细胞蛋白提取方法
单层贴壁细胞总蛋白的提取
1.倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2.每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
3.【配制裂解试剂，现用现配制】按1ml RIPA + 25μl PMSF（100mM）+110μl Pi（PhosSTOP磷酸酶抑制剂），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）
4.每瓶细胞加100 μl的裂解液，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5.裂解完后，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行）
6.于4℃下12000rpm离心15min。（提前开离心机预冷）
7.将离心后的上清分装转移倒0.6ml的离心管中放于-80℃保存。
PhosSTOP磷酸酶抑制剂（stock solution）配制方法：1片PhosSTOP+1ml RIPA，充分溶解后按110ul封装9管。-20℃保存有效期6月，4℃保存有效期1月。
BCA法测定蛋白浓度
检测试剂准备：
1．BCA工作液（室温）
2．RIPA（1ml）（4℃）
3．蛋白工作液（0.5mg/ml）（4℃）
4．96-Well板
5．冰盒
6．待测样品（4℃）
操作步骤：
1. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。
2. 标准孔加样
3. 待测样品稀释20倍，19μl RIPA + 1μl（待测样品）
4. 测定本底，20μl RIPA加3孔，取平均值。
5.各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置20分钟。
细胞组织裂解(提蛋白)方法
第一种方法 蛋白匀浆缓冲液： 50 mM Tris-HCl (pH7.5) 150 mM NaCl 5 mM EDTA 1 % NP-40 1 mM PMSF 操作步骤 直接用这个进行组织匀浆 然后于10000 rpm 离心20分钟收集上清 作SDS－PAGE电泳从染色的情况来看所得到的总蛋白纯度都不错条带比较清晰。我是作的小鼠八种常规组织也包括肾脏在内。 将抽提好的蛋白分装后直接放在负八十保存。上样大概3~8ul每孔都可以的具体看个人需要。70v浓缩，150v分离 第二种方法 裂解液配方： 尿素：8M CHAPS:4% DTT:65mM(现加）PMSF:1mM(现加）MiliQ 水操作步骤： 取300mg样品在液氮环境下研磨， 加入1ml裂解液混匀， 室温静置1小时（实验证明改为匀浆更好，蛋白降解轻）， 15000g离心1小时， 取上清测定蛋白质浓度。 在裂解液中加IPG buffer有两个作用:1,增强蛋白质的溶解性2,可以结合核酸,在沉淀的时候予以
除去。建议最好加，浓度从0.5-2%不等（这取决于您样品蛋白质的难溶程度）。IPG buffer 是载体两性电解质，IPG buffer另外一个作用是促进蛋白质溶解的,所以IEF前一定要加，裂解液中没有IPG buffer可以么？ （可以的，最后上胶条的时候可以再加） 不过，我觉得液氮研磨以后，最好是粗离心一下，把一些结缔组织给离心掉（150g既可）然后再加裂解液。裂解液加1ML应该没什么问题，主要取决你以后蛋白的浓度。用这个方法最好经丙酮沉淀一次比较好） 第三种方法 建议最好加完裂解液后再用超声波破碎，我做肝脏蛋白提取时一般采取400W工作10秒，间歇10秒，次数15次，一次结束后大约30分钟再重复上述步骤一次（因为不同的样品用一根超声柱子，可能会导致污染，所以一定要用双蒸水冲洗干净，再用70%乙醇洗一下，再用水洗一次），另外样品超声时要置于冰浴中，以免产热 做过的是用10ml蛋白裂解液来匀浆3克的组织，最终用考马斯亮兰染色法测得的蛋白浓度大概为30~50 ug/ul 测595 OD值时，设定一个只用水的空白，把所有测得的值都减去这个空白。再用减后的值做标准曲线。查得未知蛋白浓度时，也要用减后的值在标准曲线上查得。 培养细胞 细胞培养于100 mL/L FCS+RPMI1640培养基中，待生长至对数生长期密度约为80%时用细胞括括下细胞离心收集．按细胞/裂解液体积比1:10加入细胞裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫
蛋白提取步骤
提蛋白及WB的步骤 整个过程细胞或蛋白都必须放冰上 准备工作：前一天准备：借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂是否充足、 当天准备：洗玻璃板、开紫外，冰块、碎冰、标记离心管及离心管、细胞刮板、 开低温高速离心机 细胞裂解液配制： 1ml cell lysis 10ul NP-40（离心机后） 25ul 焦磷酸钠 40ul NaF 1ul β-甘油磷酸 2 ul Na3VO4 1ul 蛋白酶抑制剂（用完即放回冰箱） 10ul PMSF（最后加，随加随用，有毒） 细胞裂解和收集 1.观察细胞状态，并准备提蛋白：吸走培养基、用PBS洗细胞两次（倾斜贴壁加PBS，左 右轻轻摇），倾斜贴壁吸走PBS。 2.将细胞盘拿到外间冰上，加裂解液（体积网上推荐：一般106加），冰上静置1-2min。 3.刮细胞：细胞刮板每次用之前拿水涮一涮，甩干，然后从中间到外面打圈刮，再从下往 上，从上往下全面刮，（刮的时候要迅速），最后用枪吸取裂解液至离心管。 细胞破碎 4.超声波破碎细胞：准备三个小烧杯，加满冰块，三个小夹子。（超声波破碎仪的铁棒不 要碰到离心管的壁和底部） 超声波设置： 工作功率5% 工作时间3min 开机时间15s，关机时间30s 温度0度， 报警温度1度 5.4℃、13000r/min，离心15min。（离心机用后一直保持打开的状态，） 蛋白保存 6.蛋白保存及分装：吸上清液至离心管，涡旋、吸一半至另一个管中，涡旋。-80℃保存。注意事项：PMSF一定要现用现加，PMSF在水溶液中不稳定，30min内就会降解一半。样品处理超过1h，补加一次。
