糯玉米自交系遗传多样性及其产量_农艺性状与SSR分子标记的关联研究

糯玉米自交系遗传多样性及其产量、农艺性状与SSR 分子标记的关联研究

蒋思霞1，倪正斌2，印志同2，徐志英1，邓德祥

2*

（1．扬州环境资源职业技术学院，江苏扬州225000；2．扬州大学农学院，江苏扬州225000）

摘要［目的］研究糯玉米自交系的遗传多样性，确定其亲缘关系远近，为糯玉米的新品种选育提供依据。［方法］以84个糯玉米自交系为试验材料，利用分布在玉米全基因组上的71个SSR 标记对供试材料的遗传多样性进行分析，并对其产量及农艺性状与SSR 标记进行

了关联分析。［

结果］150对SSR 引物中有71对在糯玉米自交系中能扩增出多态性条带，共检测到342个等位基因，每对引物可检测到2 11个数目不等的等位基因，多态性信息量为0．249 0．876；糯玉米自交系间的遗传距离为0．02 0．32，均值为0．17，84个自交系可划分为8个组别；玉米10个连锁群上71个SSR 位点的2485个组合，都存在一定程度的连锁不平衡；共检测出21个SSR 座位与10个产量、农艺性状显著相关。［结论］该试验阐明了所选糯玉米自交系的遗传多样性及相互间的亲缘关系，为有目的的组配糯玉米杂交种及其新品种选育提供了参考。

关键词糯玉米；遗传多样性；关联分析；农艺性状；产量性状中图分类号S513文献标识码A 文章编号0517－6611（2012）06－03212－06Study on the Genetic Diversity and Association Analysis of Yield and Agronomic Traits with SSR Primers in Waxy Maize Inbred Lines JIANG Si-xia et al （Yangzhou Vocational College of Environment and Resources ，Yangzhou ，Jiangsu 225000）

Abstract ［Objective ］To study the genetic diversity of waxy maize inbred lines and determine their genetic relationship ，so as to provide refer-ences for the new varieties breeding of waxy maize．［

Method ］A total of 84waxy corn inbred lines were used as experimental materials．Seventy one SSR markers in maize 10chromosomes were adopted to explore the genetic diversity of waxy maize．The association of the agronomic and yield traits of waxy corn with the SSR primers was analyzed．［Result ］Of the 150SSR primers ，71could obtain polymorphic bands among waxy corn inbred lines．Seventy one pairs of primers in maize 10chromosomes detected 342alleles．The number of detected alleles was within a range of 2－11．Polymorphism information content （PIC ）value ranged from 0．249to 0．876，the genetic distance among the inbred lines was 0．02－0.32with an average of 0．17；84waxy maize inbred lines could be divided into 8groups．The 2485combinations of 71SSR primers at 10linkage group were in linkage disequilibrium state ；21SSR markers were detected to be associated with 10agronomic and yield traits．［Conclusion ］The

research expounded the genetic diversity of waxy maize inbred lines and their genetic relationship ，

which provided references for the hybrids and new varieties breeding of waxy maize．

Key words Waxy maize ；Genetic diversity ；Association analysis ；Agronomic traits ；Yield traits

基金项目

教育部“作物功能基因组重点实验室”开放课题及江苏省科

技支撑计划（农业BE2011303）资助。

作者简介蒋思霞（1957－），女，江苏泗阳人，副教授，从事作物遗传育

种教学和科研工作，

E-mail ：jsixia@126．com 。*通讯作者，教授，从事玉米主要性状遗传、育种及杂种优势利用研究，E-mail ：yzdxdeng@126．com 。收稿日期2011-11-17我国是糯玉米的起源中心

［1］

。由于糯玉米胚乳中淀粉具有特殊的结构，

形成了独特的糯性和风味，使其具有丰富的营养和良好的适口性，在食品加工和工业生产中具有特殊的用途。近年来，随着市场经济的推动，鲜食型糯玉米生产得到跨越式发展，现已成为广大民众消费的最重要果蔬食品之一。

