药理效应法评价藏药湿生扁蕾的提取工艺

景　明1

,陈正君1

,罗永皎1

,李季文

(11甘肃中医学院,甘肃兰州730000;21甘肃省中医院,甘肃兰州730050)

摘要　目的:研究藏药湿生扁蕾的提取工艺。方法:采用小鼠耳廓二甲苯致炎、角叉菜胶致大鼠足跖肿胀、大鼠干酵母致热、小鼠热板致痛及电刺激致痛试验,观察湿生扁蕾不同工艺提取物对抗炎、镇痛、解热作用的影响。结果:湿生扁蕾不同工艺提取物均有抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀、角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的作用;水提取物、乙醇提取物和微波提取物均可提高小鼠热板致痛的痛阈,但超临界C O 2提取物镇痛效果不明显;乙醇提取物和微波提取物对小鼠电刺激致痛显示明显的镇痛作用,水提取物和超临界CO 2提取物镇痛效果不明显;湿生扁蕾不同工艺提取物对干酵母所致大鼠发热均有明显的解热作用。结论:湿生扁蕾乙醇提取物的抗炎、镇痛、解热作用显著,其药理效应明显优于水提、超临界CO 2提取及微波提取。

关键词　药理效应;湿生扁蕾;提取工艺

中图分类号:R28412 文献标识码:A 文章编号:100124454(2010)0320459204

收稿日期:2009211216

基金项目:甘肃省科技厅科技支撑计划项目(0804NKCA119208)

作者简介:景明(19632),男,教授,主要从事中药新药的研究开发;Tel:0931********,E 2mail:j m @gszy 1edu 1cn 。

湿生扁蕾为龙胆科扁蕾属植物湿生扁蕾Gen 2

tianopsis paludosa (Hook 1f 1)Ma 的干燥全草,藏药名为机合斗,具有清热解毒、止痛、利湿消黄、健脾止泻等功效,用于治疗肝炎、胆囊炎、热病发斑、泄泻、肠胃炎、结膜炎、急性肾盂肾炎、疥疮肿毒等症,藏医用

全草治疗流行性感冒及胆病引起的发烧〔1,2〕

。对湿

生扁蕾抑菌作用的研究已有报道〔3,4〕

,但药理效应法评价湿生扁蕾提取工艺的研究尚未见报道。本研究通过对湿生扁蕾不同工艺提取物抗炎、镇痛、解热作用的研究,优选湿生扁蕾的提取方法,为其开发和利用提供参考依据。1　材料

111　药品与试剂　角叉菜胶(Sig ma 公司,批号G1023225G );二甲苯(天津市德恩化学试剂有限公司,批号20070914);干酵母(湖北安琪干酵母股份有限公司,批号060105);戊巴比妥钠(北京化学试剂公司,批号060222);羧甲基纤维素钠(山东聊城阿华制药有限公司,批号060721);导电胶(甘肃中医学院科研实验中心配制);氯化钠、淀粉、甘油均为化学纯试剂;湿生扁蕾药材经甘肃省药品检验所宋平顺主任药师鉴定为龙胆科扁蕾属植物湿生扁蕾Gentianopsis paludosa (Hook 1f 1)Ma 的干燥全草。112　仪器　JL 2D 药理生理实验多用仪(上海益联科教设备有限公司);RCY 22热板测痛仪(上海康为医疗科技发展有限公司);H WC3L 2A 微波萃取设备(天水华园制药设备有限公司);HA121250202超临界萃取装置(江苏南通华安超临界萃取有限公司);FY130药物粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。113　动物　昆明种小鼠,体质量(20±2)g,雌雄兼用;W istar 大鼠,体质量(200±20)g,雌雄各半,均由

