基于Erns基因的猪瘟病毒一步法_省略__PCR快速检测方法的建立和应用_于新友

养猪SWINE PRODUCTION 2014第6期基于Erns 基因的猪瘟病毒一步法RT -PCR

快速检测方法的建立和应用

于新友1，李天芝1，王金良2，李峰2，沈志强1，

2

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，

山东滨州256600）中图分类号：S858.285.3文献标志码：A 文章编号：1002-1957(2014)06-0093-03

摘要根据猪瘟病毒Erns 基因保守序列设计了1对引物，建立了检测猪瘟病毒一步法反转录-聚合酶链（RT-PCR ）方法，并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR 对CSFV 扩增结

果为阳性，对照毒株扩增结果均为阴性；对猪瘟病毒检测的灵敏性为10pg 总RNA 量。以上结果表明，该一步法RT-PCR 特异性强、敏感性高、简便、快速，可用于猪瘟的早期确诊和病毒鉴定。关键词猪瘟病毒；一步法RT-PCR ；检测Establishment and Application of a One-step RT-PCR Assay for Detection of CSFV on Erns Gene

YU Xinyou 1,LI Tianzhi 1,Wang Jinliang 2,Li Feng 2,SHEN Zhiqiang 1,2

(1.Shandong Lvdu Bio-Industry Co.,Ltd.,Binzhou 256600,China;

2.Animal Science and Veterinary Medicine Academy,Binzhou 256600,China)

Abstract A one-step RT-PCR assay for detection of CSFV was established using a pair of primers based on the Erns gene of classical swine fever virus (CSFV).and the specificity,sensitivity were studied.This method specifically amplify a fragment from CSFV,but not from control virus.with a detection limit of 10pg RNA of CSFV.Therefore the established one-step RT-PCR technique provided a sensitive,specific ，fast and reliablemethod for diagnosis and epizootic study of the CSFV.

Key words classical swine fever virus (CSFV);one-step RT-PCR;detection 收稿日期：2014-11-09基金项目：山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目（SDAIT-06-011-14）作者简介：于新友（1983-），男，山东菏泽人，助理研究员，硕士，主要从事动物传染病诊断技术研究.E-mail:yuxinyou_2006@https://www.360docs.net/doc/567706414.html,

猪瘟（classical swine fever ，CSF ）是黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒（Classical swine fever virus ，CSFV ）引起的一种猪急性、热性、高度接触性传染病[1]，在

世界范围内广泛流行，其发病率和死亡率均高，

对养猪业危害十分严重[2]。世界动物卫生组织（OIE ）在《国际动物卫生法典》中将其列为法定传染病之一[3]。猪瘟与猪细小病毒（PPV ）感染、猪伪狂犬病（PR ）、猪繁殖与呼吸综合征（PRRS ）、流行性乙型脑炎等病的临床表现相类似，使猪瘟的临床诊断变得十分困难。而且，CSFV 同属的成员还有牛病毒性腹泻病毒（bovine viral disease virus ，BVDV ）和羊边界病病毒（border disease virus ，BDV ），由于属内病毒之间基因组同源性很高，所以编码的病毒蛋白基本相同，在血

清学上存在交叉反应，因此没有办法通过血清学进行区分[4-5]。近年来，尽管已将RT-PCR 方法用于猪瘟病毒的检测和鉴定，但该法需要先进行反转录试验，然后再进行PCR 扩增试验，依然比较繁琐。本研究根据GenBank 公布CSFV （JX975456），针对具有很高保守性的Erns 基因设计1对特异性引物，建立了一种特异、敏感的CSFV 检测方法，旨在为CSF 的早期诊断、流行病学调查等提供一种有效的分子生物学检测方法。1材料和方法1.1病毒株与病料