糯玉米的特殊性质以及其在工业上的广泛用途，促进了世界上很多国家开展了糯玉米的育种研究。美国对于糯玉米遗传育种研究开展比较早，

发展也较快。1909年，Collins 首次描述了糯玉米的特征，由于胚乳表现致密不透明，像石蜡，故称蜡质玉米，并在糯玉米品种中发现了隐性糯质基因

wx 基因，定位在第9染色体短臂上［2］

；1942年左右，

Jenkins 等育成了第1个糯玉米杂交种。目前美国糯玉米种植面积

已达40万hm 2

以上，

年产量稳定在3500万吨左右。中国是食用糯玉米最早的国家，糯玉米资源十分丰富。但中国糯玉米的研究利用工作不仅起步较晚，而且开发利用的进展也非常缓慢。在中国，

糯玉米育种研究工作直到70年代中期才开始有所进展。随着国民经济的快速发展和市场对鲜食糯

玉米需求的增加，我国糯玉米育种工作提到了重要日程，一大批糯玉米自交系和杂交种的育成，有力地推动了中国糯玉米育种和生产的发展

［3－14］

。

1998年扬州大学农学院杂种优势利用研究室暨玉米遗传育种课题组对从市场上购买的广糯一号、珍珠糯2号、黑糯、黄糯等一批糯玉米杂交种、从江苏省沿江农科所引进的沿江糯系列杂交种以及国家和江苏省糯玉米区域试验的参试组合等材料中进行套袋自交选系，

育成了一批稳定的糯玉米自交系，

目前这些选系已提交省内外有关育种单位。2008年冬天又从云南收集到9个农家品种，由于无法查找上述选系原始材料的系谱及亲缘关系，因而，由此选育的这批自交系间的亲缘关系也就无法得知。为了有目的地利用这些选系组配杂交种，

为育种工作提供依据，该研究利用覆盖玉米全基因组的SSR 标记对这些自交系（农家品种）进行遗传多样性分析，并采用关联作图发掘玉米产量和农艺性状相关联的标记，

探明这些糯玉米自交系的遗传多样性及相互间的亲缘关系，为各有关单位有目的地组配糯玉米杂交种提供参考。1

材料与方法1．1材料与试剂

1．1．1

供试材料。以1998年扬州大学农学院杂种优势利

用研究室暨玉米遗传育种课题组通过套袋自交选育成的75个稳定糯玉米自交系和2008年冬从云南收集到的9个农家品种为试验材料（表1）。

责任编辑王春艳责任校对卢瑶

安徽农业科学，Journal of Anhui Agri．Sci．2012，40（6）：3212－3217，3283DOI:10.13989/https://www.360docs.net/doc/5b10790531.html,ki.0517-6611.2012.06.200

1．1．2设备、仪器和试剂。高速冷冻离心机（TGCC-18B）、TC-96/T/H（a）PCR扩增仪等分子生物学研究常用设备。主要试剂Taq酶、dNTP、MgCl2、PCR Buffer等购自上海生物工程公司。其他常用药品均为国产分析纯试剂。

表1供试糯玉米自交系及其代号

1．2方法

1．2．1田间设计。2009年7月13日将75个糯玉米自交系与9个农家品种（其中1个自交系未出苗）随机排列播种，重复2次，每行15株，行长2．5m，行距（大小行）为0．6m和0．3m。田间管理同一般试验田，整个生长期生长情况正常。1．2．2农艺、产量性状调查。在玉米生长期间调查各供试材料的抽雄初期、抽雄末期、散粉期、株高、茎粗、雄穗一级分枝数、雄穗长等农艺性状；在收获后考查套袋自交各单株的产量性状：穗长、穗粗、百粒重、单株产量。

1．2．3玉米叶片总DNA的提取与检测。取玉米叶片适量置于研钵中加液氮速冻，常规方法提取DNA；提取的DNA用1%琼脂糖电泳（EB终浓度0．5μg/ml），通过Gel Doc1000凝胶成像系统和凝胶分析软件，检测其浓度、纯度与质量。将提取的DNA原液部分稀释成工作液，在4?下保存备用，其余的DNA原液作为母液置于－20?保存备用。

