云，郭晓恒，宋杰，陈新，万德光 成都中医药大学药学院中药材标准化实验室，四川成都 (610075） E-mail：wangyangli27@https://www.360docs.net/doc/575428213.html, 摘要：目的：探讨川芎内生真菌类群与川芎品种和产地的关系。方法：采用平板分离法分离川芎的内生真菌，采用点植法对分离菌株进行分类鉴定。结果：从6个产地的川芎根茎样品共获得内生真菌50株，经形态观察分类鉴定为1纲、3目、4科、13属。结论：不同产地及不同品种川芎的内生真菌在数量、分布、种群及其组成存在差异，推测川芎的道地性可能和川芎内生真菌种群有关。 关键词：川芎，内生真菌，分离鉴定 川芎为伞形科（Umbelliferae）藁本属植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根茎，具有活血行气、祛风止痛的功效，是著名的川产道地药材。四川都江、彭州为川芎的主要产区。此外，云南丽江、甘肃庄浪和华亭、江西等地也产，分别称“云芎”、“西芎”、“抚芎”[1～3]。有关不同产地及不同品种川芎的化学成分品质、药理、药效的研究报道较多[4]，但至今未见从川芎根茎分离内生真菌及其内生真菌种群多样性的研究报道。根据内生真菌和植物互惠共生的关系[5，6]，本文对不同产地及不同品种的川芎进行内生真菌的分离，探讨川芎在特定生境中的微生物群落结构的特征。 1. 材料与方法 1.1材料 1.1.1植物来源（见表1） 1.1.2 培养基 PDA培养基[7]（马铃薯葡糖糖培养基）＋青链霉素混合液[8]（用于分离）；PDA 培养基；促孢培养基（KH2PO41g、KNO31g、MgSO4.7H2O 0.5g、KCl 0.5g、淀粉0.2g、葡萄糖 0.2g、蔗糖 0.2g、琼脂15～20g、蒸馏水 1000ml、PH自然)。 表1 各种川芎的样品情况 药材名原植物部位采集地采集时间 川芎Ligusticum chuanxiong Hort. 根茎四川彭州敖平2006.5.20 川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川都江堰石羊2006.5.22 山川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川彭州小鱼2006.7.24 山川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川汶川水磨2006.8.10 西芎L. sinense Oliv. 根茎甘肃平凉市华亭马峡2006.9.14 云芎L. chuanxiong Hort. cv. Jinxiong根茎云南丽江泸沽湖2006.8.17注：以上品种经成都中医药大学严铸云副教授鉴定 1.2方法 1.2.1. 内生真菌的分离先去掉新鲜川芎的须根，用自来水将川芎根茎表面洗净，用5%的NaClO溶液浸泡5min，用自来水反复的漂洗，稍干后切成适宜大小的小块，在无菌的条件下，用75％酒精中浸泡5 min，用无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干，然后用无菌刀片将表皮削去，分别切成5 mm×5 mm×1 mm的小块种植于PDA培养基内，每个培养皿中放7小块，每个样品6个培养皿，置28℃恒温箱中培养3～15d，观察到培养基上从各植物组织块内部向周围
内生真菌MF24对铁皮石斛原球茎诱导作用及石斛的化学成分和活性研究
内生真菌MF24对铁皮石斛原球茎诱导作用及石斛的化学成分和 活性研究 铁皮石斛（Dendrobium candidum Wall.ex Lindl.）是兰科石斛属草本植物，是药典收录的五种石斛之一，也是最为珍稀名贵的石斛植物。由于自然繁殖率低，人工栽培技术不成熟，铁皮石斛野生资源已濒临枯竭。 本文以快速繁殖的铁皮石斛胚性组织原球茎为材料，根据兰科植物与真菌共生的生理特点，选取野生铁皮石斛的内生真菌小菇属（Mycena sp.）真菌（MF24）对液体培养的原球茎进行诱导作用，进行了较系统的研究，以期改善原球茎的药用质量而使其成为铁皮石斛的药用新资源。此外，本文对铁皮石斛原球茎、金钗石斛（D.nobile Lindl.）、长距石斛（D.longicornu Lindl.）的化学成分和药理活性进行了研究，丰富石斛属植物的药用和开发研究。 一、促淋巴细胞增殖、自由基清除实验结果显示MF24真菌诱导子对铁皮石斛原球茎的药理活性有提高作用。真菌诱导子处理的原球茎甲醇提取物（100μg／ml）对小鼠B淋巴细胞转化有促进作用，增殖率是9.36％，而对照原球茎没有这一活性，野生铁皮石斛强烈抑制B淋巴细胞转化。 与对照原球茎相比，真菌诱导子处理能使原球茎甲醇提取物促T淋巴细胞转化的活性提高84.8％。10μg／ml剂量时，对照原球茎、真菌诱导子处理的原球茎、野生铁皮石斛的甲醇提取物的超氧阴离子清除率分别是24.48％、30.14％、 12.72％；50％甲醇提取物清除率分别是31.95％、36.67％、18.46％。 二、通过对原球茎的化学成分研究以及它们的含量比较显示，MF24真菌诱导子对铁皮石斛原球茎的苯丙烷类和酚类化学成分含量有提高作用。首次对悬浮培养的铁皮石斛原球茎的化学成分进行了研究。
几种真菌的分离与鉴定教学文案
常见真菌的分离与鉴定 病原真菌的一般特性 真菌（Fungi）是微生物中的一个大类，是一群数目庞大的细胞生物，估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的子实体小者用显微镜才能见到，大者可达数十厘米，它们共同特征是具有真正的细胞核，产生孢子和不含叶绿素，以寄生或腐生等方式吸取养料，仅少数类群为单细胞，其他都有分支或不分支的丝状体，能进行有性或无性繁殖，具有纤维素（或其他葡聚糖）或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。对人类和动物致病的真菌大约100余种，属于病原真菌。 一、基本性状 （一）形态结构 真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类，前者属于酵母菌（yeast）一般呈球形或卵圆形，后者称为霉菌（mold）或丝状真菌，呈丝状分枝，菌丝交织象绒球状，另有一些真菌可因寄生环境及培养条件（养料、温度、氧气等）的不同可交替出现两种形态，即在室温中呈霉菌型，在37℃或体内呈单细胞的酵母型，这类真菌有双相性，所以称之为双态真菌或二相真菌。 