甘肃中医学院实验动物中心提供,合格证号SCXK (甘)200420006;动物颗粒饲料由北京科奥协力饲料有限公司提供。

114　干酵母混悬液的制备　称取干酵母10g,置于乳钵中,逐渐加入蒸馏水研磨为均匀的悬浆,最后定容为50mL,此液于临用前配制。

115　导电胶的制备　称取氯化钠175g,淀粉40g,甘油25g,加水至500mL,超声处理10m in,此液于临用前配制。

116　湿生扁蕾提取物(GTP )的制备　将湿生扁蕾用药用粉碎机粉碎成60目的粉末。水提:称取药材粉末,加10倍量水,煎煮提取2次,每次115h,滤过,合并滤液,浓缩成浸膏(GTP1),备用。超临界CO 2提取:称取药材粉末,在萃取压力25MPa 、解析压力8MPa 、萃取温度45℃、CO 2体积流量20mL /m in 的条件下,萃取115h,收集萃取物(GTP2),备用。乙醇提取:称取药材粉末,加10倍量70%乙醇,加热回流提取2次,每次115h,滤过,合并滤液,减压回收乙醇后浓缩成浸膏(GTP3),备用。微波提取:称取药材粉末,加10倍量70%乙醇,微波萃取2次,每次用功率为500W 的微波于80℃辐射3m in,滤过,合并滤液,减压回收乙醇后浓缩成浸膏(GTP4),备用。GTP1、GTP2、GTP3、GTP4在给药前用015%羧甲基纤维素钠(C MC 2Na )配成115g 原药材/mL 的混悬液,备用。

2　方法〔5,6〕

与结果

211　GTP 对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响　取小鼠50只,雌雄各半,随机分为5组,每组10只,分别为

空白对照组、水提取物组、CO 2提取物组、乙醇提取

物和微波提取物组。给药前将各供试物分别超声处理10m in 使充分混悬,各组小鼠右耳涂药1次,每次012mL (15g 原药材/kg ),对照组涂以等容量015%C MC 2Na 溶液,连续3d,末次给药30m in 后,各给药组用蒸馏水洗去耳廓上的药物,并于右耳的内侧均匀涂以二甲苯,每只0105mL,左耳作为对照。30m in 后处死动物,用直径8mm 的打孔器于左右耳对称处打下耳片,分别称重,计算各组动物的肿胀度,并按下式计算肿胀抑制率。GTP3能够显著抑制小鼠耳肿胀(P <0101),GTP1、GTP2和GTP4能够抑制小鼠耳肿胀(P <0105),结果见表1。

抑制率(%)=对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度

对照组平均肿胀度

×100%

212　GTP 对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响　取大

鼠50只,随机分为5组,每组10只,分别为空白对照组、水提取物组、CO 2提取物组、乙醇提取物组和微波提取物组。各组大鼠分别灌胃GTP1、GTP2、GTP3、GTP4,每只2mL (15g 原药材/kg ),对照组给予等容量015%C MC 2Na 溶液,连续给药4d,末次给

药后用玻璃容器法测定大鼠右后肢足跖体积,1h 后每鼠右后肢足跖掌皮下注射1%角叉菜胶溶液011mL 致炎,分别于致炎后1、2、3、4、5、6h 再用玻璃容器法测定致炎大鼠右后肢足跖体积,以各鼠致炎前后体积的差值为肿胀度。GTP3和GTP4均显著抑制角叉菜胶致炎后不同时间大鼠足跖肿胀(P <0101或P <0105);GTP1和GTP2仅显著抑制角叉菜胶致炎后2h 的足跖肿胀(P <0105),结果见表2。

　表1 湿生扁蕾提取物对二甲苯致小鼠

耳肿胀的影响( x ±s ,n =10)

组别剂量/

(g/kg )

肿胀度/mg

抑制率

P 值

对照组

-57175±2183--

GTP11553146±214471433GTP21554118±613761243GTP31551107±31781115733GTP4

52123±7138

9156

注:与对照组比较,3P <0105,33P <0101

表2湿生扁蕾提取物对大鼠足肿胀的影响( x ±s ,n =10)

组别剂量/

(g/kg )