1．2．4DNA工作液及SSR标记引物工作液制备。将制备好的DNA工作液调节浓度至10 500ng/μl。依据合成引物的量，将引物干粉稀释成100μmol/L的母液，然后将左右引物混合并稀释到1μmol/L作为工作液备用。

1．2．5SSR分析。参照已经发表的玉米分子标记连锁图，从Maize GDB选取分布在玉米10个染色体连锁群上的150对SSR引物，并根据Maize GDB中公布的引物序列，由上海生物工程公司合成引物。常规的PCR反应体系，35个循环。

将PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染，清洗后置于显影液中，10min后等条带清晰取出观测。

1．3数据处理与分析

1．3．1SSR位点的多态性信息量。SSR扩增带型，在相同迁移位置上，有带记为1，无带记为0。每个SSR位点的多态性信息量（Polymorphism information content，PIC）按公式PIC i= 1－∑k

u=1

珓p2

lu

－∑k－1

u=1

∑k

v=u+1

2珓p2

lu

珓p2

lv

计算，珓p lu、珓p lv表示lu、lv位点的等位基因频率。以简单配对参数（Simple matching coefficient，SM）计算遗传相似系数GS=m/（m+n），其中m为基因型间共有带数目，n为差异带数目。按UPGMA（Unweighted pair group method arithmetic averages）方法进行聚类分析。数据处理由PowerMarker V3．25、FigTree和Excel软件完成。

1．3．2LD的衡量。首先使用QuantityOne软件依据pBR322 DNA Marker计算出各SSR等位变异分子量（bp），然后依据SSR重复单元大小进行人工矫正，确定等位变异数目，形成位点等位变异矩阵；使用标准不平衡系数（D'）衡量位点间LD大小。

D'=∑u

l=1

∑v

j=1

p

i

q

j

|D'

ij

|

其中u和v分别代表2个位点等位变异数目，p i和q j分别代表A位点第i等位变异及B位点第j等位变异的频率。

D'

ij

=

D

ij

D

max

，D

ij

=x

ij

－p

i

q

j

其中x ij，表示配子A i B j出现频率，p i和q j分别表示等位变异A i、B j的频率，下同。

D

max

=

min［p

i

q

j

，（1－p

i

）（1－q

j

）］；D

ij

＜0

min［p

i

（1－q

i

）（1－p

i

）q

j

］；D

ij

[]

＞0

D'的理论变化范围是0 1，一般将小于0．5作为LD衰减的标志。使用TASSEL计算LD配对检测的矩阵图，用于观测共线及非共线SSR位点之间LD的排列。其基本原理为依据上述公式计算出所有可能位点组合的D'值，其大小在配对检测的矩阵图上用相应色差大小给予直观反映。从中筛选出共线SSR位点对相应的D'值及位点间遗传距离。1．3．3群体结构分析。为了估测样本的群体结构，应用STRUCTRE软件，供试材料群体进行基于数学模型的类群划分，并计算材料相应的Q值（第i材料其基因组变异源于第k 群体的概率）。分析的大致原理是，首先假定样本存在K个等位变异频率特征类型数（即服从Hardy-Weinberger平衡的亚群，这里K可以是未知的），每一类群SSR位点由一套等位变异频率表征，将样本中各材料归到（或然率用Bayesian 方法估计）第k个亚群，使得该亚群群内位点频率都遵循同一个Hardy-Weinberg平衡。具体分析过程是，先设定群体数

3123

40卷6期蒋思霞等糯玉米自交系遗传多样性及其产量、农艺性状与SSR分子标记的关联研究

目（K ）为2 10，并假定位点都是独立的，该研究使用71个位点参与分析，

将MCMC （Markov Chain Monte Carlo ）开始时的不作数迭代（length of burn-in period ）设为10000次，再将不作数迭代后的MCMC 设为100000次，然后依据似然值最大的原则选取1个合适的K 值。1．3．4