真菌的细胞结构与一般植物细胞相似，有定型的细胞核及完善的细胞器，但胞壁与细菌胞壁不同，不含粘肽而是由角质及葡聚糖组成，也含有脂多糖蛋白质，其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖，不生长真菌丝，革兰氏染色呈阳性，丝状真菌分菌丝及孢子两部分，形态多种多样，分述如下。 1．菌丝（Hypha）真菌在合适的环境中，由孢子生出嫩芽，称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状，称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝，增殖的菌丝交织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生的物体或培养基中吸取养料，称为营养菌丝体。另一部分菌丝向空间生长，称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子者称为生殖菌丝体。菌丝中各个细胞间有明显分隔者，称为有隔菌丝。主要见于病原性真菌。很多非病原真菌的菌丝无明显分隔，称为无隔菌丝。有些菌丝可呈各种特殊形式，如球拍状、破梳状、螺旋状、结节状、关节状、鹿角状、假菌丝。 2．孢子生成孢子是真菌扩大繁殖的一种方式。真菌孢子的抵抗力、形态及作用等均与细菌芽胞不同，分为无性孢子及有性孢子两大类。不经过两性细胞的结合而形成的孢子叫无性孢子，这一繁殖过程称为无性繁殖。常见的无性孢子有5种：关节孢子、厚壁孢子、孢子囊孢子、芽孢和分生孢子。病原真菌属于不完全菌纲，很少产生有性孢子，大多数是无性孢子。 （1）厚壁孢子：当真菌在不利环境中，由菌丝内胞浆缩浓和胞壁增厚而成，呈圆形。当环境好转时可生成芽管成长为菌丝。
普通细菌培养鉴定操作规程
普通细菌培养鉴定操作规程 1 检验目的 做疾病的病原学诊断，查找于疾病有关的病原菌以及了解微生物与疾病的关系，指导临床治疗及预后和流行病学的调查。 2 原理 人体很多部位与外界相通，存在栖息菌群，但不致病，当菌群失调或分离到致病菌则具有临床意义；另外机体某些部位是无菌的，如检出细菌则视为致病菌。并排除采样及操作污染。 3 标本要求 （1）标本类型：血液，骨髓，脑脊液，胸水，腹水，尿液，等体液；痰液，前列腺液，脓液，组织分泌物或穿刺液等。 （2）标本采集：见标本采集手册 （3）标本储存和运输：室温放置，室温运输并立即送检。 （4）标本拒收状态：非无菌方式采集的标本或未按要求部位采取的标本。 4 容器和添加剂类型 均使用灭菌器皿盛放标本 5 试剂 （1）试剂名称：革兰氏染液、氧化酶试剂、3%触酶、血平板、中国蓝平板、SS平板、柯玛嘉平板、相关生化试剂等。 6仪器设备： （1）接种针、接种环、酒精灯 （2）梅里埃ATB药敏鉴定仪 （3）显微镜、SPX-150B型生化培养箱、超净工作台、台式离心机、天平 7 校准程序 (送市计量质量检测研究所校准) 8操作步骤
（1）所有标本按照培养目的增菌培养12-18小时后盲目接种，血培养发现阳性立即进行接种。 （2）接种：以上增菌标本及其他临床标本用接种环取标本接种环划线血平板及其他选择性培养基上,35℃培养过夜，观察结果。 （3）涂片：肉眼见细菌生长，取生长物涂片做革兰氏染色； （4）纯培养：根据需要接种血平板、巧克力、中国蓝/柯玛嘉或厌氧平板过夜培养以获得纯培养。 （5）鉴定：按照鉴定仪要求调配菌液浓度，细菌的鉴定见梅里埃ATB微生物鉴定系统 9质量控制： 参加我科质量管理小组组织的各项质量控制活动 10 生物参考区间 血液，尿液，脑脊液等无菌部位采取的标本未见细菌生长；其他标本如大便，痰液为正常菌群或未见致病菌。 11 患者检验结果的可报告区间 细菌鉴定到种或属；菌群调查报告比例。 12 临床意义： 为医生提供病原学诊断，并为进一步药敏实验提供依据。
杜仲内生真菌的分离及其鉴定
杜仲内生真菌的分离及其鉴定 摘要:从杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)的根?茎?叶中分离得到80株内生真菌,经显微形态特征观察鉴定为14个属,其中根部33株涉及10个属,茎部26株涉及9个属,叶部21株涉及6个属?结果表明,杜仲的不同部位内生真菌的数量?分布和种群存有差异? 关键词:内生真菌;分离;鉴定;杜仲 Isolation and Identification of Endophytic Fungi from Eucommia ulmoides Abstract: Eighty strains of endophytic fungi attributed to 14 genus were isolated and morphologically identified from the roots, stems and leaves of Eucommia ulmoides Oliv.. Among them, 33 strains of 10 genera were obtained from roots,26 strains of 9 genera from stems, and 21 strains of 6 genera from leaves. The results showed the facts that the quantity, population, and distribution of the endophytic fungi were varied in different tissues of Eucommia ulmoides. Key words: endophytic fungi; isolation; identification; Eucommia ulmoides Oliv. 杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)是我国独有的杜仲科杜仲属中的单种植物,具有 降压?消炎?防癌抗癌等多种药用功效?杜仲全身是宝,经济价值极高[1]?近年来,杜仲研究?开发取得了突破性进展,更使其身价倍增?目前这一重要的药用植物在利用上一方面已出现野生资源匮乏?药材供应不足的问题,另一方面其产品开发与活性物质提取的研究又较活跃,故寻找类似的替代资源受到关注[2]?自发现了能够产生紫杉醇的内生真菌以来,植物内生真菌能够产生与宿主相同或相似的生物活性成分已逐步得到验证[3,4]?本研究对杜仲内生真菌的种类进行分离及鉴定,以期了解杜仲内生真菌的资源情况,进一步研究其生物多样性? 1材料与方法 1.1材料 分离所用材料为杜仲的根?茎?叶,采自西北农林科技大学林学院校园内,树龄约20年,树体健壮,无病虫害? 1.2培养基 分离培养基为WA-抗生素培养基:琼脂20 g,氨苄青霉素200 mg,链霉素200 mg,水1 000 mL?