BCA测定蛋白浓度 1、测空白板，选差异较小的孔。 BCA测定法波长570，Bracford：595 2、标准蛋白的稀释（5mg/ul）：分装1ml PBS来使用，稀释标准蛋白至ul。 取5ul标准蛋白+45ul PBS 3、加样： 浓度0 BSA（ul）0481216 PBS（ul）20161284 4、样品蛋白稀释20倍：2ul蛋白+18ul PBS 5、配BCA：每个孔200ul，一个样品2个重复，A:B=50:1,根据样品数来计算BCA的用量， 一般防止损耗，多算一个样。 6、加BCA：悬空加、37℃孵育30 min。（手不能碰板的底部，影响测定结果） 7、计时30min 8、配分离胶，灌胶，加水封。 9、计时20min。 10、测蛋白：先振板、再设置参数。 11、计算上样体积: 12、配浓缩胶，灌胶，加梳子，等1-2min，出现缩胶的地方补上。 13、打开干式加热器 10、蛋白质上样：根据计算结果乘以稀释倍数，算出蛋白浓度，以体积最大的为准，其他用 水补足。(最大上样量为20ul，除去buffer的体积，蛋白质最大上样体积为16ul) 标记离心管 加样顺序：水、buffer(1/4)、蛋白、离心-涡旋-离心。100℃变性10min（迅速，确保变性程度一致） 11、计时10min ，变性10min。 12、安装电泳槽: 电泳液（1X）：配制：90ml（10X）+810ml水（只能用一次） 液面刚覆盖胶，不能有气泡。 13、上样：maker 上样量为3ul。依次上样（吸样品时最好一次吸完）枪头不能撬板，笔直打进去 14、电泳 分离胶100V，20min左右、条带都跑开即可。 浓缩胶145V 1h 有等紫色部分跑到底结束。 转膜 准备工作：转移缓冲液(只能用2次)、三层滤纸、海绵、PVDF膜 PVDF膜用之前用甲醇浸泡数秒。 用海绵和滤纸之前先浸湿。 转膜：负极（黑板）海绵-三层滤纸-胶-PVDF膜-三层滤纸-海绵-正极（白板）。 三层滤纸和膜都需要赶气泡。
细胞的总蛋白质提取全过程及经验
细胞的总蛋白质提取全过程及经验 如果你要自己裂解细胞的时候，需要注意的事项：师兄给你的细胞要赶紧裂解，当然了，你还要看是带瓶子给你还是消化好给你的。一般我使用的时候，是将细胞统一从几个培养瓶中消化收集起来，然后赶紧4度下离心，用预冷的PBS 或者生理盐水洗涤细胞。也有人喜欢在培养瓶中直接加裂解液，这个一般都是做western什么用的，需要的蛋白量不是很多，而且大部分时候都是要有活性的蛋白的。一般1000rpm足够离心了，转速太快，细胞会破碎，然后会损失蛋白。PBS洗涤的最后一遍，记得将细胞转移到超声管中，也许是由于普通的10mL离心管有可能承受不了超声的能量吧，我们师兄师姐一般都用超声管来自装细胞，然后加入裂解液直接超声。3s每次，间歇3s60次，400W，重复工作复位2次，总共超声180次就差不多了。裂解后的细胞要赶紧在2500g下离心30-60min，超声管是没有盖子的，可以直接在上面加一层封口膜离心。在离心的时候，去配制沉淀液，丙酮：无水乙醇：冰乙酸=50:50:0.1，体积比。一般我加的是裂解液体积的5倍。沉淀液要预冷，我喜欢将沉淀液放在-20度下。细胞离心后，上清液加入到沉淀液中，就会看到比较多的白色沉淀出现，-20度沉淀>2h，然后就可以高速沉淀下蛋白了。这里我们用的体积比较大，一般的离心管不能用，要用beckman专用的那种50mL离心管，25000g，15-30min。Beckman离心管比较大，底部是平的，所以蛋白在底部并不是很牢固，在弃去上清液的时候，一定要注意用枪头缓慢的吸出！然后用5mL做有的丙酮洗涤一遍，再用75%酒精将蛋白转移到4mL的离心管中，当然，如果你的蛋白很少，1.5mL的EPtube也可以使用。之所以用4mL是因为我每次提取的蛋白量大概>10mg，而冻干后的蛋白复溶后测定浓度，一般要求在5-6mg/mL之间，所以buffer的体积也会比较的大。这里蛋白在离心的时候，是片状的，一定要慢慢转移，防止损失，不行就多次转移，每次都将离心管离心去上清。转移后的蛋白离心除去酒精，这时候还是会有部分水分的，就在冻干机里面冻干，尽量在室温下操作。冻干后的蛋白质就可以保存起来了。然后在使用之前，测定蛋白质的浓度，如果你用了8M尿素溶解，在酶解的时候，就需要稀释到<2M，所以蛋白初始浓度不能太低。在蛋白复溶的时候，尽量在4度操作，然后一定要慢慢的加buffer，加多了就不好了，只要蛋白能完全溶解就好。完全溶解的蛋白，会有些粘稠，但是绝对不会有不溶物产生，如果产生了不溶物，就说明需要加buffer，一般复溶这一步要进行一个下午最少！
总蛋白的提取
