一个橡胶树谷胱甘肽_S_转移酶基因的克隆和表达特性分析_范玉洁

中国农业科学 2011,44(20):4150-4158

Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2011.20.003

一个橡胶树谷胱甘肽-S-转移酶基因的克隆

和表达特性分析

范玉洁1,2,林飞鹏1,2,安泽伟2,唐朝荣2

(1海南大学农学院,海口 570228;2中国热带农业科学院橡胶研究所,海南儋州 571737)

摘要:【目的】从橡胶树中克隆Glutathione-S-transferase(GST)基因的cDNA和基因组DNA,进行序列、结构和系统进化分析,研究胁迫条件和激素处理下的表达谱。【方法】利用产排胶机理课题组构建的胶乳EST数据

库,通过PCR技术克隆橡胶树GST基因的cDNA和基因组DNA;在线预测蛋白质保守功能域和亚细胞定位,构建系

统进化树,利用实时荧光定量PCR分析割胶、伤害、低温、激素和死皮病等因素对该基因表达的影响。【结果】从

橡胶树胶乳中克隆到1个GST基因的全长cDNA(793 bp),编码25.4 kD(219aa)蛋白,命名为HbGSTU1;克隆

了HbGSTU1的基因组DNA(1 313 bp),包含1个内含子(520 bp)和2个外显子。HbGSTU1属于GST Tau家族,

推测是一种无信号肽的细胞质蛋白,其N端结构域包含结合GSH的G位点,C端结构域包含特异结合底物的H位

点;HbGSTU1与一个蓖麻GST蛋白的亲缘关系最近,氨基酸序列的一致性为85%;HbGSTU1的表达受割胶、伤害、

低温、2,4-D、乙烯利和死皮病等因素调控,但对JA、SA和ABA处理的应答不明显。【结论】HbGSTU1是一个典型

的GST Tau家族蛋白,可能在橡胶树抗逆过程中起作用,可作为橡胶树抗逆分子育种的靶标基因。

关键词:橡胶树;谷胱甘肽-S-转移酶;基因表达;胁迫;激素

Cloning and Expression Analysis of A Glutathione-S-transferase Gene in The Latex of Hevea brasiliensis (para rubber tree)

FAN Yu-jie1,2, LIN Fei-peng1,2, AN Ze-wei2, TANG Chao-rong2

(1College of Agronomy, Hainan University, Haikou 570228; 2Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural

Sciences, Danzhou 571737, Hainan)

Abstract:【Objcetive】The objective of this study is to clone the cDNA and genomic clone of a glutathione-S-transferase (GST)

from rubber tree, and characterize its structural and phylogenetic characteristics, investigate its expression patterns under various

abiotic stresses and hormone treatments. 【Method】Combined with the latex EST database, RT-PCR and PCR were used to clone the

full length cDNA and genomic DNA of a Hevea GST, respectively. On-line bioinformatics tools were used to predict the conserved

functional domains and subcellular localization. Clustal X was used to construct the phylogenetic tree. Real-time RT-PCR (qRT-PCR)

was used to characterize the expression patterns of the Hevea GST gene under various treatments (tapping, wounding, chilling,

hormone and tapping panel dryness). 【Result】The full-length cDNA (793 bp) encoding a 25.4 kD (219 aa) Tau GST protein was

firstly cloned from the latex of H. brasiliensis, named HbGSTU1 and deposited in GenBank (JF729318). The genomic DNA (1 313

bp) of HbGSTU1 was also cloned, which contains one intron (520 bp) and two exons. HbGSTU1 protein contained the Tau

GST-specific N-terminal domain (G site) and the C-terminal domain (H site). HbGSTU1 was predicted to be a cytoplasmic protein,

which shared the highest amino acid identity (85%) with a GST from Ricinus communis. The qRT-PCR results show that HbGSTU1

expression was regulated by tapping, wounding, 4℃chilling, 2,4-D and Ethrel, but not by the three hormones JA, SA and ABA.