内生真菌研究进展
植物内生真菌研究进展 植物内生真菌（Endophytic fungus）是指在生活史中某一阶段或整个阶段存在于健康植物组织内部，对植物组织没有引起明显病症或对宿主没有造成明显伤害的真菌。内生真菌在植物组织中普遍存在，具有丰富的物种多样性。它是生活在植物组织内的一类微生物, 是植物微生态系统中的天然组成成分，且长期生活在植物体内的特殊环境中, 与寄主协同进化, 根据内共生理论, 内生真菌可能产生与宿主相同或相似的具有生物活性的次生代谢产物。1898年，Vogl等人从黑麦草Lolium temulentum L. 种子内分离出第一株内生真菌，引起了人们对植物内生真菌的注意。特别是美国学者从短叶红豆杉Taxus brevifolia的韧皮部分离到一株产抗癌物质紫杉醇的内生真菌，更是掀起了各国学者对内生真菌的研究热潮。 1 植物内生真菌的研究方向 内生真菌活性成分的筛选有两条思路。一是根据部分内生真菌具有合成和宿主植物相同或相似活性成分的能力这一特点，从药用植物中寻找具有合成确定化合物的内生真菌，常用方法是对分离得到的内生真菌培养液提取物通过色谱技术、单克隆抗体免疫检测等手段来确定该内生菌是否有产生目的化合物的能力。这一思路目标明确、针对性强、工作量相对较小，是目前从内生真菌中筛选活性物质的主要方法，采用这种方法已从多种资源缺乏的药用植物的内生菌中分离得到了和宿主植物相同或相似的活性物质。这种思路具有一定的偶然性，因为不能证实所有的植物中都存活着具有合成和宿主植物相同或相似活性物质的内生真菌。二是按照传统的化合物分离纯化鉴定的思路，寻找未知但具有特定活性的化合物。首先是按照目的选择不同的筛选模型进行活性菌株的筛选。其次是对筛选出的活性菌株发酵培养、分离纯化活性物质，再对活性物质进行理化研究及结构鉴定。 2 内生真菌药用活性物质及其生物学作用 2.1 抗肿瘤活性物质 2.1.1萜类化合物 紫杉醇是存在于各种紫杉属植物树皮和树叶中的萜类化合物, 被当今世界上认为是广谱、活性最强的抗癌药物。由于紫杉属植物中紫杉醇含量极低，加之紫杉属植物生长极其缓慢，自然资源非常缺乏。1993 年美国学者Stierle 等首次从短叶紫杉( Taxus brevifolia) 的韧皮部中分离出一种新的内生真菌( Taxomyces an2dreanae)，可在半合成培养液中产生紫杉醇和紫杉烷类化合物。这一发现为用微生物发酵法生产紫杉醇以解决紫杉醇药源危机提供了一条新途径，并成为从药用植物中分离内生菌热潮的开端。2006年, 田仁鹏等从生长在
临床标本细菌培养鉴定常见的15个疑问
问题1：如何正确应用药物敏感结果？ 正确运用药敏试验结果应考虑以下3个方面： 首先要确定病原菌，如未找到真正的致病菌，药敏实验不但不能指导用药甚至可能误导临床； 重视耐药监测，这是经验用药的一个重要的参考； 考虑到药敏试验的局限性：体外报告敏感的药物体内治疗不一定有效，而体外报告耐药的药物体内治疗不一定无效。 问题2：是否MIC越低的药物越好？ 不一定。因为不同药物对同种细菌，同一药物对不同细菌的折点均可不同，并且若细菌产生某些特殊耐药机制时，即使体外敏感也应报耐药，另外尚需考虑药动学和耐受性。因此，不能单纯比较MIC值而认为MIC越低的药物就一定越好。 MIC只表示一种药物对某一株细菌抗菌作用的强弱，MIC越低（离中介值越远）说明该药物对相应的病原菌的作用越强。只能比较同一种药对同一株菌，若MIC值升高，可认为其耐药性提高。 问题3：是否所有报告的细菌均为病原菌？ 不一定。原因如下： 所报告细菌为污染菌或定植菌，细菌培养结果的临床意义大小与所取标本有关。如为血液等无菌标本则临床意义较大，但即使血培养阳性也可能为污染菌。某些标本易受污染如痰标本易于受咽喉部携带菌的污染，尿培养易受下尿道、尿道口寄居菌污染。 可能为应用抗菌药后的菌群交替或菌群失调。特别是原为复数菌感染时，针对优势菌治疗一段时间后可能非优势上升为优势菌，或广谱抗菌药治疗后可
能出现真菌感染。 有２种以上病原菌时因生长速度不同、营养要求不同，培养结果不能真实反映病原菌的种类、数量。 问题4：为什么有时痰涂片结果与痰培养结果不一致？ 由于痰标本进行培养和涂片时选取的部位不一致； 某些快生长菌所占比例并不多，但由于生长速度快、营养要求低，能在培养过程中迅速变为优势菌而掩盖其他菌的生长； 标本从采集到接种的时间过长，造成部分苛养菌死亡，在涂片中看到的只是菌的残骸而非活菌。 问题5：我们想用的药物在药敏试验中没有做？ 1.天然耐药 2.可能是药物的敏感性被其他药物所预报 问题6：为什么有的菌报告很多种药物，有的仅报告几种药物？ 报告的药物种类根据细菌种类的不同而有所不同，如铜绿假单胞菌报告的药物较多，而嗜麦芽窄食单胞菌报告的药敏较少。 问题7：是否能将所用的药都做药敏试验? 1.没有必要：通过耐药机制和标志性药物可以预测其他抗菌药物的敏感性 2.没有可能：不是所用药物都可以做药敏试验（需要药物在体外稳定，需要有操作标准和解释标准） 问题8：选择药敏报告敏感的药物，为什么临床治疗无效？ ①体外药敏试验只能预测体内治疗效果，并不等同；一般来说，耐药＝治疗无效；敏感≠治疗有效；
金钗石斛的主要成分
