杉木合子胚愈伤组织的诱导及植株再生_席梦利
杉木合子胚愈伤组织的诱导及植株再生
*
席梦利,施季森
*
(国家林业局、江苏省林木遗传和基因工程重点实验室(南京林业大学),江苏 南京 210037)
摘 要:以杉木成熟及未成熟合子胚为外植体,研究了基本培养基、植物激素、合子胚的发育阶段等因素对杉木愈伤组织的诱导及不定芽分化的影响。结果表明:1/2M S +2mg /L 2,4-D +1.0mg /L 6-BA +1.0mg /L K T +30g /L 蔗糖是成熟合子胚诱导愈伤组织的最佳培养基;处于胚胎选择阶段或者组织与器官分化阶段的幼胚,能诱导出松软、晶莹透明的愈伤组织,诱导频率为2%～6%。成熟阶段的幼胚诱导出的愈伤组织的外观形态与成熟合子胚诱导出的愈伤组织相似,愈伤组织的诱导频率随着合子胚发育的成熟而迅速提高;DCR +1.5mg /L 6-BA +1.5mg /L K T +20g /L 蔗糖是诱导不定芽发生的最佳培养基。高约1.5cm 的不定芽转入生根培养基,生根率可达100%。关键词:杉木;愈伤组织;植株再生中图分类号:S722.3
+
7 文献标识码:A 文章编号:1000-2006(2006)02-0006-05
Callus Induction and Plantlets Regeneration from Zygotic Embryos of
Cunninghamia lanceolata Hook.
XI M eng -li ,SHI Jisen *
(The Key Labo ratory of Fo rest Genetics and Gene E ngineering of the S tate Fores try Adminis tration and Jiangsu
P rovince (Nan j ing Forestry University ),Nanjing 210037,C hina )
A bstract :Using mature zyg otic embry os and imm ature zy go tic em bry os as initial explants ,the effect of the follow ing factor s on inductio n callus and differentiatio n adventitious buds :basal medium ,plant horm one and development stages o f zy go tic em bry o w ere studied.Re -sults indicated that the optim al m edium fo r mature zy go tic em bry os induction callus w as 1/2M S +2mg /L 2,4-D +1.0m g /L 6-BA +1.0mg /L KT +30g /L sucrose.This medium can induce soft ,transparent callus from imm ature zy go tic embryo s o f em bry o selection or tissue and org an differentiatio n stages.The induction frequency w as 2%～6%.Immature zyg otic em bry os of tissue and organ diffe rentiation o r embryo mature stages inductio n callus w ere similar in state w ith those o f m ature zyg otic embryo.The callus induction frequency w as sig -nificantly improved w ith the maturity of im mature zy go tic em bry os.The optim al medium fo r differentiation adventitio us buds w as DC R +1.5mg /L 6-BA +1.5m g /L KT +20g /L su -crose.Shoots w ith 1.5cm hig h w ere transfered to roo ting m edium and roo ting frequency reached 100%.Key words :Cunninghamia lanceolata H oo k.;Callus ;Plantlets regene ra tion
