硫酸盐还原菌_SRB_的生态特性及其检测方法研究进展_胡德蓉

第3卷第3期2007年6月

南　方　水　产

South China Fisheries Science

Vol 13,No 13

Jun 1,2007

收稿日期:2006205219;修回日期:2006211207资助项目:科技部社会公益研究专项(2000D I B 50175)

作者简介:胡德蓉(1982-),女,硕士研究生,从事海洋渔业资源与生态环境研究。E 2mail:xiaohu458@hot m ail 1com 通讯作者:林钦,E 2mail:linqinscs@21cn 1com

?综述?

硫酸盐还原菌(S RB )的生态特性及其检测方法研究进展

胡德蓉

1,2

,林　钦

1

(11农业部渔业生态环境重点开放实验室,中国水产科学院南海水产研究所,广东广州510300;

21上海水产大学,上海200090)

摘要:文章从碳源、氮源利用以及溶解氧、pH 值、温度和其它环境因子对其影响等方面综述了环境中硫酸盐还原菌(SRB )的生态特性,重点介绍了S RB 的检测方法,并讨论了各种检测方法的优缺点,以及随着科学技术和实验条件的进步对各种检测方法的改进。另外还介绍了SRB 对水产养殖业发展所造成的危害。关键词:硫酸盐还原菌(SRB );生态特性;检测方法中图分类号:Q93919 文献标识码:A

文章编号:1673-2227-(2007)03-0067-06

Detecti on and ecology character isti c of sulfate 2reduci n g bacter i a

HU Der ong

1,2

,L I N Q in

1

(11Key L ab 1of M arine Fishery Ecology Environm ent and Pollution M onitoring &Control Techniques ;South China

Sea F isheries R esearch Institute,Chinese A cade m y of Fishery Sciences,Guangzhou 510300,China;

21Shanghai Fishery U niversity,Shanghai 200090,China )

Abstract:This paper revie wed the ecol ogy characteristic of sulfate 2reducing bacteria (SRB )in the envir on ment fr om carbon s ource,nitr ogen s ource,oxygen,pH value,te mperature and other fact ors 1It als o e mphasized on the detecti on of SRB,and discussed the ad 2vantage of each detecti on method,and intr oduced the i m p r ove ment of detecti on method with the devel opment of technol ogy and experi 2mental con 2diti on 1I n additi on,the har m of S RB t o aquaculture devel opment was described 1Key words:sulfate 2reducing bacteria (SRB );ecol ogy characteristic;detecti on technique

硫酸盐还原菌(sulfate 2reducing bacteria,SRB )是生态系统中土著微生物类群,是一类形态各异、营养类型多样、能利用硫酸盐或者其它氧化态硫化物作为电子受体来异化有机物质的微生物,在其代谢活动中,除CO 2和水外,还产生高浓度的H 2S 为呼吸终产物[1-5]。经典意义中的S RB,是专性厌氧菌,但一般不为空气所致死,一旦环境变得厌氧,它们就繁殖起来[6-7]。目前,对SRB 的研究主要集中在对碳钢腐蚀影响方面,如油田、船舶、海洋工程等[8-10]。

SRB 对水产养殖业也会造成严重的危害,主要是沉积物和

底层水由于处于厌氧环境有利于SRB 大量繁殖进而产生大量的有毒气体H 2S,破坏水质并且毒害养殖生物[11-13],使养殖环境进入恶性循环状态。因此,对养殖环境中SRB 的研究应得到更广泛的关注。本文主要概述了SRB 的生态特性并讨论了各种检测方法的优缺点。

1　硫酸盐还原菌的分类、分布及对水产养

殖业的危害

自BE I JCR I N CK 在1895年发现SRB 以来,SRB 的分类

68

　南　方　水　产第3卷

史已长达一个多世纪,如今对它的认识仍在不断加深,SRB

的种属归类仍在不断变动着。根据《伯杰细菌鉴定手册》(第八版),常见的SRB有不产芽孢的脱硫弧菌属和产芽孢的脱硫肠状菌属,其中脱硫弧菌属包括5个种,分别是D esulfovibrio desulfuricans(脱硫脱硫弧菌)、D1vulgaris(普通脱硫弧菌)、D1salexigens(需盐脱硫弧菌)、D1africanus(非洲脱硫弧菌)、D1gigas(巨大脱硫弧菌);脱硫肠状菌属包括2个种,分别是D1ficans和D1rum inis(瘤胃脱硫肠状菌)[14]。目前,随着现代测定技术和分类技术的出现和完善,SRB已经细化到11个属,但某些新发现的SRB甚至无法分类[15]。