收稿日期:2011-04-11;接受日期:2011-05-19

基金项目:国家“973”计划项目(2008CB117009)、天然橡胶产业技术体系育种岗、中国热带农业科学院橡胶研究所基本科研业务费专项资金(XJSYWFZX2010-05(N))

联系方式:范玉洁,E-mail:fanyj2007@https://www.360docs.net/doc/528783704.html,。通信作者唐朝荣,Tel:0898-********;E-mail:chaorongtang@https://www.360docs.net/doc/528783704.html,

20期范玉洁等:一个橡胶树谷胱甘肽-S-转移酶基因的克隆和表达特性分析 4151

【Conclusion】HbGSTU1 is a typical Tau GST protein, and is implicated in stress-responses in Hevea tree, which may serve as a

target gene for Hevea molecular breeding.

Key words: Hevea brasiliensis; glutathione-S-transferases; gene expression; stress; hormones

0 引言

【研究意义】低温、台风和死皮病(tapping panel dryness,TPD)等逆境胁迫严重影响橡胶树产量,对处于热带北缘的中国橡胶树种植尤为明显,分离鉴定胁迫相关基因对橡胶树抗逆分子育种具有重要意义。谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)广泛存在于真核生物中,在植物新陈代谢、胁迫应答和细胞信号转导中行使功能[1]。克隆和鉴定橡胶树GST基因,将为揭示橡胶树耐受胁迫的分子机制和通过分子育种手段提高其抗逆性提供依据。【前人研究进展】20世纪60年代,首次在动物体内发现GST对药物的新陈代谢和脱毒起重要作用[2];随后于1970年在玉米中克隆了具有催化还原型谷胱甘肽(GSH)结合除草剂功能的GST[3]。近几十年,科研工作者针对GST在植物中的作用进行了广泛的研究[4-9]。目前,先后约有17个植物物种的GST基因得到克隆和研究[8-10],据报道在拟南芥[11]、水稻[12]和杨树[13]中分别存在53、59和81个GST基因。谷胱甘肽-S-转移酶是一类功能多样的超家族蛋白,主要用于催化谷胱甘肽与亲电的、疏水的化合物发生亲电取代反应[14-15],根据氨基酸序列的相似性和基因结构的特异性,将其分为6类:Lambda、Phi、Tau、DHAR、Theta和Zeta,前三类是植物所特有[4,15-16]。研究表明,植物GST主要分布在细胞质,少量分布于叶绿体[17]和微体[18]。多项证据显示,植物GST基因的表达受各种生物和非生物胁迫诱导和调控,例如除草剂[3]、伤害[19]、低温[20]、乙烯利[21]、生长素[22]、过氧化氢(H2O2)和水杨酸[23]等。结果表明,植物GST基因可能在多种胁迫应答中起着重要的作用。【本研究切入点】在前期工作中,产排胶机理课题组利用银染cDNA-AFLP技术分析割胶对胶乳转录组表达的影响时,分离鉴定了一个受割胶上调表达的GST基因的转录衍生片段(transcript- derived fragment,TDF)。割胶对橡胶树是一种典型的胁迫处理,橡胶树割胶应答反应与胶乳再生和产量密切相关,目前尚未见有关橡胶树GST基因的研究报道。【拟解决的关键问题】本研究拟从橡胶树胶乳中克隆包含完整编码区的GST基因的cDNA,进行序列、结构和系统进化分析,研究其在胁迫条件和激素处理下的表达水平,为该基因的进一步研究和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)热研7-33-97品系为试验材料进行胁迫处理,除4℃低温材料由中国热带农业科学院橡胶研究所安泽伟老师惠赠外,其它供试橡胶树均来自海南省儋州市中国热带农业科学院试验场二队,于2010年9月进行田间取样。