1.单层贴壁细胞总蛋白的提取： （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2）每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4 ）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （5 ）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） （6 ）于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷） （7 ）将离心后的上清分装转移到0.5ml的离心管中放于－20℃保存。 2. 组织中总蛋白的提取： （1 ）将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 （2）加400 μL单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。 （3 ）几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 （4）裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。 3. 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取： 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取： （1 ）将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。 （2 ）弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。 （3）用枪洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 （4）将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。 含量测定
细胞总蛋白提取方法
细胞总蛋白提取方法 一、溶液配制 1.100mM NaF (NaF MW=41.99) 10ml 称取NaF 41.99mg，超纯水8ml溶解后定容至10ml。 2.100 mM PMSF 3.RIPA溶液100ml 成分分子量终浓度 Tris 121.14 0.6 g 5.0 mM (pH 7.4) NaCl 58.44 0.87 g 150 mM EDTA 372.24 37.22 mg 1 mM NP-40 1 ml 1% SDS 0.1 g 0.1% 脱氧胆酸钠0.5 g 0.5% 溶解于80 ml超纯水中，待溶解后加入HCl调pH值至7.4，定容至100 ml。 ※使用前加入 成分储存浓度加入量终浓度 PMSF 100 mM 10μl/1ml 1 mM NaF 100 mM 10μl/1ml 1 mM Aprotinin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl Leupetin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl 二、方法 1.细胞收取 1)细胞传代至60mm培养皿中，待细胞融合约100%，收集细胞 2)弃培养基，加入PBS 2ml清洗培养皿一次，弃PBS。 3)加入0.05%胰酶2ml，37℃温育1min。 4)待细胞变形后，将细胞吹下转移至一个1.5ml ependorf 管中，10,000rpm×3min，4℃ 5)弃上清，1ml预冷的PBS清洗沉淀，10,000rpm×
6)重复PBS清洗一次 7)弃上清，-80℃冻存待裂解 2.蛋白提取 1)向细胞沉淀中加入200μl RIPA缓冲液(含1mM PMS 1mM NaF、2μg/ml Aprotinin、2μg/ml Leupetin) 后冰上放置40mins 2)10,000rpm×15min，4℃ 将上清转移至一个新的ependorf 管中（约250μl）
蛋白质提取方法
蛋白质提取方法-------列举10种方法 一、植物组织蛋白质提取方法（summer） 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清夜，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8）45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 二、植物组织蛋白质提取方法(summer) 三氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm 以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品： 提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮 裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！ 