分子生物学设计性实验

分子生物学设计性实验

----实验报告

实验课题：EcoRV和Pvu II限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割

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指导老师：

实验时间：

实验单位：

Digestion of plasmid DNA with EcoRV and Pvu IIrestriction

endonuclease

----Digestion of pUC19-P35S:ARF8 with EnzymeEcoRV and Pvu II

(JinhongChen)

From School of Life Sciences ,Guangzhou University

EcoRV和Pvu II限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割

----EcoRV和Pvu II限制性核酸内切酶对pUC19-P35S:ARF8切割广州大学生命科学学院2014级生物科学专业方向

摘要：为加深对限制性内切核酸酶切割质粒DNA的位点特异性和其专一性的认识，

采用EcoRV和Pvu II两种酶双酶切割质粒DNA，从而验证不同限制性核酸内切酶对质粒DNA具有不同的切割结果。本实验通过用EcoRV和Pvu II限制性核酸内切酶共同对pUC19-P35S:ARF8进行切割，再用1%琼脂糖凝胶电泳加以分离，得到电泳图谱，对照分子量标样加以鉴定。结果出现了6个DNA条带，大小分别为862bp、1581bp、176bp、1305bp、686bp、2366bp，结果与预期不一致，发现EcoRV酶有两个酶切位点。

关键词EcoRV和Pvu II内切酶pUC19-P35S:ARF8 切割琼脂糖凝胶电泳

引言

限制性核酸内切酶主要存在于原核生物，它能将外来的DNA 切断，即能够限制异源DNA 的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA 却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。它不同于一般的脱氧核糖核酸酶（DNase），限制性核酸内切酶的切点大多很严格，要求专一的核苷酸序列。限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。限制性核酸内切酶按其性质可分为三大类，即所谓Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型酶。[1]其中Ⅰ型和Ⅲ型水解核酸要消耗ATP，它既特异性切割核酸又能给特殊碱基加上甲基基团进行修饰，但特异性弱，切割位点不固定，Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子, 然后从底物上解离；Ⅱ类由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶(限制酶)，它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ型水解核酸不需要消耗ATP，它只特异性切割核酸并不修饰碱基，其特异性强，切割位点固定，Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。。

[2]限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。本实验可加深对限制性内切核酸酶切割质粒DNA的位点特异性的认识，通过实践充分了解EcoRV和Pvu II两种酶双酶切质粒DNA产生的片段。没有限制性核酸内切酶的发现和应用，就没有分子生物学的兴旺发展，在基因工程和分子生物学中，限制性核酸内切酶起着其足轻重的作用。限制性核酸内切酶均来源于原核生物，用于抗击外来DNA的入侵。限制性核酸内切酶，能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA的酶，是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。因此研究限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割具有重要的意义。

限制性核酸内切酶是一种可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶[3]。约翰霍普金斯大学的丹尼尔·那森斯、汉弥尔顿·史密斯与伯克利加州大学的沃纳·亚伯因为限制性内切酶的发现与研究而获1978年度的诺贝尔生理学奖，开创了分子遗传学的新篇章[4]。目前，限制性内切酶的酶切技术因其操作简单和快速等优点广泛应用分子生物学等领域。双酶切更为广泛应用于载体构建等分子生物学实验，因为单酶切后连接目的基因理论上会出现50%可能的错误性，而双酶切后的不同劲性末端在一定程度上避免单酶切的不足[5]。

分子生物学实验中，基因的重组与分离涉及到一系列的酶促反应。许多种酶在基因克隆实验中有着广泛的用途。多种细菌能合成限制性核酸酶，这是它们保护自己，降解外来DNA分子的重要手段。每一种内切酶能识别DNA分子中由4～6个核苷酸组成的特定序列。而细菌细胞内的DNA则由于相应序列上的A或C碱基的甲基化而不被攻击，可是外源DNA一旦进入细胞立即被识别，双股DNA螺旋都被切断。限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。本实验旨在探究EcoRV和Pvu II内切酶共同对质粒DNA切割的作用，从而进行合理的组合以获得最好的切割，为后续的研究提供理论支撑。

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验材料

1.1.1.1 重组质粒pUC19-P35S:ARF8由广州大学生命科学学院生化楼分子生物学实验室构建（图1）；

1.1.1.2 限制性内切酶：Hind III（购自BBI公司）；Pvu II、EcoR V（购自Beyotime公司）；Sph I、Pst I、Xba I、EcoR I、Pvu I（购自Promega生物工程公司）；

1.1.1.3琼脂糖(Agarose): 进口分装。

1.1.2 设备

1.1.