菌种Escherichia coli JM109由产排胶机理课题组保存;逆转录试剂盒RevertAid TM First Stand cDNA Systhesis Kit购自Fementas公司;DNA凝胶回收试剂盒AxyPrep TM DNA Gel Extraction Kit购自Axygen公司;连接试剂盒pMD? 18-T Vector Ligase Kit、实时荧光定量PCR试剂SYBR? Premix Ex Taq TMⅡ(Perfect Real Time)和LA Taq DNA聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司;引物由上海英俊生物技术有限公司合成;测序由北京六合华大基因有限责任公司完成;所用生化试剂均为分析纯,如无特殊说明均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 植物材料处理

低温材料处理方法参照文献[24],以未处理的橡胶苗为对照,选取4℃处理0.5、1、6和12 h共4个时间点采集树皮;割胶和伤害处理均选用树龄8年、达开割标准的未开割橡胶树,割胶采用半螺旋割线、三天一刀(s/2,d3)割制,取开割后前5个刀次的胶乳,以第一刀为对照,依次标记为1、2、3、4、5;伤害胁迫是在割线下方3—4 mm处沿割线每隔5 cm 订一图钉;激素刺激选用已开割2—3年的橡胶树,分别将茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)、乙烯利(Ethrel)和生长素(2,4-D)涂于割线及其上部约2 cm的割面;伤害和激素处理均在采胶前分0、3、12和24 h共4个时间点处理,以0 h为对照,于同一时间采集胶乳;死皮材料根据橡胶树死皮程度选取<50%和>80% 2种情况,以健康树为对照,采集胶乳。同一处理的橡胶树均来自相同林段,选取5—10株,割胶后单株取胶乳2—3 mL,混合后置于冰上备用。

1.3 总RNA提取与cDNA第一链合成

4152 中国农业科学44卷

橡胶树胶乳总RNA的提取采用Tang等[25]改良方法;橡胶树叶组织基因组DNA的提取参照文献[26]。cDNA第一链的合成使用Fementas公司逆转录试剂盒,按照公司操作说明进行。

1.4 HbGSTU1全长cDNA的克隆和基因组DNA扩增

全长cDNA克隆和基因组DNA扩增所用特异引物序列、PCR反应的退火温度及扩增片段长度见表。PCR反应的总体系为25 μL,包括1 μL模板、0.2 μmol·L-1特异引物、125 μmol·L-1 dNTPs、1 U的LA Taq DNA聚合酶(TaKaRa)和含MgCl2的1×PCR缓冲液;全长cDNA克隆PCR程序为95℃ 3 min;94℃ 30 s,58.5℃ 30 s,72℃ 1 min,30个循环;72℃ 10 min;基因组DNA PCR扩增程序为95℃ 3 min;94℃ 30 s,58.5℃ 30 s,72℃ 2 min,30个循环;72℃ 10 min。

1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,使用Axygen 凝胶回收试剂盒回收纯化目的片段,与pMD-18T载体连接并转化大肠杆菌JM109,通过菌落PCR鉴定后,分别挑取10个阳性单克隆送往公司测序。

表 所使用的PCR引物及其相关信息

Table Sequences and relevant data of the primers used in this paper

引物Primer

基因名称

Gene name

名称

Name

序列

Sequence(5′→3′)

用途

Purpose

退火温度

Annealing

temperature (℃)

扩增产物长度

Amplicon length

(bp)