三、组织：肠黏膜（newinbio） 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE 提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）倒转混匀，置室温10min 离心：12000 g，10min，4度，弃上清，加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE 用量）振荡，置室温20min 离心：7500g，5 min，4 度，弃上清 重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2 次 沉淀中加入100％乙醇2ml 充分振荡混匀，置室温20 min 离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀，1％SDS溶解沉淀 离心：10000g，10min，4度 取上清-20 度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的问题：加入1％SDS 后沉淀不溶解，还是很大的一块，4 度离心后又多了白色沉定，SDS 结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。 解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，
提取蛋白的常规方法
1、原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经 常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料， - 105 - 蛋白质提取与制备Protein Extraction and Preparation 因而对提取要求更复杂一些。 原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成 本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量 来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属 的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查 制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解 蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属 必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但 使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对 动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷 冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先 将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难 易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即 可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达 10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两 个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间
细胞的总蛋白质提取全过程及经验
细胞的总蛋白质提取全 过程及经验 The manuscript was revised on the evening of 2021
细胞的总蛋白质提取全过程及经验 如果你要自己裂解细胞的时候，需要注意的事项：师兄给你的细胞要赶紧裂解，当然了，你还要看是带瓶子给你还是消化好给你的。一般我使用的时候，是将细胞统一从几个培养瓶中消化收集起来，然后赶紧4 度下离心，用预冷的PBS 或者生理盐水洗涤细胞。也有人喜欢在培养瓶中直接加裂解液，这个一般都是做 western 什么用的，需要的蛋白量不是很多，而且大部分时候都是要有活性的蛋白的。一般1000rpm 足够离心了，转速太快，细胞会破碎，然后会损失蛋白。PBS 洗涤的最后一遍，记得将细胞转移到超声管中，也许是由于普通的10mL 离心管有可能承受不了超声的能量吧，我们师兄师姐一般都用超声管来自装细胞，然后加入裂解液直接超声。3s 每次，间歇3s 60 次，400W，重复工作复位2 次，总共超声180 次就差不多了。裂解后的细胞要赶紧在2500g 下离心30-60min，超声管是没有盖子的，可以直接在上面加一层封口膜离心。在离心的时候，去配制沉淀液，丙酮：无水乙醇：冰乙酸=50:50:，体积比。一般我加的是裂解液体积的5 倍。沉淀液要预冷，我喜欢将沉淀液放在-20 度下。细胞离心后，上清液加入到沉淀液中，就会看到比较多的白色沉淀出现，-20 度沉淀>2h，然后就可以高速沉淀下蛋白了。这里我们用的体积比较大，一般的离心管不能用，要用 beckman 专用的那种50mL 离心管，25000g，15-30min。Beckman 离心管比较大，底部是平的，所以蛋白在底部并不是很牢固，在弃去上清液的时候，一定要注意用枪头缓慢的吸出！然后用5mL 做有的丙酮洗涤一遍，再用75%酒精将蛋白转移到4mL 的离心管中，当然，如果你的蛋白很少，的EP tube 也可以使用。之所以用4mL 是因为我每次提取的蛋白量大概>10mg，而冻干后的蛋白复溶后测定浓度，一般要求在5-6mg/mL 之间，所