关联分析。使用TASSEL 软件的GLM （generalliear

model ）程序，将各个体Q 值作为协变量，将11个性状的表型数据分别对标记变异进行回归分析。

Y j =α+βI pj +β1X 1j +β2X 2j +…+βk X kj +εj

其中Y j 是第j 个材料数量性状表型值，

I pj 是第j 材料第p 等位变异出现的指示变量，β是群体各位点各等位变异的平

均效应，

X 1j X kj 是第j 材料基因组变异源于第1 k 群体的概率Q 值，β1 βk 是亚群体各位点各等位变异的平均效应，εj 是残差。2结果与分析

2．1

供试材料产量、农艺性状差异

从表2中可以看出82

个糯玉米（有2个供试材料未能散粉，未能调查到产量、农艺性状）供试材料产量、

农艺性状差异均达到极显著。在不同供试材料间，

株高、雄穗长、一次分支数、穗长、百粒重和总重的变化幅度较大，茎粗、抽穗初期、抽穗末期、散粉期、吐丝期、

穗粗、穗行数变化幅度相对小。所有糯玉米自交系（包括农家品种）在性状上的差异都达到了极显著水平。

表2

供试材料间产量、农艺性状的差异平均数

最大值最小值标准差变异系数区组间品种间差异F 株高145．1726782．534．8724．020．37219．84＊＊雄穗长30．1551146．4121．250．2679．81＊＊一次分支数9．562204．3845．790．129．59＊＊茎粗1．812．650．8150．2715．021．18146．24＊＊抽穗初期47．38568．212．966．260．14224．83＊＊抽穗末期50．6560452．545．010．01710．54＊＊散粉期53．4462453．276．130．00121．31＊＊吐丝期53．8765463．386．270．00215．46＊＊穗长10．80234．52．7925．800．004711．06＊＊穗粗3．345．42．20．5315．970．3812．28＊＊穗行数11．811862．1017．770．4954．43＊＊百粒重20．8547．68．76．5931．610．003210．12＊＊总重

37．34

209．3

5．9

29．70

79．53

0．45

17．0＊＊

注：＊＊表示在0．01水平上达到显著。

2．2糯玉米种质的遗传多样性利用150对SSR 引物对84份糯玉米自交系进行多态性分析，选出扩增带型稳定、重复性较好的71对引物（表3）。

由图1可知，

71对引物均匀分布在玉米的10条染色体上，共检测出340个等位基因，每对引物可以检测到2 11个

数目不等的等位基因，平均为4．78个。其中umc1019标记的多态性条带高达11个，

bnlg1754、bnlg1237、phi299852、mmc0231、umc1653和mmc0282检测到9个多态性条带。多态性信息量为0．249 0．876，

平均为0．479，其中引物umc1019最大为0．876，umc1474位点最小为0．249

。

注：M 为标记PBR322，泳道1 85为供试的84个材料。

图1

引物bnlg1208在84个自交系上的扩增情况

将SSR 标记分析所得的0，1型数据，利用PowerMarker V3．25和FigTree 软件，按Nei 和Li （1979）和非加权配对算数平均法（UPGMA ）进行聚类分析。结果表明各品系间的遗传距离为0．32 0．02，均值为0．17。

选取0．31为阈值，

84份材料可以分为8个类群（表4）。该研究中所有来自于沿江地区农科所的选系全部聚在第6类中，各品系间遗传距离为0．06 0．12，遗传距离较小，品系间亲缘关系很近；第4类为在云南收集的9个选系中的7个，品系间遗传距离为0．28 0．13，说明供试糯玉米材料间遗传基础的狭隘，