致炎后不同时间的足跖肿胀度/mL

1h 2h 3h 4h 5h 6h 对照组-0158±01160162±01150165±01180162±01170161±01130159±0117GTP1

150142±01130144±011930147±01160153±01110155±01180156±0114GTP2150144±01150147±010930149±01120156±01130157±01120158±0116GTP3150138±0110330139±010*******±0111330143±010*******±0115330143±011833GTP4

0139±0119

0140±0115

0145±0118

0142±0117

0144±0114

0145±0113

注:与对照组比较,3P <0105,33P <0101

213　GTP 对小鼠热板法致痛的影响　选择痛阈值在10s ～30s 的雌性小鼠50只,随机分为5组,每组10只,分别为空白对照组、水提取物组、

CO 2提取物组、乙醇提取物组和微波提取物组。重复测定各组小鼠的痛阈值,作为该鼠给药前痛阈值。各组分别灌胃给药,每只012mL (15g 原药材/kg ),对照组给予等容量015%C MC 2Na 溶液,给药后15、30、45、60m in 每次将小鼠1只放在(55±

015)℃热板测定仪上,从放入至出现舔后足所需时

间(s )作为该鼠的痛阈值,并按下式计算痛阈提高率。GTP3能够明显提高小鼠痛阈(P <0101或P <0105),GTP1和GTP4均可提高小鼠痛阈(P <0105),但GTP2镇痛效果不明显(P >0105),结果见表3。

痛阈提高率(%)=给药后平均痛阈值-给药前平均痛阈值

给药前平均痛阈值

×100%

表3湿生扁蕾提取物对小鼠热板致痛的影响( x ±s ,n =10)

组别剂量/

(g/kg )

给药前痛阈/s

给药后不同时间痛阈(s )和提高率(%)

15m in 30m in 45m in 60m in 对照组-1815±1121816±118(

015)

1818±211(116)

1815±116(0)

1815±216(0)

GTP1151813±1182015±1143

(1017)2114±1163

(1415)1918±213(716)1914±312(517)GTP2151814±1141815±114(1015)

1816±212(111)

1913±112(417)1817±119(116)

GTP3

151811±1142416±111

(2614)2519±113

(3011)2117±118

(1616)

2112±2153(1416)GTP4

1812±116

2217±1133

(1810)2318±1153

(2314)2016±1193

(1218)

1918±211(1013)

注:与对照组比较,3P <0105,33P <0101

214　GTP 对小鼠电刺激致痛的影响　用75%乙醇

擦洗鼠尾,涂以导电胶,置刺激电极于小鼠尾部,电

极板涂5%盐水,用药理生理多用仪进行电刺激(电压10V ,频率1Hz,波宽10m s,刺激时间1/25s ),连续刺激3次,每次间隔5m in,3次均出现嘶叫反应的为合格小鼠。取合格小鼠50只,随机分为5组,每组10只,分别为空白对照组、水提取物组、CO 2提取物组、乙醇提取物组和微波提取物组。各组灌胃给药,每只012mL (15g 原药材/kg ),对照组给予等容量015%C MC 2Na 溶液,于给药后20、40、60、90m in 重复电刺激小鼠,连续两次刺激均不出现嘶叫

反应时,表明药物有镇痛效果,并按下式计算镇痛百

分率。GTP3、GTP4显示明显的镇痛作用(P <0105),而GTP1、GTP2镇痛效果均不明显(P >0105),结果见表4。

镇痛率(%)=镇痛鼠数

总鼠数

×100%

215　GTP 对干酵母致大鼠发热的影响　实验前3d 每日测大鼠体温1次,挑选体温变化在37～3815

℃,且自身体温变化低于013℃的雄性大鼠60只。实验当日每1h 测体温1次,连续测3次,取3次体

温的平均值作为基础体温,动物按3mL /kg 背部皮

下注射10%干酵母混悬液。3h 后体温开始上升,选取4h 后体温上升高于1℃左右的大鼠50只,随机分为5组,每组10只,分别为空白对照组、水提取物组、CO 2提取物组、乙醇提取物组和微波提取物组。各组分别灌胃GTP,每只2mL (15g 原药材/kg ),对照组给予等容量015%C MC 2Na 溶液。给药后每隔30m in 测量1次肛温,观察体温变化情况。GTP1、GTP2、GTP3、GTP4对干酵母所致大鼠发热均有显著的解热作用(P <0105),结果见表5。