2.1 电泳仪（DYY-6C型，购自北京市六一仪器厂生产）；

1.1.

2.2 微量移液枪0.1-2.5ul、0.5-10ul、5-50ul，购自北京市六一仪器厂；

1.1.

2.3 ECFOII手掌型离心机购自碧云天生物技术研究所；

1.1.

2.4 EDC-810基因扩增仪、微波炉、台式高速离心机，水平式电泳装置, 凝胶成像系统等。

1.1.3 试剂

1.1.3.1 5×TBE电泳缓冲液；

1.1.3.2 6×电泳载样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃；

1.1.3.3 溴化乙锭(EB)溶液母液：将EB配制成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可；

1.1.3.4 DNA分子量标准：从小到大为100 bp、250bp、500 bp、750 bp、1000bp、2000bp。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA酶切反应

1.2.1.1 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.2ml)编号, 用微量移液枪分别加入质粒DNA 0.5μl和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液R buffer 2μl, 再加入重蒸水(ddH2O）使总体积为19μl, 将管内溶液混匀后分别加入0.5μl PvuII酶液和0.5μl EcoR V酶液, 用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下, 使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键, 要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。

1.2.1.2 混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37℃水浴保温2-3小时，使酶切反应完全。

1.2.1.3 每管加入5μl loading buffer 混匀，并离心后待上样。

1.2.2 琼脂糖凝胶的制备

1.2.2.1 取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液，待用。

1.2.2.2 胶液的制备：

称取0.6-0.7 g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液，放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为1％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜, 以减少水份蒸发。

1.2.2.3 胶板的制备：

将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。

用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧, 待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内, 使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低, 否则凝

固不均匀, 速度也不可太快, 否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子, 注意不要损伤梳底部的凝胶, 然后向槽内加入0.5×TBE 稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起, 阻碍缓冲液进入样品槽中，所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。

1.2.3 电泳分离DNA 片段

1.2.3.1 加样：先用微量移液枪吸取DNA Marker 5μl 在第一个上样槽上样，再用微量移液枪吸取10μl 酶解液小心加入另一个上样槽中。若DNA 含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换枪头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

1.2.3.2 电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V ,电流在40mA 以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm 时，停止电泳。本次实验电泳时间为100V 电压下40min 。

1.2.3.3 观察和拍照：在波长为254nm 的长波长紫外灯下观察已加有EB 的电泳胶板。DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。