并且由于品种的推广导致种质资源的减少；一个云南农家品系被在第3类群里也靠着第4类，另一个云南农家品系在第6大类中与其他云南材料亲缘关系相

对比较远；NA67-1、NA67-2、NA67-3、NA67-4、NA67-5这5个自交系是同一个杂交组合的5个选系，它们的遗传距离比较小，

表明它们的亲缘关系较近；黑糯-1和黑糯-2分别属于第2和第5类，表明它们的遗传差异较大。聚类分析结果也反映大部分NA 和NB 系列的材料之间的遗传差异较小，亲缘关系较近。由于NA 、NB 是来源于一个组合，配组合时我们可以根据图2的聚类结果去除一些不必要的组配，减少时间和材料的浪费。同时，聚类结果显示在本地区推广的杂交种的亲本自交系间的遗传基础较为狭窄。2．3

糯玉米自交系SSR 位点间的连锁不平衡状态

10个

连锁群上71个SSR 位点的2485种两两位点组合中，不论共线性组合，还是非共线性组合，都有一定程度的LD 存在。得

4

123安徽农业科学2012年

到统计概率（P＜0．001）支持的不平衡成对位点比例较大，占总位点组合的12．9%；但不平衡程度D'＞0．5的组合数仅占总位点组合的6．5%。

LD衰减（D'＜0．5）所延伸的距离决定着关联分析所需使用的标记多寡及关联分析的精度。对共线SSR位点D'值随遗传距离增加而变化的分析可看出（图4），SSR位点D'值衰减速率都相当快。进一步对D'值与遗传距离的回归分析发现，D'值衰减都遵循方程Y=bln（x）+c，据此可求出供试的糯玉米自交系LD衰减（D'＜0．5）所延伸的最小距离为3．60cm。群体结构分析表明样本的等位变异频率特征类数K=8（即服从hardy-weinberg平衡的亚群数为8）时其模型后验概率最大，因此判断样本亚群数为8。

表371对多态性SSR标记

图284个糯玉米自交系的SSR聚类扇形图

2．4糯玉米自交系农艺性状、产量性状与SSR标记的关联分析该研究检测的71个SSR位点中，共有21个位点与10个产量、农艺性状相关联。表6中列出了所有关联标记与对应的性状特征值的P值（P＜0．001）。

由表6可见，①与农艺性状相关联的位点（次）累计有17个：与株高关联的位点有5个，变异解释率最高的是umc1196（为0．25）；与一次分枝数关联的位点有2个，变异解释率最高的bmc1662（为0．21）；与雄穗长关联的位点有1个，其解释率是0．13；与抽雄初期关联的位点有3个，变异解释率最高的bmc2086（为0．32）；与抽雄末期关联的位点有2个，其中变异解释率最高的是bmc2086（为0．33）；与散粉期关联的位点有2个，变异解释率最高的是bmc（为0．30）；与吐丝期关联的位点有2个，变异解释率都是0．29；②与产量性状相关联的位点只有21个：与单穗总重量关联的位点有15个，变异解释率最高的是phi299852（为0．43）；与穗粗关

5123

40卷6期蒋思霞等糯玉米自交系遗传多样性及其产量、农艺性状与SSR分子标记的关联研究

联的位点有2个，变异解释率最高的是umc2350（为0．17）；与百粒重关联的位点只有4个，变异解释率最高的是bn-lg439（为0．31）；③这38个位点（次）分布在玉米9条染色体上，其中第1、第10号染色体上分布较多。

表4糯玉米供试材料的8个类群

组群供试材料名称遗传距离ⅠNB19-1、NB19-2、NB19-3NB20-1、NB20-20．34 0．56ⅡNA-3、NA-4、NA33、NA34、NA36、黑糯-20．24 0．51ⅢNA46和0812-140．54