针叶树种由于其生物学上的特殊性,间接器官发生的难度较大,目前仅在火炬松((Pinus taeda L.)、辐射松(P.radiata D.Don )、欧洲赤松(P.sy lvestris L.)和外高加索松(P.eldarica Medw.)等针叶树种中取得了成功
[1-6]
。有关杉木(Cunningham ia lanceolata H oo k.)主要以幼树或成年树的嫩枝为
试验材料进行组培快繁研究[7-9]
,而杉木不同发育阶段合子胚愈伤组织的诱导及植株再生的研究国内外
第30卷第2期2006年3月
南京林业大学学报(自然科学版)
Journal of Nanjing Forestry University (N atural Sciences Editio n )
Vo l.30,N o.2 M a r.,2006
*收稿日期:2005-04-08 修回日期:2005-09-21
资金项目:国家自然科学基金资助项目(30170745);江苏省高校省级重点实验室开放课题(KJS03035)作者简介:席梦利(1970-),女,讲师,博士,主要从事林木生物技术方面的研究。*通讯作者(C orresp onding Au th or ):施季森,男,教授,博士生导师。
2006年 总第122期 席梦利等:杉木合子胚愈伤组织的诱导及植株再生
均未见报道[10-12]。笔者以杉木成熟合子胚及从原胚到胚胎成熟阶段的幼胚为起始外植体,研究了基本培养基、植物激素、合子胚的发育阶段等因素对杉木愈伤组织的诱导及不定芽分化的影响,旨在为杉木体细胞杂交和遗传转化研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料及处理
成熟合子胚:以福建第2代遗传种子园当年收获的种子成熟合子胚为外植体。
未成熟合子胚:分别选取3株优树的未成熟合子胚为外植体。2002年6月到9月间,大约每隔10d 采集未成熟球果1次。
成熟种子:吸水膨胀后剥去外种皮,在超净工作台上用质量分数为75%酒精浸泡1min及0.1% H gCl2浸泡15min,无菌水冲洗5～6次,无菌条件下剥出合子胚接种于诱导培养基上,每个处理接种10瓶,每瓶接种10个胚。
未成熟种子:用洗衣粉水溶液清洗干净球果,从球果中剥出未成熟种子,在超净工作台上用质量分数为75%酒精浸泡30s及0.1%H gCl2浸泡10min,无菌水冲洗5～6次。每个处理接种5瓶,每瓶接种10个外植体。
1.2 培养基与培养条件
愈伤组织的诱导培养基:选用M S、1/2MS、DCR、S4种基本培养基。附加物为:2,4-D(0.5～10mg/L)、6-BA(0～2.5m g/L)、K T(0～2.5m g/L)、谷氨酰胺(450mg/L)、水解酪蛋白(500m g/L),蔗糖(3%)和琼脂粉(0.6%),pH 5.8。
不定芽的诱导培养基:用于不定芽诱导的愈伤组织分3种,即愈伤A(成熟合子胚诱导的浅黄色、结构紧密的愈伤组织);愈伤B(处于胚胎选择阶段或者组织与器官分化阶段的幼胚诱导出的晶莹透明的愈伤组织);愈伤C(处于成熟阶段的幼胚诱导出的浅黄色、结构紧密的愈伤组织)。因此,选用M S、1/2M S、DC R、GD4种基本培养基,附加物为6-BA(0.5～2.5mg/L)、K T(0.5～2.5m g/L)、NAA (0.1m g/L)、蔗糖(2%)和琼脂粉(0.6%),pH5.8。
生根培养基:1/4M S基本培养基附加0.2mg/L IBA,0.1m g/L NAA,2%蔗糖,0.6%琼脂, pH5.8。
培养条件:愈伤组织的诱导采用暗培养,温度23～28℃;愈伤组织诱导不定芽发生及不定芽的生根,采用光照培养,光照(2000lx)14h/d,培养温度23～25℃。