HbGSTU1 Gst-pf CGCCGCTAGGAGAGTTGAC 全长cDNA/基因组DNA扩增

Full-length cDNA and genomic DNA amplification

58.2

Gst-pr

CACAGCTAAGTAACCTTGCCAAT全长cDNA/基因组DNA扩增

Full-length cDNA and genomic DNA amplification 58.6

793/1313

Gst-qf

TCCTTTCTTGCCCTCCGA

基因表达分析Gene expressional analysis 59.3

Gst-qr

GCCTCCTGCTCATCTCCCTT

基因表达分析Gene expressional analysis 60.6

128

18S rRNA 18S-qf GCTCGAAGACGATCAGATACC 基因表达分析内参

Internal control of gene expressional analysis

60.0

18S-qr

TTCAGCCTTGCGACCATAC

基因表达分析内参

Internal control of gene expressional analysis 60.0

146

1.5 生物信息学分析

根据BLASTX在NCBI非冗余蛋白数据库的搜索结果对该cDNA序列的编码蛋白进行注释,并利用BLASTN工具对HbGSTU1的全长cDNA和基因组DNA序列进行同源性比对,分析该基因结构;使用Genetyx-win(version 5.0.4)软件预测HbGSTU1的编码区和氨基端序列,并在NCBI上通过BLASTP (https://www.360docs.net/doc/528783704.html,/Blast.cgi)进行同源性比对分析,并预测该蛋白的保守功能域,同时下载其它植物的GST蛋白序列;使用ClustalX 1.81软件对不同植物GST蛋白序列进行多重比对分析,完全匹配排列,采用Neighbor-Joining分析方法进行分子系统学分析,以及 1 000次bootstrap统计学检验,最后用TreeView软件构建系统进化树;使用ProtParam工具(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)计算HbGSTU1蛋白的相对分子量和理论等电点;使用PSORT(http://psort.hgc.jp/form.html)、MitoProt (http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html)和TargetP 1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP)在线软件预测HbGSTU1蛋白的亚细胞定位。

1.6 实时荧光定量PCR分析

采用罗氏公司LightCycler 2.0实时荧光定量PCR (qRT-PCR)系统,分析不同处理和死皮程度对HbGSTU1表达的影响,qRT-PCR分析的具体操作按照仪器使用说明书进行。取4 μg胶乳总RNA,逆转录合成cDNA第一链,稀释30倍作为qRT-PCR分析的模板;反应总体系20 μL,包含2 μL模板、10 μL 2×SYBR Premix和10 μmol·L-1的引物各0.3 μL;扩增程序为95℃预变性30 s;94℃ 5 s,60℃ 20 s,72℃20 s,45个循环;利用LightCycler 4.05软件分别计算引物扩增效率和相应Qr值。使用18S rRNA(表)为内参,计算HbGSTU1的相对表达水平,相关分析参照Tang等[27]的分析方法。

2 结果

2.1 HbGSTU1全长cDNA的克隆与序列分析

在前期研究中,分离到一个随割胶呈明显上调表达的长度为236 bp的转录衍生片段(TDF),功能注

20期范玉洁等:一个橡胶树谷胱甘肽-S-转移酶基因的克隆和表达特性分析 4153

释为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。通过对构建的胶乳EST数据库(20 126条)进行BLAST检索,鉴定了一个包含该TDF序列(一致性达100%)的序列重叠群(Contig2776)。该序列重叠群的序列长度为1 051 bp,序列读码框预测和BLAST在线同源性比对显示,该序列已包含GST蛋白完整的编码区。为确认该序列的可靠性,在其两端的非编码区分别设计了1条特异引物(表),分别以橡胶树总RNA的逆转录产物和叶片基因组DNA为模板,进行PCR扩增。结果显示,分别获得1条约800 bp的cDNA特异扩增条带(图1-A)和1条约1 300 bp的基因组DNA特异扩增条带(图1-B),回收特异扩增条带,与T载体连接后转化E. coli,挑取阳性克隆送公司测序。测序结果显示,获得的cDNA特异条带的核苷酸序列与原TDF同源性为100%,且同EST数据库中Contig2776仅有少数几个碱基存在差异,而所扩增的基因组DNA序列包含完整的cDNA特异条带的序列。

A:全长cDNA扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析;B:基因组DNA 扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析;M:200 bp DNA分子量标准;1:全长cDNA 扩增产物;2:基因组DNA扩增产物

A: Agarose gel electrophoresis analysis for full-length cDNA amplication; B: Agarose gel electrophoresis analysis for genomic DNA amplication; M: 200 bp DNA marker; 1: Full-length cDNA amplification; 2: Genomic DNA amplification