Ⅳ0812-1、0812-3、0812-4、0812-5、0812-6、0812-15、0812-160．13 0．28ⅤNA49、NA51、NA50、NA52、NB5、黑糯-1、NB35-2、NB35-40．19 0．64

ⅥNA65、NA67-1、NA67-2、NA67-3、NA67-4、NA67-5、NB22、NB23-1、NB23-2、NB23-

3、NB26、W1-1、NA1-1、NA1-2、NA17、NA20-2、NA30-2、NA37、NA41、NA56、NA57、

NA58-1、NA58-2、NA70、NA75、NA76、NA77、NB9、NB11、NB12、NB28、NB31、NB35-

1、NB41、NB43、NB44-1、NB44-

2、NB46、NB53-1、NB53-2、0812-19、白糯-1、白糯-2、白

糯-3、珍珠糯2号、沿江糯-1、沿江糯-2、沿江糯-3、沿江糯-4、黄糯-10．06 0．12

ⅦNA280

ⅧNA18、NA20-1、广糯1号、广糯2号0．06 0．

48

图3糯玉米自交系SSR位点间连锁不平衡的分布此外，在该研究中还发现同一位点与多个性状相关联的情况。与11个性状关联的21个位点中，共有10个位点与2个或2个以上性状关联，同一标记位点与多个性状关联可能是性状相关、基因多效性所导致。有关生育期的4个农艺性状相关联的标记完全相同且变异解释率也较为接近。与单穗粒重关联的标记有15个，说明单穗产量是受植株的大部分性状所影响。

3讨论

该研究将所有来自于江苏省沿江地区农科所的选系全部聚在第6类中，各品系间遗传距离为0．06 0．12，遗传距离较小，品系间亲缘关系近也验证了该试验的可靠性。第4类为在云南收集的9个选系中的7个，品系间遗传距离为0．13 0．28，说明我国糯玉米遗传资源的狭隘，并且由于新育成品种的推广导致种质资源日趋减少，遗传基础日益狭隘。一个云南农家品系在第3类群里，但也靠着第4类，另一个云南农家品系在第7大类中与其他云南材料亲缘关系相对比较远。NA67-1、NA67-2、NA67-3、NA67-4、NA67-5这

表5共线标记的图位和距离

标记图位∥cm标记图位∥cm D'距离∥cm M20341．97M627．20．53226314．77

M21600．2M20341．970．502454258．23

M22612．48M21600．20．55737912．28

M28700．5M26259．10．420542441．4

M30450．7M19466．50．5054215．8

M35478．7M16414．10．46780364．6

M35478．7M34179．40．486117299．3

M3926．8M23541．610．306238514．81

M40344．8M29380．50．42320535．7

M41443．89M30450．70．6275786．81

M4281M33101．10．403220．1

M48732．99M17535．50．320903197．49

M48732．99M42810．380648651．99

M48732．99M47711．330．38666721．66

M49750．2M47711．330．53692238．87

M49750．2M48732．990．49948717．21

M51542．7M43534．60．4957528．1

M53133．6M5287．40．48245546．2

M54383．12M29380．150．585472．97

M55475．7M48732．990．377186257．29

M56114．64M445680．46079453．36

M60444．8M29380．50．45048464．3

M60444．8M40344．80．396411100

M60444．8M54383．120．29629661．68

M63283．5M40344．80．39656161．3

M66250．1M34179．40．42119770．7

M68401．2M28700．50．311217299．3

M68401．2M644050．9355943．8

M6916．5M26259．10．290802242．6

M6916．5M28700．50．461543684

M70469．6M9488．220．68957118．62

M70469．6M11656．70．533397187．1

M70469．6M326000．525421130．4

M70469．6M58425．710．5099243．89

M71396．46M9488．220．41627791．76

M71396．46M58425．710．57929629．25

M71396．46M594280．45659831．54

M71396．46M70469．60．63377473．14

5个自交系是同一个杂交组合的5个选系，它们的遗传距离比较近，说明它们的亲缘关系比较近，相互之间不宜作杂交的双亲进行组配。黑糯-1和黑糯-2分别属于第2和第5类，说明它们的亲本差异较大，在进行杂交组配时可以作为杂交双亲处理。至于NA和NB系列的材料，配组合时可以根据聚类结果结合农艺性状、产量性状的表现选择适当的自交系