2 结果与分析
2.1 激素浓度对成熟合子胚愈伤组织诱导的影响
成熟合子胚接种于1/2MS分别附加0.5、1、2、4、6、8、10m g/L2,4-D的诱导培养基上。接种5d 后,可明显辨别污染胚和没有生活力的胚:没有生活力的胚与刚接种时大小相当,而有生活力的胚已明显膨大。20d后,合子胚的子叶和下胚轴开始愈伤化。观察统计发现:2,4-D浓度为0.5～10mg/L时,有生活力的胚都可产生愈伤组织,愈伤组织的诱导频率均达100%。随着2,4-D浓度的增高,合子胚愈伤化的速度加快,但愈伤组织的褐化干枯现象加剧。比较得知,2,4-D浓度为2mg/L时,合子胚愈伤化的速度和愈伤组织的状态最佳。
将成熟合子胚接种于1/2M S附加2mg/L2,4-D及0.5、1、1.5、2、2.5mg/L6-BA与K T的诱导培养基上,15d后,合子胚的子叶和下胚轴开始愈伤化,愈伤化所需时间比单独附加2,4-D时明显缩短。观察统计发现:6-BA和KT浓度为0.5～2.5m g/L时,愈伤组织的诱导频率均能达到100%。6-BA和KT浓度为0.5mg/L时,愈伤组织的色泽虽好,但生长速度慢。6-BA和K T浓度高于1.0m g/L时,愈伤组织上可分化出少量不定芽。只有6-BA和KT浓度为1.0mg/L时,愈伤组织的状态良好,呈白色或浅黄色,且生长速度适中。
2.2 基本培养基对成熟合子胚愈伤组织诱导的影响
在4种不同基本培养基上均附加2m g/L2,4-D、1.0mg/L6-BA和1.0mg/L KT。观察统计表
明:M S、1/2MS、DCR3种基本培养基上,成熟合子胚的愈伤组织诱导率均可达到100%,S基本培养基上的愈伤组织诱导频率较低,为84.7%。合子胚接种35d后,不同培养基上的愈伤组织开始出现不同程度的褐化现象。褐化程度以M S上最严重,S上的次之,1/2M S和DCR上较轻。虽然,1/2M S基本培养基上的愈伤组织比DC R基本培养基上的愈伤组织褐化稍严重,但DCR基本培养基上愈伤的生长速度和状态远不如1/2MS基本培养基上的愈伤好。经综合评价后认为,1/2MS基本培养基为成熟合子胚诱导愈伤组织的最佳基本培养基。
2.3 未成熟合子胚的发育阶段对愈伤组织诱导的影响
将未成熟合子胚接种于1/2M S附加2mg/L2,4-D、1.0mg/L6-BA、1.0mg/L KT的诱导培养基。不同发育阶段的幼胚,愈伤组织的诱导频率明显不同。同一发育阶段,不同基因型幼胚愈伤组织的诱导频率基本相同(表1)。
表1 合子胚的发育阶段对愈伤组织诱导的影响
Ta ble1 Ef fects of development stages of zygotic embryo on induction callus
基因型Genoty pe 采集时间
Date of
collection
接种方式
Ty pe of inoculation
诱导率
Indu ction
frequency%
基因型
Gen otype
采集时间
Date of
collection
接种方式
Type of inoculation
诱导率
Induction
frequency%
洋口112003-06-04连同胚乳一起接种0洋口112003-06-13连同胚乳一起接种0洋口112003-06-24连同胚乳一起接种0洋口112002-07-04连同胚乳一起接种4洋口112002-07-12连同胚乳一起接种2洋口112002-07-19连同胚乳一起接种4洋口112002-07-26连同胚乳一起接种2洋口112002-07-12剥出幼胚接种0洋口112002-07-19剥出幼胚接种12洋口112002-07-26剥出幼胚接种32洋口112002-08-05剥出幼胚接种78洋口112002-08-15剥出幼胚接种86洋口112002-08-25剥出幼胚接种90龙152002-07-06连同胚乳一起接种0龙152002-07-16连同胚乳一起接种4龙152002-07-24连同胚乳一起接种2