SRB通常是嗜温的革兰氏阴性、不产芽孢的类型,但在淡水及其他含盐量较低的环境中易分离到革兰氏阳性、产芽孢的菌株。此外,在自然界中存在的还有革兰氏阴性嗜热真细菌、革兰氏阴性古细菌等。SRB虽然是厌氧菌,但是它分布广泛,可以存在于土壤、水稻田、海水、盐水、自来水、温泉水、地热地区、油井和天然气井、动物肠道等厌氧环境中[16]。还可以从一些受污染的环境中检测到它的存在,如厌氧的污水处理厂废物、被污染的食品中等等。

SRB因繁殖过程生成高浓度的H2S对水产养殖业的危害是很大的,集中表现在养殖虾塘里。因为养虾过程需要水比较肥,并且虾塘清塘次数较少,随着残饵和虾的排泄物沉积,虾塘底部极易形成厌氧环境,这一富含有机质的厌氧环境为S RB提供了温床。近年来,虾病大范围爆发,究其原因是养殖环境恶化所致,高浓度的H

2

S使水体发黑发臭,并且毒害养殖生物。

一般天然海区鱼类网箱沉积物中SRB数量高达106 CF U?g-1,对养殖生物造成很大的危害,因为S RB释放H2S 会使养殖环境水体pH降低,而偏低的pH条件又会使细菌

代谢有机硫和无机硫产生H

2

S的作用加强,从而形成一种恶性循环。因此,研究养殖沉积物中的SRB种群、生物量,代谢能力和条件,对维护养殖环境生态平衡、控制甚至消

除H

2

S的污染是非常必要的。

2　硫酸盐还原菌的生态学特性

211　碳源、氮源

SRB的不同菌属生长所利用的碳源是不同的,最普遍的是利用C3、C4脂肪酸,此外还可以利用一些挥发性脂肪酸(如乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐)、醇类(如乙醇、丙醇等),另外还可以利用葡萄糖作为碳源[17]。许多学者都曾做过SRB的碳源利用实验,均发现SRB对乳酸盐的利用效果最好。铵盐是大多数SRB生长所需的氮源。多种SRB还能够固氮,有些菌种能够利用氨基酸中的氮作为氮源,少数菌种能通过异化还原硝酸盐和亚硝酸盐获得氮,如脱硫脱硫弧菌固氮亚种(D1desulfuricans subs p azotovorans)。212　溶解氧

SRB在厌氧的环境中生长活跃,根据有关报道,SRB 不是严格的厌氧菌,而应该归类到兼性厌氧菌,如张小李等[18]研究了溶解氧含量对脱硫脱硫弧菌生长的影响,结论是这种SRB能够耐受415mg?L-1的环境溶解氧浓度,但在910mg?L-1的高溶解氧环境下不能生长,原因主要是其胞内含有抗分子氧的保护酶[19]。如超氧化物歧化酶(super2 oxide2dis mutase)、NADH氧化酶(NADH oxidase)、过氧化氢酶(catalase),这些酶都是细胞氧化还原过程中间步骤的参与者。最近,在过程末端存在的氧化还原酶也从该属中的巨大脱硫弧菌中被分离提纯出来。脱硫脱硫弧菌中也含有红素还原酶,类似的氧利用途径可能同样存在于该种菌细胞内,但这一途径不同于好氧微生物氧代谢途径,它只有在氧浓度较低时才利用这些酶,SRB获取能量的主要途径仍是异化还原硫酸盐。然而,硫酸盐还原反应必须在较低的氧化还原电位下进行[20],较高的氧浓度导致环境中氧化还原电位过高,SRB异化硫酸盐还原反应受阻,所以,当氧浓度过高时SRB生长受到抑制,在低溶氧浓度环境中, SRB还是可以生长的。

213　pH、盐度

pH是细菌生长的重要因子,一般细菌生长的pH都处在中性偏碱的范围内,而对于某种特殊细菌可能不在这个范围内,细菌适宜生长的pH都与其长期生长的环境pH相一致[21]。不同种类的SRB可在pH为510～915的范围内生存,其中内陆淡水中生长的SRB的最适pH为610～615,而海水中SRB的最适pH为710～718[22]。