　表4 湿生扁蕾提取物对小鼠电刺激

致痛的影响( x ±s ,n =10)

组别剂量/(g/kg )

给药后不同时间的镇痛率/%

20m in 40m in 60m in 90m in 对照组

-0000GTP11510101010GTP21501000GTP315403603503403GTP4

注:与对照组比较,3P <0105

表5湿生扁蕾提取物对大鼠解热作用的影响( x ±s ,n =10)

组别剂量/

(g/kg )

正常体温

/℃

发热体温

/℃

给药后不同时间(m in )的体温变化(℃)

306090120对照组

-37134±01838146±11238144±11738158±01838162±01638183±017GTP11537131±01938146±11338146±11338112±11437139±118337136±2133GTP21537125±01538142±11438146±11438128±01737171±115337153±1163GTP31537121±11238153±01938114±11837178±1133

37146±311337135±2143GTP4

37118±0

38148±113

38136±114

38110±116

37119±214

37120±117

注:与对照组比较,3P <0105

216　数据处理　各组实验数据均以 x ±s 表示,采

用统计软件SPSS 1310进行单因素方差分析,对小鼠电刺激致痛采用卡方检验,P <0105有统计学意义。3　讨论

湿生扁蕾在藏药属于藏茵陈类,属蒂达系列机合斗,目前在藏医中广泛用于治疗和预防急慢性肝炎,所含的化学成分包括呫吨酮类、黄酮类、三萜类、

三十烷醇、胡萝卜苷及β2谷甾醇等,活性成分主要有齐墩果酸、熊果酸、1,72二羟基23,82二甲氧基呫吨酮、木犀草素等

〔7〕

,其中呫吨酮类、黄酮类具有抗

炎、镇痛、解热、抗腹泻作用〔8,9〕

。虽然湿生扁蕾在

民间的药用价值很大,但有关湿生扁蕾的研究报道并不多,并且多局限于成分分析和对其抑菌作用的研究。因此,有必要通过药理效应研究其提取工艺,

为湿生扁蕾的新产品开发提供科学依据。

参

考

文

献

[1]张宝琛,甄润德,胡柏林,等1湿生扁蕾的化学成分研究

[J ]1中草药,1980,11(4):1491

[2]李作平,霍长虹,郑小莉1扁蕾的化学成分研究[J ]1中

国现代应用药学杂志,2003,20(1):242251

[3]王焕弟,谭成玉,白雪芳,等1藏药湿生扁蕾有效成分抑

菌作用初探[J ]1天然产物研究与开发,2005,17(5):

59825991

[4]米琴,曹长年,王慧春,等1湿生扁蕾有效成分抑菌活性

的测定[J ]1青海师范大学学报(自然科学版),2004,22

(2):842851

[5]陈奇1中药药理研究方法学[M ]1北京:人民卫生出版

社,2006:29423681

[6]徐叔云,卞如濂,陈修,等1药理实验方法学[M ]1第3

版1北京:人民卫生出版社,2002:8821

[7]米琴,曹长年,赵宙光,等1藏药湿生扁蕾有效成分的研

究[J ]1青海师范大学学报(自然科学版),2005,23

(2):642661

[8]王焕弟,谭成玉,杜昱光,等1藏药湿生扁蕾的化学成分

研究[J ]1中国医学杂志,2005,40(14):1059210611

[9]景明,李季文,樊秦,等1反相高效液相色谱法测定湿生

扁蕾中木犀草素和1,72二羟基23,82二甲氧呫吨酮的含量[J ]1中国中医药信息杂志,2008,15(3):432441

飞龙掌血多糖提取工艺研究

田春莲,文赤夫,吴文滔

(吉首大学生物资源与环境科学学院,湖南吉首416000)