图1 HbGSTU1全长cDNA和基因组DNA的扩增

Fig. 1 Amplification of the full-length cDNA of HbGSTU1 and its genomic DNA

序列分析显示,所扩增的cDNA包含51 bp的5′-UTR、85 bp的3′-UTR和657 bp的完整读码框,编码219 aa,分子量约为25.4 kD,理论等电点为5.48,属tau类GST(图2),将该基因命名为HbGSTU1(Hevea brasiliensis glutathione-S-transferases tau 1),该序列已提交GenBank,注册的登录号为JF729318。所扩增的基因组DNA长度为1 313 bp,包括1个内含子(520 bp)和2个外显子,根据外显子的数目分类该基因属于Ⅲ型GST。

斜体序列表示推导蛋白质序列的起始密码子;星号表示终止密码子;方框表示内含子边界;箭头线表示用于基因扩增和表达分析的引物序列Italic denotes the initiation codon “ATG”; Asterisks denotes the termination codon “TAG”; Rectangle denotes the intron boundary “GT-AG”; Arrows denotes the primer sequences for gene amplification and expressional analysis

图2 HbGSTU1的DNA序列及推导的蛋白质序列

Fig. 2 The genomic DNA sequence and its deduced protein of HbGSTU1

2.2 HbGSTU1蛋白质的结构域预测和细胞定位分析

通过同源性检索NCBI非冗余蛋白数据库预测HbGSTU1蛋白的保守功能域,结果(图3)显示,HbGSTU1蛋白包含2个结构域,氨基酸序列的5—78属于GST_N_Tau结构域,包含由7个保守氨基酸残基(S13、F15、K40、K53、I54、E66 和S67)构成的GSH 结合位点(G位点);GST_C_Tau结构域则包含由

4154 中国农业科学44卷

虚线表示N端结构域;实线表示C端结构域;带星号氨基酸分别表示位于G位点或H位点的保守氨基酸残基

The dotted line denotes the N-terminal domain; The solid line denotes the C-terminal domain; Amino acids with asterisks indicate the conserved aa residues of the G-site or H-site

图3 HbGSTU1蛋白质的保守功能域预测

Fig. 3 Conserved domain prediction for HbGSTU1 protein

12个保守氨基酸残基(D103、Y107、D108、R111、K112、W114、T115、F160、W163、V205、F208和L212)组成的底物结合位点(H位点),位于89—212 aa;起连接C 端和N端结构域作用的“KDKSPFLPSD”短序列(K79-D80-K81-S82-P83-F84-L85-P86-S87-D88)介于79—88位氨基酸。

利用3种在线分析软件(MitoProt、TargetP和PSORT),预测HbGSTU1蛋白可能的亚细胞定位。MitoProt和TargetP分析均认为该蛋白无信号肽,可能不属于分泌型蛋白;PSORT软件预测该蛋白定位在胞液。

2.3 HbGSTU1蛋白质的系统进化分析

在NCBI非冗余蛋白序列库中对HbGSTU1进行BLASTP同源检索和比对分析,获取来自不同植物物种和家族的20个GST蛋白序列。针对HbGSTU1与这20个GSTs的蛋白序列进行多重比对,并构建系统进化树(图4)。21个GST蛋白可明显地被分为6个类群Lambda、Phi、Tau、DHAR、Theta和Zeta。HbGSTU1

At DHAR1: AC024609; At DHAR2: AB026661; Os DHAR: AB037970; At GSTZ1: AC005312; At GSTZ2: AC005312; Dc GSTZ: M64268; At GSTU1: D44465; Zm GSTU2: AJ010439; ZmGSTU1: Y12862; Zm GSTL1: X58573; Os ZIG: AF237487; At GSTL2: AL132970; AtGSTT1: AJ131580; At GSTF1: X68304; Zm GSTF1: X06754; Zm GSTF3: AJ010295; Pt GSTU2: GQ377222; Rc GSTU1: XM_002532777; Pt GST1: XM_002317572; Gm GSTU: AF048978