蛋白质提取与制备的原理和方法
蛋白质提取与制备的原理和方法 蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。 蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白 类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用 稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。 蛋白质类别和溶解性质 白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。 真球蛋白: 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。 拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出 醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇 壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液 精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱 缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤： 1、细胞总蛋白提取 A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。 B、对于贴壁细胞: a、用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。 b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。 c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。 C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 2、组织蛋白提取： A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。 B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 注意事项 1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。 2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。 3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。 5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复冻融。
蛋白提取方法
?1 材料与方法 1、1 材料 1、1、１组织与细胞得来源: ?１。1、2 仪器设备?机械组织匀浆器?低温高速离心机(＞40,０0０g) 超速离心机?超生细胞破碎仪 超纯水装置 ??1、1。3 试剂 三氯醋酸(TCＡ) 丙酮 二硫苏糖醇(DＴT) ?尿素?CＨAＰS?PMSF?EDTA ?乙醇?磷酸 考马斯亮蓝Ｒ3５0 ?抑肽素Ａ?亮肽素 试剂纯度均应就是分析纯或以上。? 1。１、４溶液配制?(1) PBS: ?NａCl８g,KCl 0、2 g,Na２HPＯ4 1。44 g,ＫH2PO4,溶于800 ml水中,用HCl调pＨ至7.4,用纯水定容至1 L; ?(2)ＥDTA 储存液: 18.61g Na2EDTA?2Ｈ２O,溶于70 ml纯水中,用10 mol/L NaOH调节ｐH值至8.0(约需2 g ＮａＯH颗粒),定容为100 ml、可高压灭菌后分装备用;?(３) 亮肽素储存液(50 μg/ｍl,100×) １0mｇ/ml溶于水,-75℃保存;使用时配成50 μg/ｍl储液,-２0℃保存; (4) 抑肽素储存液(7０μg／ml,10０×) 1 mg／ｍl溶于甲醇,—75℃保存;使用时配成７0 μg/ml储液,-2０℃保存; (5) PＭＳＦ储存液(１０ｍM,100×): １７.4mｇPMＳF,溶于１ml异丙醇中,—２0℃保存。?ＤTT储存液(1 M): ?０。31ｇDTT溶于2 ｍlＨ2O中,-20℃保存(DTT或含有DTT得溶液不能进行高压处理,可过滤除菌)。?(7) 裂解液: Lysis bufｆｅr Ａ (９M ｕｒeａ,４%ｗ/v ＣＨAＰS, 1％w／v DTT, ０.5％CA and a cｏｃktaiｌof ｐｒoteａｓｅinhibitｏrs)??Lysｉs buffer B (7 M urｅa, 2M ｔhiｏuｒea,4% w/v ＣHＡＰS, 1％w／v DTT,０、５% CA ａnｄａcocktaiｌoｆｐroteａse inhｉbitors) ?Lysｉｓbｕｆｆer C 40 ｍＭTrｉs－base (ｐH 9。5)iｎｕltrapｕｒe H2O Ｌyｓis buffer D (8 Ｍurｅa, 4％CHＡＰS, 4０mM Tris(ｂasｅ), 40 ml) ?Lyｓｉs buffer E ?