金钗石斛的主要成分 金钗石斛所含成分：茎含生物碱0.3%，已分离得到：石斛碱(dendrobine)，石斛酮碱(nobilonine)，6-羟基石斛碱(6-hydroxydendrobine)又名石斛胺(dendramine)，石斛醚碱(dendroxine)，6-羟基石斛醚碱(6-hydroxydendroxine)，4-羟基石斛醚碱(4-hydroxydendroxine)，石斛酯碱（dendrine），3-羟基-2-氧-石斛碱（3-hydroxy-2-oxydendrobine）等。另据报道，还分离得到（部位不明）5种季铵生物碱：N-甲基石斛季铵碱(N-methyldendrobinium)，N-异戊烯基石斛季铵醚碱(N-isopentenyldendrobinium)，石斛碱N-氧化物（dendrobine N-oxide），N-异戊烯基-6-羟基石斛醚季铵碱(N-isopentenyl-6-hydroxydendroxinium)。茎还含亚甲基金钗石斛素（nobilomethylene），金钗石斛菲醌（denbinobin），β-谷甾醇（β-sitosterol），胡罗卜甙（daucosterol）。 主治功能：益胃生津，滋阴清热。用于阴伤津亏，口干烦渴，食少干呕，病后虚热，目暗不明。 应用药理： 1．治眼目昼视精明，暮夜昏暗，视不见物，名曰雀目。石斛、仙灵脾各一两，苍术(米泔浸，切，焙)半两。上三味，捣罗为散，每服三钱匕，空心米饮调服，日再。(石斛散《圣济总录》) 2．主治系统性红斑狼疮阴虚内热型，红蝴蝶症：生地30克，元参、天麦冬各10克，玉竹、石斛、黄精、青蒿、地骨皮、胡黄连、银柴胡、丹皮各10克，上药水煎服，日1剂，分2～3次服。(《中医杂志》1987.8) 3．治中消：鲜石斛五钱，熟石膏四钱，天花粉三钱，南沙参四钱，麦冬二钱，玉竹四钱，山药、茯苓各三钱，广皮一钱，半夏一钱五分。甘蔗三两，煎汤代水。(祛烦养胃汤《医醇剩义》)
铁皮石斛内生细菌的分离和初步鉴定
铁皮石斛内生细菌的分离和初步鉴定 摘要：以野生药用植物铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为研究对象，采用无菌操作技术分离到内生细菌23株，其中来源于根、茎、叶的分别为7株、8株、8株。通过形态学观察和染色等，初步鉴定了铁皮石斛内生细菌具有7个属，包括土壤杆菌属（Agrobacterium）、芽孢杆菌属（Bacillus）、泛菌属（Pantoea）、乳杆菌属（Lactobacillus）、梭菌属（Clostridium）、黄杆菌属（Flavobacterium）、葡萄球菌属（Staphylococcus）。研究丰富了我国细菌资源，为铁皮石斛内生菌资源的开发利用提供了理论依据。 关键词：铁皮石斛；内生细菌；分离；鉴定 铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为兰科石斛属药用植物，主要分布在我国云南、浙江、广西、贵州等地区。铁皮石斛具有抗肿瘤、抗辐射、抗血小板凝集、增强机体免疫力等功效，是我国传统的名贵中草药[1]。随着需求量的日益增加，野生铁皮石斛被无序采集，自然资源日趋减少，部分种类已濒临灭绝。植物内生菌作为一种重要的微生物资源，是植物微生态系统的重要组成部分，也是新型天然活性物质的重要来源之一[2]。然而，在我国药用植物开发和利用中，对内生菌的研究相对较少，目前已研究涉及的药用植物内生菌只有300余种，这相对于我国丰富的药用植物资源（11 146种）还相差很远。因此，开展我国药用植物内生菌研究，特别是其生物多样性和化学多样性研究是非常必要的。目前，关于铁皮石斛内生菌多样性的研究已有报道[3-6]，但仅限于其内生真菌的研究。研究采用形态学鉴定方法，系统分离铁皮石斛内生细菌，为丰富我国细菌资源和促进铁皮石斛保护性开发利用提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 植物来源新鲜健康野生铁皮石斛于2011年10月采自浙江天台山，保持整棵植株的完整性带回实验室，4 ℃保存，24 h内处理。 1.1.2 培养基NA培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖 2.5 g，氯化钠5 g，琼脂16 g，去离子水1 000 mL；分离培养基：每毫升NA培养基中加入100 IU 两性霉素B，用于内生细菌分离纯化。NB培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖2.5 g，氯化钠5 g，去离子水1 000 mL；半固体培养基：牛肉膏1.8 g，蛋白胨4 g，葡萄糖20 g，酵母浸出液1.3 g，NaCl 3 g，Na2HPO4 1 g，MgCl2 0.05 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，琼脂为5 g，去离子水1 000 mL，用于穿刺培养[7]。 1.2 方法 1.2.1 内生细菌的分离纯化铁皮石斛植株用清水冲洗干净后，选取适量根、茎、叶，在75%乙醇中浸泡30 s，再置于2%次氯酸钠中5～10 min（根和茎消毒10 min，叶消毒6 min），用无菌水冲洗4次后，在无菌条件下将根和茎切为0.5 cm长的小段，叶切为0.5 cm × 0.5 cm的小片。选取根、茎、叶各10小段（片）作为铁皮石斛供试组织材料接入分离培养基中，在37 ℃培养箱中恒温培养7 d。每天定时检查内生细菌长出情况，及时挑取切口处新长出的细菌菌落，并转移到
一种抗真菌抗生素的分离纯化及初步鉴定