盐度对细菌的影响是通过水中渗透压的变化来影响细菌物质的运输过程。盐度过高会引起细胞质壁分离,造成细胞脱水死亡[23]。不同生存环境中的SRB适应不同的盐度条件,陆地和淡水环境中的S RB可不需要盐分或所需盐度很低,海洋SRB或咸水SRB所需盐度则因区域而异,盐度可以从716到饱和浓度,河口脱硫弧菌需要天然海水或浓度为3×10-2的NaCl培养基才能生长,而脱硫螺菌在3×10-2的NaCl培养基中即可生活,在浓度为24×10-2NaCl的澙湖水覆盖泥沼中也可分离到脱硫脱硫弧菌。一般在实验室中分离到的嗜盐菌多数是轻度嗜盐菌,适宜盐度范围为10～40,多数中度嗜盐菌可在盐湖、死海等区域中分离到[24]。

214　温度

SRB一般在-5～75℃的条件下生存,但某些种可以在-5℃以下的环境中生长,具有芽孢的种也可以耐受80℃甚至更高的温度。S RB有较强的适温能力,能很快适应新的温度环境。大部分陆生的SRB是中温菌,其适温范围为30～40℃。在环境中,分布最广的是海洋SRB[25],它们大多数属于低温种,其中一些是专性嗜冷菌(如O bligate psy2 chrophiles),最适温度为15～18℃,≥20℃时即会死亡;其它的是兼性嗜冷菌(如Facultative psychrophiles),其最适生

第3期胡德蓉等:硫酸盐还原菌(SRB)的生态特性及其检测方法研究进展69

　

长条件与中温菌相似,但也可在≤20℃的温度中缓慢生长,

所以,在南极和北极那样的低温环境中也存在有SRB[26]。一般分离自热火山区、探油井、海底热泉或热液系统中的SRB大都是嗜热种。嗜热的S RB一般适于在55～75℃的温度中生长。有些特殊的嗜热SRB适应范围更高,其最高生长温度为70～85℃,如STETT LE等1987年发现的某些具有硫酸盐还原菌特性的古细菌(A rchaeoglobus fidgidus)的最适温度为83℃,甚至最高温度升至92℃时仍可存活[27]。少数可形成芽孢的S RB可以在131℃的高温中存活20m in。目前确定种属的嗜热SRB只有3个D esulfoto m aculum nigrifi2 cans[28]、D esulforibrio ther m ophilus[29]和Ther m odesulfobacleri2 um co mm une[30]。

215　其它环境因子

关于S RB的其它环境因子的相关报道不多,SRB在培养基中有无微量元素和维生素C的条件下都可以生长,但要求氧化还原电位(Eh)低于-100mV[31]。也有学者指出,培养基的Eh要低于-150mV才能生长。这也就说明了低Eh对SRB的生长是必要的。S RB在有Fe2+存在的培养基中生长的更好,这是因为Fe2+是SRB细胞中各种酶(如细胞色素酶、铁还原酶、红素还原酶、过氧化氢酶等)的活性基成分,在细胞内部通过自身价态的相互转化Fe2+→←Fe-3,实现所有酶传递电子的作用,但是Fe2+的浓度不是越高越好,当Fe2+浓度达到3～4g?L-1[32]以后,细胞生长对Fe2+的需要就达到了饱和,此时再增大Fe2+的浓度对细胞生长并无明显的促进作用。H

2

S的浓度对SRB的生

长也有影响,一般当H

2

S的浓度达到16mmol?L-1时就会抑

制SRB的生长,因为H

2

S对S RB产生了毒害作用。

3　硫酸盐还原菌的检测方法

国内外学者对硫酸盐还原菌的检测方法进行了许多探索和研究,发明了多种检测技术。从原理上讲,主要分为: (1)培养法;(2)显微镜直接计数法;(3)代谢产物定量法;(4)免疫学法;(5)ATP法;(6)硫离子选择电极法等。本文将各种检测方法的原理进行了比较,并讨论了其优缺点,以期为各种环境中的SRB检测提供参考。

311　培养法

目前,国内外较为常见的培养法主要有测试瓶法、琼脂深层培养法和溶化琼脂管法。这些方法都是根据AP I RP2 38美国石油学会推荐的地下注入水分析方法中的3管平行绝迹稀释法[33]进行的,只是在实际使用中结合了现场具体条件,在培养时间、培养温度等方面做了补充和修改。31111　测试瓶法 测试瓶法[34]是利用瓶装的含乳酸盐、硫酸盐和Fe2+(或金属铁)的培养基对待测水样进行接种培养,从而确定水样中SRB含量的方法。在测试瓶中装入硫酸盐等多种营养物质,调节pH值至710～715,加入小铁钉以提供Fe2+,并经高压蒸汽灭菌处理即制成测试瓶成品。因此,当待测样品中存在SRB并接入测试瓶中之后,经培养,测试瓶底部即会出现黑色的沉淀(FeS),据此作为SRB的生长指示。