(５M urea, 2 M tｈioｕreａ, 2％SB3-10, 2％CHAPS,１% w/v DTT, 0、５% CＡandａcocktａｉl ｏｆproteaｓe inhibitors) 100μL SDＳsaｍple solｕｔion (1% w/v SDＳ, 0、3７５M Ｔｒiｓ－HCl, pH8。8, 50 mM DTＴ,２5％v／ｖgly ?LysiｓbｕfｆeｒＦ? ｃeroｌ) ●CA、蛋白酶抑制剂混合物与DＴT在临用前加入。?蛋白酶抑制剂混合物［3]?成分终浓度?蛋白酶抑制剂混合物 PMSF 35 μg/ml oｒ 1 mM EDTA 0、３mg/ml (1 ｍM) 抑肽素 0。7 μg/ｍl?亮肽素 0、5μg／ｍl? 1.2 方法?1。1.1组织蛋白提取方法 １、２.1。1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1］?(1)冰上取材,称湿重,置液氮中冻存或直接进行下一步; (2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织; ?(３)将粉末悬浮于含DTT(0。2％w／v)得10％三氯醋酸(w/v)得丙酮溶液中; (4)蛋白–２0℃沉淀过夜; ?(5)35０00×g(6℃)离心30min; ?将沉淀重悬于含０.2％DTT得预冷丙酮中; ?(7)-2０℃放置1h; 350０0×g(6℃)离心30min; (9)在通风橱中让丙酮充分挥发,得到干燥得沉淀; 15℃,40000×ｇ,离心1hr; (10)在裂解液中重新溶解沉淀(5０－10０ｍg组织需要1ml裂解液); ?( ) 11 (12)用Ｂraｄｆoｒd法[2］测定上清得蛋白浓度,分装后置–75℃保存。?1、2、1。2超速离心法?(1)取材; ?(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品
蛋白-细胞核蛋白提取方法
提取细胞核蛋白的步骤： 1.向培养细胞的平皿中加入少量（保证在1.5ml TUBE内能放下）冷PBS(或1*D-Hanks) 2.，用细胞刮刀尽可能多的刮下细胞，收集到1.5ml的离心管中。 在预冷的离心机中，４度，1000rcf，1－3分钟，沉降细胞。 为尽可能多的获得细胞，可将一次离心后的上清再重复刮细胞一次； 2. 将细胞重悬于cell lysis buffer中（加入体积106细胞/200uL，体积估计方法还是没确 定,should be sufficient; 一般就是一个10cm平皿加1ml cell lysis buffer）,添加蛋白酶抑 制剂；先破细胞膜，得到细胞核（没有用B DOUNCE）； 冰上放置（不震荡，可偶尔用枪轻吹）30分钟至1小时（此时核膜没有破，有核染色为证），充分裂解； cell lysis buffer： 5mM PIPES pH 8.0 85mM KCL, 0.5% NP40, 1% protein inhibitor; 3. ４度，1000rcf，20分钟，上清为胞质蛋白（蛋白浓度比较低，如需要检测，建议先 浓缩一下），沉淀为细胞核； 此时可以将沉淀冻存于－70℃； 4. 将沉淀重悬于100-200 ul nucleai lysis buffer（体积视目的蛋白表达丰度而定，一般 50-100ul）中，添加蛋白酶抑制剂，冰上放置30分钟至1小时（每5分钟震荡一次），充分裂解；可以观察到沉淀慢慢消失，溶液变澄清； nucleai lysis buffer：成分同SDS lysis buffer； 50mM Tris-Cl pH 8.1, 10mM EDTA, 1% SDS, 1% protein inhibitor; 5. 四度，最大转速离心，10分钟以上（尽可能沉淀完全），上清即为细胞核蛋白； （此文档部分内容来源于网络，如有侵权请告知删除，文档可自行编辑修改内容， 供参考，感谢您的配合和支持） 编辑版word
蛋白质提取常用试剂及操作方法
蛋白质提取常用试剂及操作方法 一、原料选择和前处理 （一）原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 （二）前处理 1.细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。但在磨细时局部往往生热导致变性或pH 显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时。磨细剂的吸附也可导致损失。 ⑵物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。 Ⅰ.反复冻融法 于冷藏库或干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性。 Ⅱ.冷热变替法 将材料投入沸水中，于90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。 Ⅲ.超声波法 暴露于9～10 千周声波或10～500 千周超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便且效果也好，但一次处理量较小。应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在。处理一些
细胞总蛋白的制备,SDS-PAGE,WesternBlot