一种抗真菌抗生素的分离纯化及初步鉴定 摘要:从海南五指山采集的土样中分离到一株放线菌,编号为WS-23883,其发酵提取物对多种植物病原真菌具有很强的抑制活性?对其产物进行提取精制及制备液相纯化,获得了纯度达90%以上的化合物?生测表明,在20 μg/mL浓度下该抗生素对多种植物病原真菌的抑制率达100%?根据活性产物紫外吸收光谱,可判断其为一多烯大环内酯类抗生素?质谱分析表明,活性化合物分子质量约667 u,据此判断其为一四烯大环内酯类抗生素? 关键词:多烯大环内酯;抗生素;化合物;纯化;鉴定 Isolation, Purification and Preliminary Identification of A Kind of Antibiotic with High Antifungal Activity Abstract: One actinomyces strain WS-23883 was isolated from soil sample collected in Wuzhishan Mountain area, Hainan province. The extraction of the fermentation broth was bioassayed with some plant disease pathogens; and it exhibited high antifungal activity. The compound with purity above 90% was obtained through macroporus resin column absorbtion method and preparative HPLC. The bioassay showed that the inhitition ratio was 100% at the concentrition of 20 μg/mL. The UV absorption spectrum and mass spectrum showed that the compound was atetraene macrolide antibiotic. Key words: polyene macrolide; antibiotic; compound; purification; characterization 从海南五指山采集的土样中分离到一株放线菌,其发酵提取物对多种供试植物 病原真菌及某些腐生真菌具有很强的抑制活性?采用常规方法对该菌的发酵产物进行了提取精制,得到了纯度在90%以上的样品,从目标产物的紫外吸收光谱可判断其为一多烯类抗生素?HPLC-MS检测表明,活性产物分子离子峰为667,可以确定其分子质量约为667 u,综合分析后确定其为一四烯大环内酯类抗生素? 1材料与方法 1.1菌株 1.1.1抗生素产生菌编号为WS-23883,从海南五指山采集的土样中分离得到,由湖北省生物农药工程研究中心保存? 1.1.2生测指示菌番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)?小麦颖枯病菌(Septoria nodorum)?小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)?水稻纹枯病菌(Rhizoctonia
产纤维素酶真菌的分离和鉴定
产纤维素酶真菌的分离、筛选与鉴定 一、采样 地点：深圳大学杜鹃山深圳大学文科楼荔枝园深圳大学文山湖树丛 用具：灭菌信封小铁铲小刀分离培养基手套 采样的方法：取采样地点的表层土或地面15cm下的土样约10g，装入信封，立刻到实验室分离纯化 二、培养基： （1）马丁氏培养基：KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂20.0 g、水1000ml，pH 自然。 （2）PDA培养基：PDA培养基：用于里氏木霉的固体培养，含20 %土豆浸出液，1 %葡萄糖，2 % Agar。20 %土豆浸出液作法如下：将土豆去皮切碎，每20 g土豆加水100 ml，置电炉上煮20分钟，用纱布过滤，定容。 （均需要加入抗生素100μg/ml） 产酶筛选培养基（CMC培养基）：羧甲基纤维素钠（CMC）20.0 g、蛋白胨5.0 g、酵母抽提物2.0 g、NaCl 5.0g、KH2PO4 1.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、琼脂20g、蒸馏水1 000ml。 1%CMCNa底物溶液：1克CMCNa加热溶化于100ml pH值4.8，0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中。 0.lmol/L的柠檬酸一柠檬酸钠缓 0.1mol/L柠檬酸: 含柠檬酸·H2O 21.01克/1000毫升。 0.1mol/L的柠檬酸三钠: 含柠檬酸三钠·2H2O 29.4克/1000毫升。 0.1mol/L的柠檬酸40ml与0.1mol/L的柠檬酸三钠60.6ml混合即可。 刚果红染液：2% 刚果红溶液。 NaCl脱色液：2%氯化钠溶液。 三、实验方法 3.1 真菌菌株的分离 取土样方法如前所述。取1.0 g所采集的土样加入到装有9 ml无菌水的试管中，充分振荡混匀后，吸取上清液作一系列梯度稀释，10-1，10-2，10-3，将稀释液涂布在分离培养基（可选择查氏、马丁氏或PDA培养基的任两种，倒平板前加入100 μg/ml头孢菌素或链霉素等抗生素），于28℃下培养，待菌落成熟，形成孢子后（约需5-7 d）将单菌落上的少量孢子点种至纤维素酶产生菌筛选培养基（CMC平板）平板上( 用前加入适量抗生素来抑制细菌生长) , 28℃倒置恒温培养。培养5-7d后用刚果红染色、NaCl脱色后筛选菌落周围有明显透