龙152002-07-31连同胚乳一起接种2龙152002-08-08连同胚乳一起接种4龙152002-07-31剥出幼胚接种24龙152002-08-08剥出幼胚接种56龙152002-08-20剥出幼胚接种81龙152002-08-30剥出幼胚接种85桃74-162002-07-06连同胚乳一起接种0桃74-162002-07-16连同胚乳一起接种6桃74-162002-07-24连同胚乳一起接种2桃74-162002-07-31连同胚乳一起接种4桃74-162002-08-08连同胚乳一起接种2桃74-162002-07-31剥出幼胚接种20桃74-162002-08-08剥出幼胚接种58桃74-162002-08-20剥出幼胚接种82桃74-162002-08-30剥出幼胚接种87
注:接种数量均为50个。
由表1可见,6月4日到6月24日间采集的洋口11号的球果、于7月6日采集的桃74-16号和龙15号的球果,其愈伤组织的诱导频率均为0。此时,合子胚处于发育的原胚阶段,愈伤组织的启动非常困难。接种后30d,外植体的形态未发生明显变化,40d后,开始变黄,随后褐化死亡。
7月4日到7月26日间采集洋口11号在的球果、于7月16日到8月8日间采集的桃74-16号和龙15号的球果,合子胚连同胚乳一起接种,愈伤组织的诱导频率为2%～6%。此时,合子胚处于发育的胚胎选择阶段或者胚的组织和器官分化阶段。愈伤组织的诱导频率虽然不高,但愈伤组织的生长速度快,外观状态很好,为晶莹透明的愈伤组织。接种后15d,可观察到少数大配子体产生松软透明的愈伤组织,25d后,这种愈伤组织的直径可达0.5～1.0cm。若不及时转入新鲜培养基进行继代培养,愈伤组织会停止生长,变黄褐化。
在7月19日到8月25日间采集的洋口11号的球果、于7月31日到8月30日间采集的桃74-16号和龙15号的球果,合子胚处于胚的组织或者器官分化及胚的成熟阶段。愈伤组织的诱导频率随着合子胚发育的成熟而迅速提高。处于组织或者器官分化阶段的合子胚,接种5d后,可观察到部分胚褐化,部分胚开始膨大,15d后,褐化的胚变黑,失去生命力,膨大的胚开始愈伤化。处于成熟阶段的合子胚,接种4d后,可观察到胚开始膨大,15d后,开始愈伤化,接种25d后,整个胚愈伤化为浅黄色、结构紧密的愈伤组织。
2.4 基本培养基和激素浓度对不定芽诱导的影响
选用M S、1/2MS、DC R、GD4种基本培养基,附加1.0mg/L6-BA、1.0m g/L KT、0.1mg/L
南京林业大学学报(自然科学版) 第30卷 第2期
NAA 。接种25d 后观察到愈伤A 和C 上有很小的绿色芽点分化,30d 后芽点发育为形态可辨的不定芽。观察统计后发现:以M S 、1/2MS 为基本培养基的诱导培养基上,愈伤A 、B 、C 均未诱导出不定芽,而DCR 、GD 基本培养基上愈伤A 和C 诱导出了不定芽(图1-B ),其中DC R 培养基上的诱导频率稍高于GD 培养基,这说明DCR 基本培养基较适合于杉木愈伤组织诱导不定芽发生。愈伤B 在各种培养基上都未诱导出不定芽
。
图1 试管苗再生过程
Fig.1 T he pro cedure of plantlet reg ene ratio n
以DCR 为基本培养基,附加6-BA (0.5～2.5mg /L )、KT (0.5～2.5mg /L )、NAA (0.1m g /L )。经观察发现:6-BA 、KT 浓度为1.5m g /L 时,愈伤组织诱导不定芽的频率较高,不定芽生长正常,是杉
木愈伤组织诱导不定芽的最佳浓度。愈伤A 和C 随着6-BA 、KT 浓度的增高,不定芽诱导频率提高(表2)。6-BA 、KT 浓度为0.5～1.5m g /L 时,不定芽形态正常,很少有玻璃化现象。6-BA 、KT 的浓度为2.0～2.5mg /L 时,不定芽伸长生长困难,呈球形,玻璃化芽明显增多,这是6-BA 浓度过高所致。
表2 基本培养基和激素浓度对诱导不定芽的影响
Ta ble 2 Effect of basal medium and hormone concentratio n on adventitious buds differentiation
基本培养基Basal medium
不定芽诱导频率Induction frequency of adventitious buds %愈伤A Callu s A