医学生物学研究技术与实验 实验报告 实验名称：细胞总蛋白的制备,SDS-PAGE，Western Blot 一、实验目的 1. 掌握SDS直接裂解细胞法提取蛋白质 2. 掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理 3. 掌握SDS-PAGE分离蛋白质的原理和技术 4. 掌握半干转移的操作和Western Blot 的原理和技术 二、实验原理 1. 蛋白质提取常见裂解方法极其原理。 蛋白质的抽提是指破碎过程中，将生物材料在水，缓冲液或稀盐溶液等适当溶剂中浸泡，使胞内的蛋白质等内容物释放到溶剂中。血浆，消化液和分泌液等体液中可溶性蛋白质，可不经抽提，直接进行分离。细胞内一般蛋白质的抽提，应先将细胞膜或细胞壁破碎，然后用适当溶剂将蛋白质溶出，再用离心法除去不溶物，得到出抽提液。膜蛋白的抽提比较复杂。膜蛋白按其所在位置分为外周蛋白和固有蛋白。外周蛋白通过次级键和膜外侧脂质的性头部鳌和在一起，应选则适当离子强度及PH的缓冲液，其中要好友EDTA，将其抽出。固有蛋白嵌和在膜脂质双层中，通过疏水键于膜内侧脂质层的疏水性尾部结合。在抽提固有蛋白时，要减弱器与膜脂的疏水性结合，又要使其保持部分疏水基暴露在外的天然状态，这一过程叫增溶作用。较为理想的增溶剂是去垢剂。目前用的去垢剂分为阴离子型，阳离子型，两性离子型，非离子型。增溶后的膜蛋白抽提剂有较好的均一性，便于进一步纯化。纯化后的膜蛋白，可通过透析法去除去垢剂，进行膜蛋白重组。抽提蛋白质的理想条件是尽可能促进蛋白质在溶剂中溶解，而减弱蛋白水
解酶活力，以减少细胞的自溶过程。主要是通过选择适当PH，温度，或溶剂，以及加适当蛋白水解酶抑制剂。常见裂解方法有：1 低渗裂解，2 冻融法，3 Triton100或者NP-40等非离子去污剂（比较温柔），4 脱氧胆酸钠、SDS、Triton100 （强烈），5 上样缓冲液（含SDS）＋细胞沸水浴5 min，6 匀浆器。 2. Lowry法测定蛋白质浓度 1. 蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色蛋白质-铜复合物； 2. 紫红色复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸和磷钨酸，产生深蓝色，呈色强度与蛋白质浓度呈正相关，分光光度计测A750吸光度，做标准曲线 3.SDS-PAGE分离蛋白质 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白分析中最经常使用的一种方法.它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS）及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部及肽键之间的二硫键被还原，肽键被打开，打开的肽键靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。不同大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。 4. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE） 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。 5. 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分、pH值和凝胶孔径，而且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀。由此产生的浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。 （1）浓缩效应样品在电泳开始时，通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般能浓缩几百倍)，然后再被分离。当通电后，在样品胶和浓缩胶中，解离度最大的Cl—有效迁移率最大，被称为快离子，解离度次之的蛋白质则尾随其后，解离度最小的甘氨酸
实验设计-细胞核的提取与鉴定
医学细胞生物学设计型实验设计报告 姓名：李飘班级：K—10班学号：1020151004 评分 【实验项目】：动物细胞细胞核的分离与鉴定 【实验原理】：核体的制备核体是指含有少量细胞质并由质膜包裹的 细胞核。因为在实际中我们不可能100%的得到细胞核，因此,我们只能制备含有少量细胞质的核体，核体的制备方法主要有吸出法和原生质体破裂法等。在本实验中我们采用排除法来制备核体。排除法制备核体是通过细胞松弛素和高速离心的作用使细胞核排出，然后从离心管底部沉淀中收集获得核体。 细胞核的鉴定因为细胞核中主要含DNA，是碱性蛋白。因此将分离出的核体经三氯醋酸处理,抽提掉核酸后，用碱性固绿溶液染色，可以使细胞核内的碱性蛋白显示出来。 【实验步骤】： 1．细胞培养：将欲分离微核体和细胞质的动物接种于脱核塑料圆板上，使适宜的培养基中于37 ℃的条件下培养，使细胞固定在脱核塑料圆板上，脱核塑料圆板的直径应稍小于离心管的直径，使用前先用水洗干净再经过乙醇杀菌处理。 2．秋水仙碱处理：细胞培养一段时间以后，加入0.1ug/ml的秋水仙碱，处理细胞48～60h 滤纸，使细胞形成多个大小不同的核体。 3．