图4 HbGSTU1蛋白质及其它20个植物GSTs的系统进化树

Fig. 4 Phylogenetic tree of HbGSTU1 and 20 GSTs from different plant species

20期范玉洁等:一个橡胶树谷胱甘肽-S-转移酶基因的克隆和表达特性分析 4155

与GST Tau家族蛋白聚为一个群,与同样来自大戟科的一个蓖麻GST(Rc,XM_002532777)的亲缘关系最近,氨基酸序列的一致性为85%,同源性高达93%;与来自大豆且受生长素2,4-D诱导的GST(Gm,AF048978)和来自同为高大乔木杨树的GST(Pt,GQ377222)同源性也较高,氨基酸序列一致性分别为79%和78%。总体来看,HbGSTU1与GST Tau家族蛋白的进化关系趋于一致。

2.4 胁迫和激素处理对HbGSTU1表达的影响

利用实时荧光定量PCR分析了HbGSTU1在割胶、伤害、冷害和激素处理,以及死皮发生等胁迫下,树皮或胶乳mRNA表达水平的变化情况(图5)。结果表明,在各种胁迫和激素处理条件下,HbGSTU1在转录水平上呈现出不同程度的差异表达。随着割次的递增和死皮程度的增加,HbGSTU1均呈明显的上调表达趋势;伤害和4℃低温处理后该基因的表达水平相近,均表现为先降低,随后又增加;2,4-D和Ethrel 处理后,HbGSTU1的mRNA表达量均呈递增趋势,在12 h达到最大,但表达水平在24 h明显下降并低于对照;其它3种激素(JA、SA和ABA)处理对该基因在转录水平上表达的影响不明显。

图5 非生物胁迫和激素处理对HbGSTU1表达的qRT-PCR分析

Fig. 5 Effect of several abiotic stresses and hormones on HbGSTU1 expression by real-time RT-PCR

3 讨论

谷胱甘肽-S-转移酶(GST)一般由25—27 kD的2条亚基以同源或异源的方式聚合而成,每条亚基均包含2个基本结构域:(1)含有结合GSH(G位点)的N端结构域;(2)含有特异结合底物(H位点)的C端结构域。两者通过一个含有约10个氨基酸的短序列连接。从保守结构域和进化树分析上看,所克隆的HbGSTU1的编码蛋白属于一个典型的GST Tau 家族蛋白。根据内含子的多少分类,HbGSTU1属于Ⅲ型GST。HbGSTU1是橡胶树胶乳中克隆的一个GST 基因。

非生物胁迫可以通过一系列的氧化反应诱导产生活性氧(reactive oxygen species),导致氧化胁迫。谷胱甘肽-S-转移酶在生物体遭遇逆境胁迫时,可以发挥其脱毒与抗氧化的功能,从而协助保护生物体免受损害[11]。Moons[28]发现SA、JA和生长素能够触发GST 在水稻根中的表达,且起着清除活性氧和参与胁迫应答调控的功能。Polidoros等[29]证明了过氧化氢在玉米的胁迫应答中起着信号分子的作用,可以诱发GST基因的表达。

割胶是一种人为割破橡胶树乳管系统使胶乳流出的过程,对橡胶树产生两种效应,即胶乳排出后的库效应和机械伤害造成的伤效应,属于典型的非生物胁

4156 中国农业科学44卷

迫;一般认为,橡胶树死皮病是一种由于割胶或乙烯利刺激过度引起的生理性紊乱,该病发生后橡胶树割线自然干涸,割面局部或全部不排胶,表现为胶乳硫醇含量降低、活性氧水平升高等现象[30];中国植胶区位于热带北缘,属于非传统植胶区,低温是限制中国天然橡胶产业发展的重要因素之一,而其它植物物种GST在转录水平上的表达受氧化、干旱、低温等多种非生物胁迫和激素调控。