摘要　目的:研究飞龙掌血多糖的最佳提取工艺及组分。方法:采用单因素实验分别考察了提取时间、提取温度、料液比及提取次数对飞龙掌血多糖提取率的影响,通过正交试验优化提取工艺条件;粗多糖纯化后用薄层色谱法进行组分分析。结果:飞龙掌血多糖最佳浸提工艺为A 1B 2C 3,即提取时间2h,温度70℃,料液比1∶20(g/mL );方差分析表明浸提温度和料液比对多糖提取有显著影响;粗多糖得率为3196%,经初步纯化后得率为1184%;薄层色谱显示飞龙掌血多糖含有D 2半乳糖和D 2葡萄糖。结论:本实验为大规模工业生产中用浸提法提取飞龙掌血多糖提供了依据。

关键词　飞龙掌血;多糖;提取条件;薄层层析

中图分类号:R28412 文献标识码:A 文章编号:100124454(2010)0320462203

收稿日期:2009210222

基金项目:林产化工工程湖南省重点实验室开放基金资助项目(JDZ200906)

作者简介:田春莲(19702),女,土家族,副教授,硕士,研究方向:资源植物保护与利用;Tel:0743********,E 2mail:tianchunlian1970@1631com 。

飞龙掌血别名勒沟、血见飞、散血丹,为芸香科

植物飞龙掌血[Toddalia asia tica (L 1)La m ]的根,木质藤本。主产湖南、广西、陕西、四川、贵州等地,非洲东部和亚洲东南部及南部均有分布。祖国医学认为其具有舒筋通络、活血散瘀、消肿止痛的作用,常用于治疗风湿痹痛、胃痛、痛经、跌打损伤〔1〕

。现代医学研究表明,其具有镇痛抗炎、抗心肌缺血、治疗

家畜胃肠炎及抑菌等作用

〔225〕

,但对飞龙掌血多糖的

提取工艺条件未曾进行系统研究,本实验以湘西地区丰富的飞龙掌血为材料,探讨其多糖提取的最佳工艺,为合理开发利用飞龙掌血资源提供理论依据。1　仪器、试剂与材料

111　仪器　723A 紫外可见分光光度计,上海精密

科学仪器有限公司;GZX 2DH 240×45电热恒温干燥箱,上海跃进医疗器械厂;BCD 2201F /HC 容声冰箱;电热恒温水浴箱,北京市医疗设备厂;RE52299旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;F A2004分析天平,上海精密科学仪器有限公司;LDZ522低速离心机,北京医用离心厂。

112　试剂与材料　乙醇、乙醚、蒽酮、甘露糖、L 2(+)鼠李糖、D 2果糖、D 2半乳糖、D 2葡萄糖等均为国

产AR 级,实验用水为去离子水。飞龙掌血采自张

家界,经吉首大学廖博儒研究员鉴定。2　方法

211　多糖含量测定　用蒽酮试剂显色,紫外分光

光度法测定样品中多糖的含量

〔6〕

。

21111　标准曲线制备:称取105℃真空干燥至恒

重的葡萄糖100120mg,配成1100mg/mL 葡萄糖水溶液。各取015、1、115、2、215、3mL 于6个25mL 容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度。各取1mL 于刻度试管,冰浴中加入5mL 蒽酮试剂,沸水浴10m in,冷却后测A 624nm ,以吸光度A 为纵坐标,葡萄糖浓度C 为横坐标进行线性回归,得方程:A =518929C -01002(r =019998)。

21112　样品测定:取样品溶液适量,按“21111”项

下方法测定糖含量,按公式:多糖得率(%)=[粗多

糖重量(g )/原料重量(g )]×100%,计算粗多糖的得率

〔7〕

。

212　多糖提取　称取适量飞龙掌血粉末,加入一

定量的提取剂进行浸提,以提取剂与原料质量比、提取时间、提取次数及提取温度等为因素进行考察,在单因素实验的基础上进行正交试验,以优化提取参数。

213　多糖的纯化及组分分析