2.结果与分析

双酶切质粒DNA 电泳图谱观察，结果如下图：

图一 限制性核酸内切酶Pvu Ⅱ和EcoR V 对质粒pUC19-P35S:ARF8的双酶切电泳图谱

（泳道M ：DNA Marker 泳道4：本实验的酶切图谱）

2.1 结果：

如图一所示，经琼脂糖凝胶电泳后，被切割的质粒DNA 依据分子量的大小获得不同的迁移速率，从而相互分离，形成黑白相间的条带。其中M 泳道是DNA Marker 电泳后片段分离的结果，其标准分子量大小由上至下分别为2000bp 、1000bp 、750bp 、500bp 、250bp 、100bp ；第21个泳道为未酶切的完整质粒DNA ，可见其有两个DNA 条带，可能是线性DNA ，也可能是其他杂质；泳道4是本次实验限制性核酸内切酶Pvu Ⅱ和EcoR V 共同对质粒pUC19-P35S:ARF8切割所得到的结果，酶切图谱显示，该两种限制性核酸内切酶对质粒DNA 切割出了6个DNA 条带，由上至下分别为2366bp 、1581bp 、1305bp 、862bp 、686bp 、176bp ；其中有四个条带是Pvu Ⅱ酶切割出来的结果，而另外两个条带是EcoR V 酶切割出来的结果，与预期的结果并不一致，预期得到的结果是会出现5个DNA 条带，其片段大小分别为：176bp 、862bp 、1305bp 、1581bp 、2366bp ，但实际实验结果出现了6个DNA 条带，且片段大小不能与预期值一一对应，说明EcoR V 酶对质粒pUC19-P35S:ARF8切割可能不止一个酶切位点，或者切割得不完全。因此实际试验得到的结果与预期值并不符合。整体DNA 条带清晰整齐，没有重叠，亮度也适宜，说明加样量也适宜，但质粒DNA 被酶不完全切割。 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 M 22

2000bp

1000bp 750bp

500bp

250b p

100bp

2.2 分析：

本实验所用质粒DNA pUC19-P35S:ARF8为一6290bp的环状DNA分子。根据限制性内切核酸酶特性可知，PvuⅡ和EcoR V酶为第Ⅱ类酶，可以切割某一特异的核苷酸序列，是重组DNA的基础。本实验中PvuⅡ在质粒pUC19-P35S:ARF8上有4个识别位点，完全酶切可把质粒DNA切割成4个分子量大小不同的片段，其识别位点分别在2057bp,4500bp,4676bp,5981bp处。本实验中EcoR V 酶在质粒pUC19-P35S:ARF8理论上有1个识别位点，完全酶切可把质粒DNA切割成1个DNA片段，识别位点在2919bp处。PvuⅡ和EcoR V两种酶所识别质粒DNA位点都不一致，因此两种酶对质粒pUC19-P35S:ARF8进行双酶切可产生5个大小不同片段，大小分别为：176bp、862bp、1305bp、1581bp、2366bp。

泳道5为单一的PvuⅡ酶对质粒pUC19-P35S:ARF8切割所得的酶切图谱，其片段大小分别为2443bp、2366bp、1305bp、176bp，与其相比较，发现本次实验结果只有三个片段能和单一的PvuⅡ酶切割同一质粒的片段大小相符合，实际上这两种酶切割质粒DNA所获得的片段大小分别为：2366bp、1581bp、1305bp、862bp、686bp、176bp；可能出现这种结果的原因是：

（1）EcoR V酶切割质粒DNA存在不止一个酶切位点或切割得不彻底；

表1 DNA切割不彻底的原因及解决方法

（2）其它内切酶污染；解决方法:用λDNA作底物检查酶切结果。

（3）底物中含其它DNA杂质；解决方法：电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段。

基于猜测EcoR V酶切割质粒DNA存在不止一个酶切位点，假设另外一个酶切位点是真实地存在，并将其设定在可能会出现的位置，在酶切不完全的情况下，经过计算，可初步推测EcoR V酶的另一个酶切位点应该是在2743bp处，因此，此时质粒上有6个酶切位点，两种酶共同切割质粒而且是不完全切割后，所得到的DNA片段应该为2366bp、1581bp、1305bp、862bp、686bp、176bp，恰好与酶切图谱相一致，从而得知EcoR V酶对该质粒的另一个酶切位点可能在2743bp处，但推断还需进一步进行多次试验验证，而且只有不完全酶切只限定于EcoR V酶对质粒DNA 2743bp处的位点，而其他酶切位点都正常工作的条件下，才有发生这种情况的可能，不完全酶切可能的原因如上表1。除此之外，琼脂糖凝胶的浓度也能影响DNA条带的分布，一般来说，DNA片段越小，胶的浓度需要大些，原因就是胶的浓度越低，形成的孔径就越小，这样才能将各种不同小片段的DNA分离开来，并达到一定的精确度。分子生物学实验手册有对应的表格：