本研究中,割胶、伤害和低温等非生物胁迫可明显调控HbGSTU1的表达(图5-A、图5-B和图5-D),表明该基因可能参与了抵抗非生物胁迫的危害,减轻氧化胁迫的过程。在所进行的5种激素(JA、SA、ABA、Ethrel和2,4-D)处理中,只有2,4-D能明显诱导HbGSTU1的过量表达,处理12 h后的mRNA表达量是对照的2.5倍(图5-E),暗示该基因启动子中可能含有受生长素诱导的顺时调控元件[22],但其受生长素调控的分子细节与生理学意义有待进一步研究。在死皮树胶乳中HbGSTU1的表达量较健康树高,且随着死皮程度的增加出现递增的趋势(图5-C);前人的研究显示死皮树的胶乳表现为硫醇含量降低、活性氧水平升高等现象[27],推测在死皮树胶乳中,HbGSTU1可能参与活性氧伤害的修复,即通过催化有害物质的亲电基团与还原型谷胱甘肽的巯基结合而产生无毒的产物,同时也导致了胶乳硫醇含量的降低。Darussamin等[31]通过对健康树和死皮树树皮的蛋白提取物进行SDS-PAGE比较分析发现,健康树中存在分子质量为42、49和52 kD 3种主要蛋白,而死皮树树皮中52 kD蛋白含量较健康树则大为增加,且42和49 kD蛋白消失。由于GST两亚基的分子量之和刚好接近52 kD,那么GST会不会就是在死皮树树皮中增量表达的那个52 kD蛋白呢?如果事实是这样的话,不仅支持了“橡胶树死皮病的发生是一种生理代谢紊乱”的假说[30-31],而且还为研究死皮的发生机制提供了一些新的思路。

抗逆研究是橡胶树应用基础研究的一个热点课题,研究结果将为橡胶树抗逆育种提供理论指导。鉴于植物GST家族中的许多成员都与植物抗逆性有关,同时本文结果也显示克隆的这个橡胶树GST基因也可能参与橡胶树的逆境胁迫应答,因此,全面克隆橡胶树GST家族基因并研究其表达调控,不仅有助于深入了解橡胶树GST家族基因的生理功能,阐明GST 作用的分子机制,同时还有可能鉴定到有生产应用价值的GST基因,为橡胶树抗逆分子育种提供可靠的靶标基因。

4 结论

从橡胶树胶乳中克隆到一个GST Tau家族cDNA(793 bp),命名为HbGSTU1(GenBank登录号为JF729318),预测蛋白分子量25.4 kD(219 aa),包含典型的C端和N端结构域;基因组DNA 包含2个外显子和1个内含子;HbGSTU1与一个蓖麻GST的亲缘关系最近,序列一致性达85%,亚细胞定位推测属于无信号肽的细胞质蛋白。在橡胶树中,HbGSTU1的表达受割胶、伤害、低温、2,4-D、乙烯利和死皮病等因素调控,但对JA、SA和ABA 激素的应答不明显,表明该基因可能在橡胶树逆境胁迫应答中起作用,可作为橡胶树抗逆分子育种的靶标基因。

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(责任编辑李莉)

新书介绍:《生物入侵》系列著作

作者:万方浩等 出版单位:科学出版社

随着经济全球化的飞速发展,生物入侵已成为与各国经济发展、生态安全、国际贸易与政治利益紧密关联的重大科学问题和各国政府、科学家与民众共同关心的社会热点。被列入“十一五”国家重点图书出版规划的《生物入侵》系列著作已由科学出版社出版。该系列著作包括《入侵生物学》、《生物入侵:预警篇》、《生物入侵:检测与监测篇》、《生物入侵:生物防治篇》和《生物入侵:管理篇》,系统论述了国内外入侵生物学的最新理论研究和发展前沿,全面展现了我国在生物入侵的预防预警、检测监测、扑灭根除与持续减灾等方面的成果,呈现了从理论、技术与方法到管理的具有系统性与完整性的学科体系。《生物入侵》系列著作是科学技术部、农业部、国家自然科学基金委员会等资助项目产出的重要成果,凝聚了我国入侵生物学家的辛勤劳动与心血,是标志我国入侵生物学学科发展的重要里程碑。

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