猪瘟病毒（CSFV ）、猪蓝耳病病毒（PRRSV ）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV ）、猪细小病毒（PPV ）、猪伪狂犬病病毒（PRV ）、流行性乙型脑炎病毒（JEV ）由山东省滨州畜牧兽医研究院预防兽医学与动物生物技术重点开放实验室保存，临床检测病料为2012年9月至2014年9月采自山东省各地猪场临床诊断为

CSFV 感染猪的扁桃体、

淋巴结、脾脏等。93

1.2工具酶及试剂盒

pMD18-T载体、限制性内切酶、PCR相关试剂、DNA Marker、DNA凝胶回收试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司。

1.3RT-PCR引物设计与合成

应用Primer Premier5.0基因分析软件，参照GenBank中登录的CSFV Erns基因序列（JX975456）设计1对引物，扩增CSFV Erns基因片段大小为518bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。上游引物：5′-ACAACGGCACTAATGGTA-3′，下游引物：5′-TAGGTACAGAGCTGCGTC-3′。

1.4病毒基因组RNA的提取

按AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒使用说明书提取CSFV的RNA，并提取其它几种病毒的核酸。

1.5CSF Erns基因的一步法RT-PCR扩增及条件优化

以RNA为模板进行一步法RT-PCR扩增，反应体系为20μL。各参数为50℃逆转录30min，95℃预变性3min，然后进入95℃20s、56℃20s、72℃20s循环，共35个循环，最后72℃延伸10min。取5μL产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳。同时对各扩增条件进行优化，包括退火温度（50～60℃梯度温度，每2℃为1个梯度）、引物浓度（0.1～1.1μmol/L，每0.2μmol/L为1个梯度）等，反应体系均为20μL。

1.6PCR扩增产物的检测及鉴定

首先取扩增产物5μL在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，利用凝胶成像系统扫描进行初步鉴定。然后用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。将目的片段与pMD18-T克隆载体于16℃过夜连接，转化感受态菌株DH5α。挑取单个的转化菌落，加LB溶液培养18h后，用质粒提取试剂盒抽提质粒DNA用PCR方法进行鉴定，将阳性克隆送上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定。将测序结果与参照的CSFV序列同源性比较。

1.7特异性试验

分别提取CSFV、PRRSV、BVDV、PPV、PRV、JEV 的核酸，用已建立的方法进行扩增。

1.8敏感性试验

CSFV提取RNA后定量，然后10倍梯度稀释提取的病毒基因组RNA，使其分别相当于含有100 ng RNA、10ng RNA、1ng RNA、100pg RNA、10pg RNA、1pg RNA的含量，分别进行一步法RT-PCR 检测，确定其敏感性。

1.9重复性试验

用建立的一步法RT-PCR检测方法，对PRRSV、BVDV、PPV、PRV、JEV、健康猪肠道组织及猪瘟3份阳性病料和3份阴性病料，重复检测3次，以验证本方法的重复性和稳定性。

1.10临床样品的检测

取疑似送检病料120份，利用建立的一步法RT-PCR方法进行检测，对扩增产物全部进行测序鉴定，并利用生物学软件BLAST进行序列分析。

2结果与分析

2.1扩增产物的检测及鉴定

2.1.1扩增产物的检测PCR扩增产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳，扩增产物在518bp处可见特异性扩增条带，与预期大小相符（图1）。

2.1.2扩增产物的测序鉴定挑取PCR鉴定正确的阳性菌液送上海生工生物工程股份有限公司测序。测序结果表明，插入到T载体的基因片段的核苷酸序列与CSFV（登录号：JX975456）的序列相似性为100％。

2.2特异性试验

利用所设计的引物及所确定的最佳反应条件分别对CSFV、PRRSV、BVDV、PPV、PRV、JEV的RNA 进行一步法RT-PCR。结果6个毒株中只有CSFV RNA能扩增出目的片段，大小为518bp（预期为518 bp），而其它毒株均未扩增出相应的片段（图2）。说明本研究建立的方法特异性好。