细胞松弛素处理：在离心管内加入5ml预热至37 ℃的细胞松弛素B溶液将固定有动物细胞的圆板面朝下放入离心管内，固定圆板位置后，再加入10ml37 ℃的CB溶液。 4．离心：在1000～15000r/min核体从细胞排出。 5．收集核体：由于核体的贴附力弱，可以从离心管底部的沉淀中收集。 6．固定：将收集的核体涂于玻片上制成涂片，滴加15%乙醇于涂片上，固定5min，室温晾干。 7．三氯醋酸处理：将已固定的血涂片浸在90 ℃的三氯醋酸溶液中处理20min，细流水反复冲洗玻片上的三氯醋酸直至冲尽。用滤纸吸于玻片上多余水分晾干。 8．染色：将制作好的涂片放入0.1%碱性固绿染液中染色10～15min，细流水冲去多余染液，晾干，镜检。 【注意事项】： 1．在离心管内加入的5ml细胞核松弛素B溶液要预热到37 ℃，因为只有这样才接近动物的最佳体温37 ℃。 2．涂片在用三氯醋酸处理时，时间不宜过长或过短，过长会使核膜裂解，过短使抽提的核酸不够。 3．在染色时，时间一定要足够，否则染色不完全，得不到理想的实验结果。 4．因去掉胞质的核体贴附能力弱，因注意在固定、三氯醋酸处理、染色时、尽量避免胞核的脱落。 【预期结果】：经碱性固绿染色的核体涂片被染成绿色，说明这是碱性 蛋白，即细胞核。
细胞总蛋白提取
细胞总蛋白提取 准备： 1、冰盒、提前开启低温高速离心机、预冷1× PBS、细胞刮刀、移液器（吸头）。 2、1×RIPA buffer [Thermo (89901)]、100×Cocktail [CALBIOCHEM (#539131)]、100×PMSF [Beyotime (ST506-2)]、10×Phosstop [Roche (4906837001)] (Cocktail 和Phosstop 分装储存于-20℃，需提前置于冰上解冻，根据xuyao)。Cocktail和Phosstop的配制方法为：1粒药片加入1ml RIPA buffer [Thermo (89901)]，分别配成100X Cocktail 和10X Phosstop。 PMSF:丝氨酸蛋白酶抑制剂, -20℃保存1年。 Coaktail:抑制丝氨酸、半胱氨酸、金属蛋白酶；2- 8°C保存1-2周，-20°C 可保存至少1个月。 PhosSTOP可同时持续抑制包括酸性和碱性磷酸酶，及丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PP1, PP2A, PP2B）和酪氨酸蛋白磷酸酶在内的多种磷酸酶。溶解后的储存液体4℃可以稳定保存一个月以上，-20℃下可以保存6个月。 【注意】PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。 3、标记并预冷1.5ml离心管（样品数）、0.5ml离心管（样品数）、0.2ml离心管（样品数）。 样品： 1、根据实验需求干预细胞，蛋白提取前用显微镜拍照记录细胞数量及状态（用于评估需要裂解液的量和Western Blot数据分析参考）。 举例：HCT-8细胞接种于2块6孔板中，用PZH干预24h后，对照组细胞汇合度约为80%时，PZH 0mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml所需加入裂解液的体积为60μl、60μl、60μl、50μl，即所需加入孔中裂解液总量为690μl，所配量比所需份数多2-3份，预计所配量为800μl（1× RIPA Buffer 704μl + 100×Cocktail 8μl + 100× PMSF 8μl + 10×Phosstop 80μl、），剩余裂解液另存于离心管中保存于-20度，供测定BCA时使用。提取在冰上操作及试剂置于冰上保存。
蛋白质的十种提取方法
蛋白质的十种提取方法.txt大人物的悲哀在于他们需要不停地做出选择；而小人物的悲哀在于他们从来没有选择的机会。男人因沧桑而成熟，女人因成熟而沧桑。男人有了烟，有了酒，也就有了故事；女人有了钱，有了资色，也就有了悲剧。蛋白质提取方法-------列举10种方法 [ 来源：绿谷生物网点击数： 4587 更新时间： 2008年05月30日 ][ 收藏本文 ] 一、 植物组织蛋白质提取方法（summer） 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清夜，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 二、 植物组织蛋白质提取方法 (summer) 三氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1 小时），然后真空 干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm 以上1小 时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品： 提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮 裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的 DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！ 三、 组织：肠黏膜（newinbio） 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达