测试瓶法是目前国内外最为常用并已得到推荐的SRB 检测方法。这种方法被认为是检测方法中最为简捷的。但这种方法仍有许多不足之处,其中最大的缺点是最终结果需用时间过长,一般认为需用28d,并且所得数据比较粗糙,所检测水样的SRB较低时可能没有阳性反应。

31112　琼脂深层培养法 琼脂深层培养法[35]采用的培养基与测试瓶法基本类同,但其中加入了亚硫酸钠作为还原剂和除氧剂。该法也以培养基变黑作为生长标志,但该法是通过观察培养基变黑所需时间的长短来计数的。琼脂深层培养法的优点是简单易行、不需要特殊的仪器设备、能在5d之内得到检测结果,但这种方法在5d内必须每天观察试验结果,这给操作者带来了不便。更重要的是,由于培养基中含有亚硫酸根,它能被某些常见的非SRB还原成硫化物而产生假阳性;另一方面,5d培养有时对较低含量的SRB是不够的,有时在培养5d之后才出现变黑现象,因而该法对较低含量的水样可生产假阴性。

31113　溶化琼脂管法 溶化琼脂管法以胰蛋白胨作为唯一营养源,并在培养基中加入亚硫酸钠作为除氧剂。此方法的优点是不需要特殊的仪器设备,3d培养即可得到检测结果,但该法操作较为繁琐,实验结果有时难以观察。另外,与琼脂深层培养法一样,该法也能产生假阳性和假阴性。

312　显微镜直接计数法

一般认为显微镜只能测出系统细菌的总数,不能检出SRB的数量[36]。但有报道说用异硫氰酸盐荧光素(F I TC)和间接荧光抗体技术(I F A)可定量检测细菌总数和SRB 含量。它的原理是F I TC染料可粘附到任何蛋白质上。微生物经F I TC处理后,在配有荧光的显微镜下,将染色细菌放大1000或1600倍就可观察,测得细菌总数;而I F A间接荧光抗体只能在S RB上着色,在荧光显微镜上观察可得到SRB的数量。

ESC A(表面荧光/细胞表面抗体)法[37]基本原理是, SRB细胞表面存在着特异的抗体附着点,抗体与荧光化合物相连接,仅仅只与SRB细胞表面的抗体附着点相结合。在表面荧光显微镜下观察,抗体与细胞相连呈绿色边界。ESCA法能在2～3h内得到SRB检测结果,该法对SRB具有专一性。但该法检测下限高达10ind?mL-1,操作者必需经过严格训练,并且实验结果有时难以观察。

313　代谢产物定量法

目前,国内外提出了以SRB新陈代谢活性大小来评价SRB危害程度的方法。放射性呼吸检测仪就是根据SRB产生硫化物的量来检测其危害性的[38]。三碘化亚甲基兰法测定SRB的菌量[39]也是对代谢产物进行检测的一种方法。

放射性呼吸检测仪具体方法是以含有同位素35S的硫酸盐作为示踪剂,在细菌代谢作用下硫酸盐还原成35S2-,进

70

　南　方　水　产第3卷

而与Fe2+形成硫化亚铁,加酸后使H

2

S逸出并被纸捻吸收,与纸捻上的Zn2+反应,生成硫化锌,然后用闪烁计数

法测定纸捻中的35S2-,从而计算出硫酸盐的还原率。

该方法操作过程和实验装置都比较简单,可在十分接近现场的条件下完成,因此具有较好的现场指导意义。但该操作需在无氧环境下进行,因此需培养生成硫化物,所以需要时间相对较长,一般要7～8h。

314　免疫学法

SRB胞内有一种酶,即腺苷25′2磷酸硫酸盐还原酶(以下简称APS还原酶),这种酶为SRB所特有,其它细菌均不存在此种酶。据此,美国修斯顿的Conocon公司和Du Pont公司的研究者研究出了一种新的SRB检测方法2免疫学法[40]。

免疫学法原理是基于APS还原酶研究而成的[41]。这种特有酶能催化腺苷25′2磷酸硫酸盐发生还原反应,生成还原产物。利用该还原产物与显色剂的显色反应及其强弱,并与标准菌量读数卡比较,即可得到待测水样中SRB的含量。