愈伤B C allus B
愈伤C Callu s C
激素浓度C on cen tration of hormone /(mg L -1)6-BA KT 不定芽诱导频率Indu ction frepuen cy of adventitiou s b uds %愈伤A Callus A 愈伤B Callu s B
愈伤C Callus C M S 0000.50.5140161/2M S 000 1.0 1.026034DCR 26034 1.5 1.5
42048GD
18
32
2.0 2.0560622.5
2.5
58
64
注:接种数量均为50个。
2.5 生根培养
高约1.5cm 的不定芽转接入生根培养基,生根率可达100%。接种7d 后,不定芽基部开始长出根原基,25d 后根原基可伸长到1～2cm (图1-C )。
3 讨 论
合子胚的不同发育阶段对离体培养的反应不同,仅特定时期内采集的球果比较容易诱导胚性愈伤组织。一般来说,在松属植物中,子叶前期的合子胚最适于诱导胚性愈伤组织,而云杉属中则子叶期种胚最好[13]。笔者发现,洋口11号在7月4日到7月26日、桃74-16号和龙15号在7月16到8月8日间采集的球果,能诱导出松软、晶莹透明的愈伤,诱导频率为2%～6%,胚性愈伤的状态和松属很多树种诱导出的胚性愈伤相似。此时,合子胚处于发育的胚胎选择阶段或者胚的组织和器官分化阶段,该阶段为杉木未成熟合子胚最容易启动胚性愈伤的时期。洋口11号在7月19日到8月25日、桃74-16号和龙15号在7月31到8月30日间采集的球果,剥出幼胚接种,随着幼胚发育的成熟,愈伤组织的诱导频率明显提高,外观形态与成熟合子胚诱导出的愈伤相似,为浅黄、不透明、结构稍紧密的愈伤组织,说
2006年 总第122期 席梦利等:杉木合子胚愈伤组织的诱导及植株再生
南京林业大学学报(自然科学版) 第30卷 第2期
明此时幼胚的生理状态已与成熟胚接近。
大量研究表明[14-15],基本培养基中NO-3和NH+4的含量是影响针叶树体细胞胚胎发生和不定芽分化的重要因素。一般情况下,只有明显降低NO-3和NH+4的含量时,才能促进体细胞胚胎的发育和诱导产生更多的分化芽[16]。杉木愈伤组织诱导和不定芽分化时,共选用了M S、1/2MS、DCR、S、GD5种基本培养基,这5种基本培养基中NO-3和NH+4的总含量从高到低依次为:M S为59.8mm ol/L、GD 为37.9mmo l/L、1/2MS为29.9mmo l/L、S为29.9mm ol/L、DCR为18.2mm ol/L。在诱导愈伤组织时,愈伤的褐化程度与培养基中NO-3和N H+4的总含量有相关性,随着NO-3和NH+4总含量的增加,愈伤的褐化程度加重。在诱导不定芽发生时,DCR、GD基本培养基上愈伤A和C诱导出了不定芽, MS、1/2MS培养基未诱导出不定芽,而GD基本培养基中NO-3和N H+4的总含量明显高于1/2MS基本培养基。这说明,基本培养基中NO-3和N H+4的含量不是影响杉木愈伤组织分化不定芽的主要因素,培养基中其他成分的含量和配比也非常关键。
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(责任编辑 郑琰炎炎)
愈伤组织诱导及观察
实验二愈伤组织诱导及观察 一.实验目的 通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。 二.实验内容 （一）、实验原理 植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。 愈伤组织的形成 从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。 起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素(如机械损伤、改变光照
再生性牙周手术