真菌形态的几种观察方法
真菌形态的几种观察方法.txt39人生旅程并不是一帆风顺的，逆境失意会经常伴随着我们，但人性的光辉往往在不如意中才显示出来，希望是激励我们前进的巨大的无形的动力。40奉献是爱心，勇于付出，你一定会收到意外之外的馈赠。真菌形态的几种观察方法 真菌作为一种实验材料，在微生物实验室中的应用是相当普遍的，正确的培养观察方法，能够如实地反映其本质特征。下面介绍实验室中真菌形态的几种观察方法。 1．载片培养法 载片培养方法是实验室观察真菌形态的基本方法。此法的基本步骤是：在无菌条件下，用无菌吸管吸取融化的培养真菌的固体培养基，快速地滴一滴于无菌的载玻片上，待其冷却以后，用接种环沾取少许孢子或者挑取一点菌丝段于凝固的培养基上，上面放上无菌的盖玻片。然后，将此片子放入干净的培养皿中，培养皿底部放入潮湿的吸水滤纸，或者将培养皿底放入一些水，中间用玻璃棒隆起，将做好的培养片子搭放在上面，合适温度下培养。将培养好的片子取出，用小镊子轻轻地取下上面的盖玻片，把盖玻片转放于另一干净的载玻片上，待自然干燥后，两边用透明胶固定，用棉蓝染色液染色。 载片培养法还可以这样进行：将厚度约0.5mm的平板培养基用小刀切成大小0.5cm2的小块，挑取一小块培养基放于干净的载玻片上，同样的方法接种、培养观察。还可以用刀片将培养好的载玻片上的多余培养基割去，自然干燥后，用大一点的盖玻片盖上菌丝，用同样方法两边固定，染色观察，这种方法特别适用于产生无性孢子的真菌的形态观察。该方法要注意以下几点：滴的培养基不能太多，接种物不能太多，防止污染。 2．插片培养法 插片培养法是实验室观察真菌形态的另一种基本方法。这种方法的基本步骤是：将菌丝块接种于固体平板的中间。假如是以孢子接种，则将孢子稀释液涂布于固体平板上，然后，用小镊子夹起一块无菌的盖玻片，以45度角的角度斜插入培养基中，不要插入培养基太深，让菌丝爬上盖玻片；培养好了以后，再用小镊子将盖玻片取出，自然干燥以后，将盖玻片转移到一干净的载玻片上，用同样的方法两边固定，染色观察。该方法要注意：插片的角度要掌握好，不能太直或太平；当两面都有菌丝时，擦去背对中心的那面的菌丝，以避免干扰。 3．粘片法 粘片法是用透明胶粘贴菌丝或者孢子进行观察的方法。用剪刀剪取一小段透明胶，用小镊子夹住一个角，轻轻地粘一些菌丝或者孢子，然后将其放入一干净的载玻片上，在载玻片上滴一滴染色液，可以染色观察。此法要注意：粘贴时，不要用力粘的太多；粘上菌丝或者孢子的透明胶放入载玻片上，不要移动，要一次放好。 4．平板观察法 平板观察法是在平板上直接观察真菌的方法。对菌丝生长得比较稀疏的真菌和观察基内菌丝。此法比较直接真实地反映菌丝的形态特征，观察时将平板的上盖拿开，倒置于显微镜的载物台上。这种方法可以消除由于培养体变干或者放在菌丝表面的盖玻片等可能出现的影响。此
真菌的分离培养和鉴定论文
内蒙古广播电视大学 “一村一名大学生计划”毕业作业作业题目真菌的分离培养和鉴定___ 教学点名称：包头广播电视大学_ 学员姓名：张瑞光__________ 学号：1015004452077___ 专业：畜牧兽医专科____ 入学时间：2010秋_________ 指导教师：杨瑞芳 _________
真菌的分离培养和鉴定 【摘要】：从发霉的红薯上和酸败腐烂的苹果上挑取霉变物用沙堡琼脂培养基28℃培养2-3天，分离出几个真菌菌株。将分离株重新进行平板划线分离，挑取单菌落表面的少许孢子用马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行载片小培养，经28℃培养2—3天于低倍镜下观察，通过菌丝和孢子对分离株进行鉴定。观察到簇生在分生孢子梗的顶端的呈帚状分枝的分生孢子和有隔菌丝，可鉴定为青霉类菌；观察到分生孢子梗上呈轮状着生、具有3个分隔、弯曲的孢子，可鉴定为弯孢霉类菌；观察到单细胞的芽殖孢子，并通过进一步的酵母菌生理生化测定，可鉴定为酵母菌。 【关键词】：真菌；菌落；菌丝；孢子 1 前言 真菌一词来源于拉丁文的“蘑菇”，现在真菌这一名词的概念不仅包括蘑菇，而是代表着一个相当庞大的生物类群。什么是真菌呢？从生物学的观点来看，它们是一大类真核微生物，无根茎叶，不含叶绿素，不能利用无机物来制造食物，靠寄生或腐生生活，仅少数为单细胞，其余为多细胞，大多数真菌有分枝或不分枝的丝状体，能进行有性生殖和无性生殖。从形态上分为酵母菌、霉菌、担子菌。 其实，真菌并不像其看起来的这般抽象，在我们的日常生活中几乎到处都有它们的存在，我们每个人都有过接触和
不同程度的感性认识。例如酿酒、制馒头用的酵母；酒曲的曲种（曲霉和根霉）；做豆腐乳的毛霉和红曲霉；发酵饲料的黑曲霉；味美可口的蘑菇、木耳、银耳、猴头；作为中药的神曲、麦角、虫草、茯苓、灵芝；此外还有食品、衣物、用具等因潮湿而发生的霉；引起农作物病害的小麦锈病等等都是真菌。 真菌与细菌的大小、形态、结构及化学组成差异很大，单细胞个体比细菌大几倍至几十倍，具有细胞壁，但不含细菌细胞壁的肽聚糖。有些真菌因环境条件的改变而改变形态，称之为真菌的两相性，如假皮疽组织胞浆菌在动物机体呈酵母菌样。而在人工培养基上呈丝状。 真菌不仅种类多，数量大，而且分布极为广泛，与人类生产与生活有着极密切的利害关系。有些菌丝可引起人与畜禽疾病，有些霉菌还产生毒素，直接或间接的危害人类健康。因此，了解真菌的培养方法，认识其形态十分重要。 近年来在真菌分类方面趋向于采用Anisworth&bisby 的《真菌学辞典》介绍的分类系统。该系统认为真菌不属于低等植物，而是属于单独成立的真菌界，界以下分为黏菌门和真菌门。真菌门再分为鞭毛菌亚门、接合菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门。本研究从自然界分离到几株真菌，并用真菌分类方法对其进行了鉴定。