6123安徽农业科学2012年

配组，以避免育种的盲目性

。图4

共线SSR 位点D'衰减散点图

植物自然群体由于进化历史及交配体系的不同，其基因组LD 水平存在差异鉴于QTL 与标记位点间的LD 是关联分析的前提和基础，

在进行关联分析前获知所研究群体基因组LD 状态是必要的。该研究基于少量分子标记，只进行粗略意义上的全基因组关联分析，目的在于初步了解玉米基因组连锁不平衡状态，

估计SSR 位点LD 的衰减。严格意义上的全基因组关联分析需使用高密度标记对全基因组进行扫描，

统计分析表明要对玉米基因组进行全基因组的LD 分析大约需要750000个标记［15］

。对于SSR 标记而言，尽管借助

多重PCR ，

引物荧光标记等手段可提升工作效率，但庞大的工作量及试验耗费，

仍需要完善的计划和决心。在该研究初步分析基础上今后将作进一步扩展。

表6

糯玉米自交系产量、农艺性状与SSR 标记关联分析

引物图位ED

SW

EW PH TL

TBN TI

TE

SP

S

umc21831．020．170．18

bnlg4391．030．31

0．30．33

bmc20861．050．32

0．330．30．29bnlg10251．070．290．28

0．3

0．25

0．29

umc17441．110．2mmc02312．030．35

bmc16622．080．21

umc21183．000．24

umc11324．080．14

mmc02825．050．290．36umc10195．060．36phi2998526．070．43umc20577．020．28umc17997．060．280．32umc15059．080．16

0．20．20．15

0．13

umc187310．040．41umc235010．040．170．35umc150610．050．24

bnlg102810．060．23

umc1196

10．07

0．38

0．25注：ED 表示穗粗；SW 表示百粒重；EW 表示单穗产量；PH 表示株高；TL 表示雄穗长；TBN 表示雄穗一次分支数；TI 表示抽雄初期；TE 表示抽雄末期；SP 表示散粉期；S 表示吐丝期。

该试验发现共线性或非共线性SSR 位点组合都有一定程度LD 存在，其中非共线SSR 位点的LD 可能是由于连锁群间重组引起，也有可能是位点间上位性互作所导致。QTL 作图的精度一般在10 30cm 之间。该试验采用D'计算出衰减距离为3．60cm ，说明关联分析比较准确。利用关联作图可以对QTL 结果进行验证和补充。

在产量性状方面，该研究主要考察了穗长、穗粗、百粒重、

穗行数和总重5个性状。仅检测到2个与穗粗关联的标记、

4个与百粒重关联的标记和15个与单穗总重量关联的标记，没有找到与穗长、穗行数关联的标记。这可能是试验中的SSR 标记少，

也有可能是从150对SSR 引物中所筛选的71对引物中没有与这些性状关联的标记。

该研究检测到与穗粗关联的标记为umc1505（0．16）和umc2350（0．17）分别位于染色体bin9．08和bin10．04。而Maize GDB 数据库所公布的与穗粗关联的QTL 在10条染色

体上都有，其中Austin D 等［16－17］在bin10．04位置上检测到1

个控制穗粗的QTL ，该QTL 与该研究结果比较一致；与百粒重关联的标记为mmc0282（0．29）、

umc1799（0．28）和umc1505（0．2）分别位于染色体bin5．05、bin7．06和bin9．08。与Maize GDB 上所公布的结果有很大差异；与单穗总重量关联的标记位于1、2、3、5、6、7、8、9和10号染色体，说明籽粒产量是由多基因控制。此外，控制单穗总重量的基因也控制着其它一些农艺性状，玉米单穗总重量与一些农艺性状相关联。

在农艺性状方面，主要考察了株高、雄穗长、雄穗一次分支数、

抽雄初期、抽雄末期、散粉期和吐丝期共7个性状。检测到5个与株高关联的标记，

1个与雄穗长关联的标记，2个与雄穗一次分支数均关联的标记，

抽雄初期、末期、散粉期和吐丝期都关联到位于bin1．05的标记bmc2086和位于bin

（下转第3283页）

7

12340卷6期蒋思霞等糯玉米自交系遗传多样性及其产量、农艺性状与SSR 分子标记的关联研究

色剂，静置4h进行培养，然后向每个孔中加100μl DMSO，溶解均匀之后，以酶标仪测定每个孔的吸光度，重复3次，得出其平均值，与对照组进行比较，计算肿瘤抑制率：