再生性牙周手术 发表时间：2012-08-10T11:01:31.903Z 来源：《中外健康文摘》2012年第19期供稿作者：冯军[导读] 自体骨：可取自口腔内的拔牙创、上颌结节、磨牙后区及颏部等处的骨质，也可取自口腔外的髂骨。 冯军（大兴安岭加格达奇地区第二人民医院 165000）【中图分类号】R782.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）19-0192-02 【关键词】再生性牙周手术 牙周组织再生(regeneration)指的是因牙周疾病而破坏了的牙周组织附着装置重新形成，即在原牙周袋内的根面上有新的牙骨质形成，并且有新的牙周膜纤维埋入其中，也就是形成了新附着。这与再附着的概念不同，再附着是指在因手术或机械作用将牙周膜分离的根面上牙周膜纤维重新附着，实际在此时的牙根面上仍有牙周膜纤维残存。再生性牙周手术是通过特殊设计的方法，在原已丧失支持组织的根面上重新形成新的牙骨质、牙周膜和牙槽骨，包括它们彼此间正常附着关系的形成。 1 植骨术 牙周植骨术是一种重建性牙周手术，是采用翻瓣术与骨移植或骨代用品植入相结合，达到刺激牙周组织再生，促使骨病变处新骨的形成，修复骨缺损，以达到理想的愈合。 1.材料 (1)自体骨：可取自口腔内的拔牙创、上颌结节、磨牙后区及颏部等处的骨质，也可取自口腔外的髂骨。但因从髂骨取骨痛苦较大，现已较少采用。 (2)异体骨或异种骨：有健康捐献者的新鲜冷冻骨、冻干骨、脱钙冻干骨、经特殊处理后只留下骨的框架结构的异种骨Bioss等。 (3)骨代用品：β磷酸三钙、羟基磷灰石、多孔羟基磷灰石、生物玻璃等。 2.适应证 二壁及三壁骨袋、Ⅱ度根分叉病变。 3.手术方法 (1)常规消毒，麻醉。 (2)受骨区的切口设计要保证黏骨膜瓣对受骨区的良好覆盖。 (3)翻瓣暴露骨袋，刮净骨袋内的病理性组织及结合上皮。除净龈下牙石，平整根面，明确袋的形态及骨壁数目。可行根面处理，然后将手术野冲洗干净。 (4)将准备好的植入材料送入骨袋内，使植入物与骨下袋口平齐。 (5)将瓣复位缝合，一定要使龈瓣将植入材料严密覆盖。 4.术后护理 术后护理极为重要，基本与翻瓣术相同，只是术后伤口的稳定性更为重要，可根据具体情况适当延长拆线时间，如术后10天拆线。 二引导性组织再生术 引导性组织再生术(guided tissue regeneration，GTR)的目的，是使由于牙周炎造成的已丧失的牙周支持组织再生，形成新附着性愈合。在牙周手术中利用膜性材料作为屏障，阻挡牙龈上皮在愈合过程中沿根面生长，阻挡牙龈结缔组织与根面的接触，引导具有形成新附着能力的牙周膜细胞优先占领根面，从而在原已暴露于牙周袋内的根面上形成新的牙骨质，并有牙周膜纤维埋入，形成再生组织的新附着。 1.适应证 (1)骨袋：窄而深的骨袋为GTR的适应证，骨袋过宽则效果差。有研究报道3壁、2壁骨袋疗效好，但近来也有研究显示骨壁的数目与疗效不相关，窄而深的1壁骨袋也能获得良好疗效。 (2)根分叉病变：下颌牙的Ⅱ度根分叉病变为适应证，但需有足够的牙龈高度。对于这类病变，GTR的疗效优于常规翻瓣术。上颌磨牙的Ⅱ度根分叉病变用GTR治疗，病变可有改善，但疗效结果不能肯定。对于Ⅲ度根分叉病变，有学者报告，用GTR治疗下颌磨牙Ⅲ度根分又病变，33％达到了完全闭合，33％达到部分关闭，另33％无改善。可见用GTR治疗此类病变可获得一定疗效，但结果不确定。 (3)龈退缩致根面暴露：Miller于1985年将牙龈退缩牙根暴露病变进行了分类： I类：龈缘退缩末达到膜龈联合处，邻面无牙槽骨或软组织的丧失。 Ⅱ类：龈缘退缩达到或超过膜龈联合，但邻面无牙槽骨或软组织的丧失。 Ⅲ类：龈缘退缩达到或超过膜龈联合，邻面牙槽骨或软组织有丧失，位于釉牙骨质界的根方，但仍位于唇侧退缩龈缘的冠方。 Ⅳ类：龈缘退缩超过膜龈联合，邻面骨丧失已达到唇侧龈退缩的水平。 对I类和Ⅱ类龈退缩，GTR治疗可获得根面的完全覆盖；对Ⅲ类龈退缩，根面可获得部分覆盖；Ⅳ类龈退缩则不是适应证。 2.膜性材料 用于GTR的膜性材料应具有下列特征：①生物相容性；②阻止上皮细胞移动生长；③在根面与膜之间能保存一定的间隙；④能与组织结合保证愈合过程中在组织中位置的稳定；⑤具有临床可操作性。 膜性材料分为两类：不可吸收性膜和可吸收性膜。不可吸收性膜：手术后愈合过程中，放置的膜不能降解吸收，需要第二次手术将膜取出。这类膜有乙酸纤维素滤膜、膨胀聚四氟乙烯膜等。乙酸纤维素膜是最早在GTR中使用的膜，因其具有一定的细胞毒性，所以在临床应用不理想。膨胀聚四氟乙烯的分子结构稳定，不引起任何组织反应，e—PTFE已成功地用于临床研究。是目前临床应用最多的膜材料。 可吸收性膜：在手术愈合中可降解吸收，不需要第二次手术取出。这类膜有胶原膜、聚乳酸膜、聚乳酸与聚乙交脂聚合物膜等。胶原膜已成功用于临床治疗，但有些胶原膜过早降解，有些在愈合时上皮会沿膜材料向根方生长，并可能具有引起机体免疫反应的危险等，这些是胶原膜目前存在的缺陷。聚乳酸材料具有良好的生物相容性，通过水解而降解，但在降解过程中可能有些组织反应。这种材料的降解期较长，可达到与不可吸收性膜相同的满意度。