江苏省南通、扬州、泰州2017届高三第三次模拟考试生物试题
江苏省南通、扬州、泰州2017届高三第三次模拟考试 生物试题 ―、单项选择题:本部分包括20题，每题2分，共计40分。每题只有一个选项最符合题意。 1.核酸、磷脂、ATP三种分子 A.都含有C、H、0、N、P、S B.在所有生物体内普遍存在 C.都可以被相应的酶催化水解 D.都具有物种的特异性 2.下图是浆细胞结构模式图，相关叙述错误的是 A.结构1、2、4是细胞生物膜系统的部分 B.结构3、5在该细胞中会发生周期性变化 C.细胞中结构4发达与其旺盛分泌抗体相适应 D.浆细胞的形成离不开抗原的刺激 3.将人成熟红细胞置于5%葡萄糖和0.9%NaCl的等体积混合液中，会发生 A.水分子进出细胞的速率基本相等 B.细胞通过主动运输吸收葡萄糖 C.细胞吸收02，并与[H]结合生成H20 D.细胞吸收Na+，并产生动作电位 4.下列有关胰岛素和胰蛋白酶的叙述，正确的是 A.两者都是由胰腺中内分泌细胞合成并分泌的 B.向两者的混合溶液中加入双缩脲试剂，溶液呈紫色 C.胰岛素调节某些代谢过程，胰蛋白酶参与细胞内代谢 D.人体内环境中失活的胰岛素会被胰蛋白酶催化水解 5.细胞癌变过程中不会发生 A.细胞中核DNA结构发生改变
B.细胞黏着性下降、易分散转移 C.细胞膜上蛋白质种类和数量改变 D.细胞水含量减少、酶活性降低 6.水稻抗稻瘟病是由基因R控制，细胞中另有一对等位基因B、b对稻瘟病的抗性表达有影响，BB使水稻抗性完全消失，Bb使抗性减弱。现用两纯合亲本进行杂交，实验过程和结果如右图所示。相关叙述正确的是 A.亲本的基因型是RRBB、rrbb B.F2的弱抗病植株中纯合子占2/3 C.F2中全部抗病植株自交，后代抗病植株占8/9 D.不能通过测交鉴定F2易感病植株的基因型 7.下图为某细菌mRNA与对应的翻译产物示意图，相关叙述错误的是 A.一分子mRNA有一个游离磷酸基团，其它磷酸基团均与两个核糖相连 B.mRNA上的AUG是翻译的起始密码，它是由基因中的启动子转录形成 C.一个mRNA有多个起始密码，所以一个mRNA可翻译成多种蛋白质 D.在该mRNA合成的过程中，核糖体就可以与之结合并开始翻译过程 8.下列有关生命科学研究方法及结论的叙述中，错误的是 A.鲁宾和卡门用180分别标记H20和C02，证明了光合作用释放的02来自于水 B.卡尔文用14C标记的C02供应小球藻进行光合作用，探明了暗反应中碳的转移途径 C.科学家向豚鼠胰腺腺泡细胞中注射3H标记的亮氨酸，揭示了基因控制蛋白质合成的过程 D.赫尔希和蔡斯用32P、35S分别标记噬菌体DNA和蛋白质，证明了DNA是遗传物质 9.下列关于生物育种的叙述，正确的是
常见真菌的分离与鉴定
常见真菌的分离与鉴定 发表时间：2010-08-20 发表者：皮肤科 (访问人次：361) 作者：上海长征医院皮肤科徐红 2005年6月13～19日全国各地举行了第8届中国护足周，主题是“积极治疗足病，杜绝家庭传染”。 在中国,每2个人中就有1人罹患足病，其中成年人发病比例高达75%；超过60%的足病为真菌感染，其中足癣发病率为45.2%，甲真菌病(俗称甲癣)占15.5%；40%的足癣患者是被家人传染的；在真菌患者中只有23.8%寻求治疗，其中50%的患者症状稍有好转就不继续治疗。 真菌其实很常见，真菌就生活在我们身边。 病原真菌的一般特性 真菌（Fungi）是微生物中的一个大类，是一群数目庞大的细胞生物，估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的子实体小者用显微镜才能见到，大者可达数十厘米，它们共同特征是具有真正的细胞核，产生孢子和不含叶绿素，以寄生或腐生等方式吸取养料，仅少数类群为单细胞，其他都有分支或不分支的丝状体，能进行有性或无性繁殖，具有纤维素（或其他葡聚糖）或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。对人类和动物致病的真菌大约100余种，属于病原真菌。 一、基本性状 （一）形态结构 真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类，前者属于酵母菌（yeast）一般呈球形或卵圆形，后者称为霉菌（mold）或丝状真菌，呈丝状分枝，菌丝交织象绒球状，另有一些真菌可因寄生环境及培养条件（养料、温度、氧气等）的不同可交替出现两种形态，即在室温中呈霉菌型，在37℃或体内呈单细胞的酵母型，这类真菌有双相性，所以称之为双态真菌或二相真菌。 真菌的细胞结构与一般植物细胞相似，有定型的细胞核及完善的细胞器，但胞壁与细菌胞壁不同，不含粘肽而是由角质及葡聚糖组成，也含有脂多糖蛋白质，其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖，不生长真菌丝，革兰氏染色呈阳性，丝状真菌分菌丝及孢子两部分，形态多种多样，分述如下。 1．菌丝（Hypha）真菌在合适的环境中，由 孢子生出嫩芽，称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状， 称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝，增殖的菌丝交 织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生的物体或培养基中吸取养料，称为营养菌丝体。另一部分菌丝向空间生长，称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子