细胞生长率（%）=［（1－样品组OD/对照组OD值）?100］。

2结果与分析

2．1长药隔重楼萃取物的鉴定结合各种色谱技术，分离得到20种化合物。结合化合物的理化性质，质谱数据等属性，判定出14个化合物分别为黄酮类化合物1个、糖类化合物1个、甾醇及其苷类化合物4个、甾体皂苷类化合物7个和蜕皮激素类化合物1个。

2．2萃取物的抑瘤试验

2．2．1细胞毒活性的检测。从“2．1”化合物中抽取7个甾体皂苷类样品，通过体外作用，测定其对小鼠黑色素瘤的抑制作用。由表1可知，从长药隔重楼中所提取出的7种甾体皂苷类成分，均表现出较强的癌细胞抑制活性。而且，表中的一部分数据出现了负值，这说明分离化合物反而起到促进癌细胞生长的作用，但随着剂量的升高，又表现出较强的抑制活性。由此可以推断，表中的负值可能来自系统误差。

表1长药隔重楼分离化合物癌细胞生长抑制率%

样品浓度μg/ml

样品编号

1234567

0．13．905．58－14．626．590．2835．41－5．93 1．012．8717．99－13．197．6022．6355．32－4．00 10．063．0380．2146．3869．6672．0576．3735．05 100．094．6694．8894．8070．2894．9395．6095．82

2．2．2分离化合物剂量与抗肿瘤活性之间的关系。7种甾体皂苷类成分都有强的抑制肿瘤细胞作用，且剂量大小与活性之间关系密切。当7种化合物的浓度较低时（0．1以及1.0μg/ml），抑制肿瘤细胞作用都不明显，而浓度较高时（10．0μg/ml），大部分化合物的抑制率都在50%左右。当浓度为10．0μg/ml时，编号为2与6的化合物活性最强，已经测出此2种化合物是薯蓣皂苷元三糖苷和薯蓣皂苷元四糖苷；当浓度继续升高至100．0μg/ml，所有化合物都表现出极强的抑制肿瘤细胞活性。

2．2．3分离化合物结构与药效之间的关系。7种甾体皂苷类结构－药效关系比较明显。已知偏诺皂苷与薯蓣皂苷都表现出细胞毒的效果，试验已测出编号为2和3的化合物糖链相同，此时明显有薯蓣皂苷活性强于偏诺皂苷；试验已测出编号为1、3、5的化合物母核结构相同，则表现出活性随糖链增多而变强。由此可知，长药隔重楼的抗肿瘤活性与糖的连接位置具有很强的相关性。

3结论与讨论

（1）试验采用MTT比色法进行检测，检测的原理是MTT 是通用的细胞染色剂，是常用的细胞生长状况与存活情况的检测方法。试验中，假若单体化合物具有良好的抗肿瘤活性，就会杀死大部分细胞，死细胞中并不含有还原MTT的酶存在，所以，化合物抗肿瘤活性越好，则颜色就会越浅。试验用其吸光度来表示颜色的深浅。

（2）试验通过检测发现，7种甾体皂苷类成分都有强的抑制肿瘤细胞作用，且剂量大小与活性之间关系密切。而且，长药隔重楼的抗肿瘤活性与糖的连接位置具有很强的相关性。这个结论能够在理论上指导皂苷化合物的结构修饰，因此，需要作进一步的验证研究工作。

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檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪

8417－8418．

（上接第3217页）

1．07的标记bnlg1025。抽雄初期还关联到位于第10号染色体的标记bnlg1028。部分结果与Maize GDB上公布的结果一致，也有一些是未报道的，这可能是不同研究所使用的材料不同引起的。

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40卷6期杜文娟等长药隔重楼分离化合物抗肿瘤活性研究