免疫学法能在15～40m in内得到检测结果,实验结果易于观察,呈颜色反应者为阳性,不显色者为阴性。该法对SRB具有专一性,且不需要特殊的仪器设备,适应现场使用,并且改进方法后检测下限可达10ind?mL-1,所以具有很广阔的应用空间。但目前在国内还没有见到应用此种SRB测试系统的相关报道。

315　ATP法

三磷酸腺苷(ATP)是所有活的生物细胞中都具有的一种化合物,其含量与细胞浓度成正比[42]。细胞破碎后, ATP进入溶液,与荧光素反应发出荧光,用光度计定量,就可测出相应的细菌含量[43]。ATP法通过测定水样中ATP 的含量来检测水样中的生物总数。因为所有的生物细胞都含有ATP,因此,该方法只能测出微生物总数,但用于厌氧系统SRB的检测具有一定的实际意义。

ATP法能在1h之内得到检测结果。但这种方法只能测定水样中的微生物总数,不能直接测定其中的SRB数量。并且检测下限要求在5000ind?mL-1以上。因此,限制了其应用范围。

316　硫离子选择电极法

硫离子选择电极对SRB产生的硫离子可直接测定[44],它比经典的硫化亚铁法检测SRB的菌量方法快,且对一定

量的菌量而言(5×105ind?mL-1菌)无H

2

S溢出,易于实现在线分析。

硫离子选择电极的基本原理就是用硫离子选择电极及银2氯化银、参比电极测量电池电动势,根据电动势可以转换为S2-的浓度,并由标准S2-浓度进行校正。

硫离子选择电极法对S RB的菌量检测具有方法快速、简单、易于实行自动化等优点,并能更好的描述菌生长过程的4个阶段,如对数阶段及静止阶段等。但此检测方法理论反应和实际应用都是新课题,有待进一步完善和探讨。4　目前研究进展

目前,随着实验技术和实验条件的进一步发展与完善, SRB的分离、提纯和鉴定方法有更新的进步。万海清等[45]改进了SRB的分离方法———稀释涂布2叠皿夹层培养法,该方法不需要单独创建无氧环境且易于得到单独菌落。

F LE MM I N G等[46]改进了SRB的计数方法———最大可能计数(MP N)法,利用放射性物质35S O2+

4

进行标记,结果大大提高了SRB的检测上限。丛丽等[47]对油田注入水细菌分析方法———绝迹稀释法进行了修改,采用40℃生理盐水对油污进行稀释和分散,使油污内圈闭的细菌释放到生理盐水中,结果检测所得数量大大提高。

易绍金等[48]利用染色镜检技术在室内建立了一种测定SRB菌量的新方法———培养镜检法,此方法有机地结合了普通镜检法和培养法。该方法能在4d内得到结果,比测试瓶法提前10d,具有广阔的应用空间。

近年来,随着分子生物学技术的发展,对SRB的检测也达到分子水平。建立于检测硫酸盐还原菌遗传标记基础上的分子生物学方法主要有PCR、PCR2RF LP和原位杂交,常用的遗传标记主要有硫酸盐还原菌16S r RNA基因特征序列和硫酸盐还原菌亚硫酸盐异化酶(dissi m ilat ory sulfite re2 ductase,dsr)基因。

WAG NER等[49]对多种属于真细菌和一种属于古细菌的硫酸盐还原菌亚硫酸盐异化酶基因进行PCR扩增,对扩增产物进行碱基序列分析,并进一步推导出亚硫酸盐异化酶氨基酸序列进行比较,结果表明,硫酸盐还原菌亚硫酸盐异化酶氨基酸序列有高度近似性(49%～89%),从而推断出属于真细菌和古细菌的硫酸盐还原菌亚硫酸盐异化酶可能起源于同一个保守的酶。

L I U等[50]等利用PCR2RF LP分析了东太平洋海洋沉积中的硫酸盐还原菌dsr AB基因的多态性,表明该基因的分子多态性即硫酸盐还原菌类群多态性与海洋的深度、碳源生物利用度密切相关。

E NR I C等[51]利用氰盐(Cy3)标记特异性寡核苷酸探针的荧光原位杂交,研究了德国北海W adden Sea沉积物不同垂直度的微生物群落结构。结果表明,一定垂直度的沉积物中,硫酸盐还原菌占总微生物的量仅次于黄杆菌属。

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