3.讨论

不同限制性核酸内切酶需要的缓冲液Buffer类型是不一定相同的，而不同类型的Buffer的离子浓度不同，会影响限制性内切酶酶切效果，并且酶的种类、质粒的浓度、纯度和酶切时间等因素都可能对酶切效果产生重要影响。例如质粒中含有过多的酚、酒精、氯仿、EDTA、变性剂或过多盐离子的污染都会影响质粒质量，引起酶切不完全或者星活性的产生，而质粒浓度过高、酶浓度量过低或者不适当的限制性酶的保存和应用都可能造成酶切不彻底。另外，有些限制性核酸内切酶是需要加入BSA的，BSA是一种牛血清白蛋白，可以通过提高溶液中蛋白质的浓度，防止酶的分解和非特异性吸附，减轻某些酶的变性，从而对酶起保护作用，广泛应用于限制性内切酶酶切反应实验中[6]。酶切时间过长，会出现星活性现象。星活性是反应条件不同而产生的切断与原来认识序列不同的位点的现象，多由于酶切时间延长等因素。

影响实验结果的因素：DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。

处理方法：当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。

同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。

使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。

酶切反应建议：

一、建立一个标准的酶切反应

目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可

降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。

二、选择正确的酶

不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。

三、酶

内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。

四、DNA

待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。

五、缓冲液

对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。使用时的缓冲液浓度应为10X。有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性。在这种情况下，我们也相应提供100X的BSA（10mg/ml）。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。

六、反应体积

内切酶活力单位的定义是：1小时内，50μl反应体积中，降解1μg的底物DNA所需的酶为一个活力单位。因此酶：DNA的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%（一般酶都贮存于50%的甘油中）。

七、混合

这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡！

八、反应温度

大部分酶的反应温度为37℃；

九、反应时间

1酶活单位的定义时间为1小时。如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间；反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到完全。

十、终止反应

如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。在NEB我们使用如下反应终止液：50%的甘油，50mM EDTA（pH8.0），和0.05%溴酚蓝（10μl/50μl反应液）。如果要进行下一步酶切反应，可用热失活法终止反应（65℃或85℃，20分钟）。热失活并不能适用于所有的酶。此外，酚/氯仿抽提也可以用于终止反应。

十一、对照反应

如果发现您的DNA底物不能被成功切开，可以进行对照实验以查明原因。具体方法如下：将不加内切酶的底物DNA（待切底物）与加入了内切酶的对照DNA（有多个已知酶切位点）同时进行反应。若实验结果表明底物DNA降解，则说明DNA在纯化过程中或反应液里引入了核酸酶污染；若实验结果发现底物DNA保持完整，而对照DNA被成功切开，则可以排除酶质量的原因，此时可以将对照DNA和待切底物DNA混合起来再次进行反应，以确定样品中是否有抑制剂。如果有抑制剂存在（通常是盐、EDTA或酚），则混合物里的对照DNA也无法被切开。

参考文献

[1].陶志坚.限制性核酸内切酶相关知识总结.学知报.2011,01(8):1-3.

[2].王智新，王昌留.限制性核酸内切酶及其显带研究进展.鲁东大学学报[J].2011，27( 2) : 154—157.

[3] Manna S, Harman A, Accari J, et al. Altering the selection capabilities of common cloning vectors via restriction enzyme mediated gene disruption [J] . BMC Res Notes,2013，6：85.

[4]Stevens M, Cheng J B, Li Daofeng, et al. Estimating absolute methylation levels at singl-CpG resolution from methylation enrichment and restriction enzyme sequencing meth- Ods[J] . Genome Res,2013,23 (9):1541一553

[5]Zhang Lei, Hendrickx T L, Kampman to support low temperature anaerobic nioipal sewage in a UASB-ligesterr [J]Bioresour Technol,2013，148:560一566

[6]Wu Aizhi, Lin Chaozhan, Zhai Yajing, et al.Investigation ofthe interaction between two phenylethanoid glycosides and bovine serum albumin by spectroscopic methods [J]. J Pharmaceutical Analysis, 2013,3(1):61-65

附件：

图1

实验室所提供的限制性核酸内切酶信息：（红色高亮提示该酶含量较少，谨慎选择！）

试剂公司建议酶使用反应体系：