分离与菌种 鉴定
《高级微生物实验指导》 一、目标微生物的分离与鉴定 在无菌条件下取样品10 g加入100 mL无菌生理盐水，用均质机将组织破碎均匀。经充分震荡做成1:10的均匀稀释液。用1 mL的灭菌吸管吸取1:10稀释液，注入9 mL灭菌生理盐水的试管内，震荡试管混匀，按上述操作依次进行10倍递增稀释，选择3个适宜的稀释度，每个稀释度做2个平行，用灭菌涂布棒均匀涂布于冷却的细菌分离培养基（NA）和真菌分离培养基（PDA）表面，分别将细菌培养基和真菌培养基于30℃和28℃下恒温培养2-4d。待菌长出后，挑取不同形态菌落，纯化，挑取单菌落于PDA斜面上，培养并保存。 二、细菌与霉菌总DNA的提取（CTAB法） 1、菌株DNA的提取通用试剂 （1）CTAB抽提液：2%CTAB，1.4M NaCl，20mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH8.0；（2）β-疏基乙醇 （3）PVP（聚乙烯吡咯烷酮） （4）石英砂 （5）Tris平衡酚 （6）氯仿：异戊醇（24:1） （7）异丙醇 （8）75%乙醇 （9）无水乙醇 2、菌株DNA的提取步骤 (1) 将已纯化的菌种，接种于相应的分离培养基平板上，28℃培养2d-4d。 (2) 用灭菌药勺或解剖刀从培养皿中刮取足量菌丝至1.5ml离心管中。 (3)加少量PVP、灭菌海砂和65℃水浴预热的200μl CTAB抽提液，用玻璃棒研磨至匀浆； (4)加入400ul预热CTAB抽提液，颠倒混匀后于65℃水浴1h；期间轻柔颠倒混匀2-3次。 (5)冷却至室温后，12000rpm离心10min，上清液移至另一离心管中； (6)加入1/2体积（约300ul）的Tris平衡酚及1/2体积（约300ul）的氯仿：异戊醇（24:1），颠倒混匀。 (7)12000rpm离心10min，取上清液至另一离心管中； (8)重复（5）-（7）步2-3次，直到两相界面处无明显杂质； (9)加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），轻轻颠倒混匀； (10)12000rpm离心10min，取上清液至另一离心管中； (11)向上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃放置15min； (12)12000rpm离心10min，弃去上清液，加入70%乙醇500ul以悬浮沉淀；也可250ul 70%乙醇分两次悬浮沉淀； (13)12000rpm离心5min，弃上清，室温干燥；
金钗石斛的药理作用
金钗石斛的药理作用 1．解热作用：金钗石斛流浸膏对人工发热之家兔无解热作用。石斛碱则有一定的止痛退热作用，与非那西汀相似而较弱。 2．对离体肠管活动的影响： 2.1．对豚鼠离体肠管活动的影响：取鲜药材捣碎，加70%乙醇（鲜药材1g加4ml）室温冷浸15天，过滤减压回收乙醇至小体积，浸膏用蒸馏水配成每1ml相当于鲜药材4g，置冰箱中备用。取体重300-400g的健康豚鼠，雌雄不限，截取回肠，每段约3cm，用DC-001型离体器官测定仪记录肠管活动（加药后记录30分钟以上），浴槽中的台氏液量显30ml，加温恒定为38±0.5℃，每项实验3-8只豚鼠，肠管6-16段。实验结果表明，当浓度为2.5%时，金钗石斛、细叶石斛、重唇石斛能兴奋肠管；罗珂石斛对肠管活动的影响不明显；铁皮石斛、流苏石斛、细茎石斛、黑毛石斛、迭鞘石斛先使肠管抑制，几分钟后恢复到给药前水平；钩状石斛使肠管收缩幅度稍降低，束花石斛明显地抑制肠管的活动。 2.2．金钗石斛流浸膏对离体兔肠低浓度时兴奋，高浓度则有抑制作用。 2.3．石斛浸膏对家兔肠管小剂量兴奋，大剂量呈抑制作用。 2.4．石斛碱对离体兔肠有抑制作用。 3．对腹腔巨噬细胞作用：金钗石斛水煎剂给小鼠灌胃6天，可提高其腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬能力。 4．对小鼠胃肠推进运动的影响：药液Ⅰ：取阿拉伯胶1g，溶于2ml蒸馏水中，搅拌成糊状，加入活性炭0.5g，搅匀，加生理盐水稀释至10ml，搅匀。药液Ⅱ：配法同药液Ⅰ，以金钗石斛浸膏（配制同前）代替生理盐水。药液Ⅲ：配法同药液Ⅰ，以束花石斛浸膏（配制同前）代替生盐水。取18-22g健康小鼠30只，雌雄各半，随机分成3组；第一组以药液Ⅰ作对照，第二组给药液Ⅱ，第三组给药液Ⅲ；按0.4ml／20g体重灌胃给药，30分钟时将小鼠处死，立即剖腹，将消化道自幽门直至直肠末端完整摘出，不加牵引，平铺于木尺上测其全长，并记录炭末的前沿到幽门的距离，计算其与肠道全长的百分比，取全组平均值进行比较，束花石斛可明显抑制胃肠推进运动；石斛对胃肠推进运动无明显的影响。 5．对心血管系统的作用：金钗石斛流浸膏对离体蟾蜍心脏则不论浓度高低均为抑制。蟾蜍下肢血管灌流时无明显作用。石斛碱有升高血糖、降低血压、减弱心脏收缩力。 6．对病原微生物的作用：用组织培养作筛选试验，证明金钗石斛煎剂对孤儿病毒（ECHO11）所致的细胞病变有延缓作用。 7．其他作用：石斛碱有抑制呼吸的作用，大剂量可致惊厥，安密妥纳可以对抗解毒；而对离体豚鼠子宫可使之收缩。