2000bp

1000bp

750bp

500bp

250bp

100bp

518bp

图1CSFV扩增结果

M为DL2000Marker，

1为CSFV一步法RT-

PCR扩增结果。

M1

M123456

M为DL2000Marker，1为CSFV扩增结果，2为PRRSV扩增结果，3为BVDV扩增结果，4为PPV扩增结果，5为PRV扩增结果，6为JEV扩增结果。

图2特异性试验

2000bp

1000bp

750bp

500bp

250bp

100

bp

518bp

2014

养猪SWINE PRODUCTION(6) 94

2000bp 1000bp

750bp 500bp 250bp 100bp

M

1

2

3

4

5

6

M 为DL 2000Marker ，1为100ng RNA ，2为10ng RNA ，3为1ng RNA ，4为100pg RNA ，5为10pg RNA ，6为1pg RNA 。

图3敏感性试验

518bp

2.3敏感性试验

取5μL PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，分别在约518bp 附近出现特异性条带，与预期产物大小相符。从结果可以看出，引物的一步法RT-PCR 检测灵敏度可以达到10pg RNA

（图3）。2.4重复性试验

经过3次重复操作，结果一致，说明建立的方法是稳定、可靠的。2.5临床样品的检测

用建立的CSFV 一步法RT-PCR 检测方法，共检测了120份在不同地方采集的猪病料，检出阳性样品75份。3讨论

传统CSFV 诊断方法如病毒分离鉴定、免疫电镜法（IEM ）、免疫荧光法（IF ）、微量血清中和试验和

ELISA 法，

操作繁琐，诊断时间长，结果重复性不好。限制了传统方法在实际中的应用。RT-PCR 检测方法具有特异、敏感、简便、快捷等特点，能在数小时内检出病原。因此，建立一种快速、简单、敏感的CSFV 一步法RT-PCR 检测方法十分必要。

本试验对GenBank 公布的CSFV 基因序列进行比对发现，CSFV Erns 基因相对比较保守，查找出其高度保守区域，参照GenBank 中登录的CSFV 基因序列（JX975456）利用Primer Premier5.0设计1对引物，通过一步法RT-PCR 扩增出目的基因，连接到pMD18-T 载体，送样测序，对测序结果与模板序列进行比对，其同源性为100％；对退火温度优化发现，只有当退火温度值为56℃时，才能获得较为理想的产物，即使相差2℃也不能获得理想的试验结果。对进行引物浓度优化，在引物浓度为0.1～1.1μmol/L 时对PCR 扩增效率的影响不大，在0.7μmol/L 时扩增效率相对较高，而在1.1μmol/L 时扩增效率相对较差。敏感性试验结果显示，引物的检测灵敏度可以达到10pg RNA 。特异性试验结果显示，本试验所建立的双重RT-PCR 检测CSFV 的方法能够扩增出518bp 目的片段，而对常见的猪病病毒如PRRSV 、BVDV 、PPV 、PRV 、

JEV 均无扩增产物，证明本方法具有很好的特异性。用建立的CSFV 一步法RT-PCR 检测方法，共检测了120份在不同地方采集的猪病料，检出阳性样品75份。

本试验建立的CSFV 一步法RT-PCR 检测方法与传统的CSFV 两步法RT-PCR 检测方法相比具有操作简单，不需要单独做反转录，反转录与

PCR 扩增一步完成的优点。本方法敏感性高、

特异性强、快速简便、检测成本低，具有良好的市场应用前景；方便、实用，更适合基层兽医工作者使用。因此本试验所建立的方法为猪瘟的诊断、流行病学调查等提供一种简单、快速的分子生物学诊断方法。参考文献

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Dtsch Tierarztl Wochenschr,1995,102（1）:56.

（编辑：柳青）

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于新友，等.基于Erns 基因的猪瘟病毒一步法RT-PCR 快速检测方法的建立和应用2014第6期95