小麦愈伤组织的诱导
小麦愈伤组织诱导与其再生培养体系的建立 前言：小麦属于禾本科植物，麦粒在植物学上称为颖果，在种子学上则称为种子，通常称为小麦。麦粒皮色有红白之分，红皮的叫红麦，白皮的叫白麦。由于品种和受环境影响不同，红皮小麦又有深红色和红褐色；白皮小麦又有白色、乳白色或黄白色之分。 一：目的及意义 我国小麦目前的状况有以下几点：1 我国是农业大国，小麦面积4亿亩、产量9000万吨左右，分别占世界总量的 12%和18%，均居世界第一位。2 我国春小麦主要分布在东北、西北及华北北部。据中国粮油信息中心的数据显示，预计中国 03/04市场年度（7月至次年6月）春小麦播种面积仅为190万公顷，较上年度减少5％，这是多年来中国春小麦种植面积首次低于200万公顷；预计03/04年度春小麦产量为580万吨，较02/03年度下降7.48%。我国的小麦种植面积不断的减小，总产量也在不断减少。由于我国目前存在的状况，农业大国，主产小麦，但小麦的产量的质量都不是很好，种植面积又在减少，本研究主要是提高小麦的产量和质量。 二：综述国内外对小麦的研究状况 2.1 小麦愈伤组织诱导及原生质体的分离与纯化张小红，闵东红，邵景侠（西北农林科技大学，陕西杨凌712100） 试验方法：以普通小麦的幼穗和幼胚为外植体进行了愈伤组织诱导，及由幼胚愈伤组织进行了原生质体分离和纯化试验，研究了幼穗和幼胚外植体及低温预处理等因素对愈伤组织诱导的影响，在原生质体分离中研究了酶浓度和配比、酶解时间及蔗糖浓度等因素对幼胚愈伤组织原生质体游离和纯化的影响。结果表明：小麦幼穗离体培养时，以1.0~1.5 cm长度的幼穗有利于愈伤组织的诱导；小麦幼穗和幼胚外植体采后低温储藏时不易超过3 天，时间太长会影响愈伤组织诱导；2.0%纤维素酶＋0.5%果胶酶+0.6 M甘露醇分离原生质体较好，最佳酶解时间为 4~6 h，原生质体产量和活力较高。 2.2 小麦愈伤组织诱导及其植株再生研究进展王廷璞，陈荃，崔爱明，刘瑞媛，马伟超 （天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃天水741001） 试验方法：小麦组织培养体系的建立与完善是应用植物基因工程改良小麦品质的重要基础和保证，综述了近年来小麦愈伤组织诱导及植株再生的研究情况。研究资料表明：小麦组织培养中，不同来源和不同生理状态的小麦外植体（幼胚、幼穗、花药、成熟胚、叶、根等），在愈伤组织诱导和获得再生植株的能力方面均显示了优点和不足。不足之处是在生产过程中，不断受到生物、非生物等因素的胁迫，严重影响其产量及品质。 2.3小麦愈伤组织诱导及其再生能力影响因素的研究贾海燕, 王洪刚 ( 山东 农业大学农学院, 山东泰安 271018) 试验方法：以农艺性状较好的24 份小麦品种( 系) 为材料, 筛选出了愈伤组织诱导率高且植株再生能力强的基因型材料山农995604 和F281- 10, 在此基础上对影响愈伤组织的分化能力以及较长时间保持分化能力的因素进行了研究。结果表明, 在愈伤组织的继代过程中, 保持较高浓度的2, 4- D, 或对愈伤组织进行交替继代培养有利于较长时间保持其再生能力。最佳取材时间在开花后15d 左右,
引导骨组织再生技术用于牙种植术的护理配合
引导骨组织再生技术用于牙种植术的护理配合目的：研究探讨引导骨组织再生（GBR）技术用于牙种植术的护理配合。方法：选择2015年 1月-2017年1月本院牙种植患者80例，根据随机数字表法分为两组，每组各40例。对照组采用常规入院护理，观察组采取综合护理干预，观察两组患者的治疗效果、满意度。结果：观察组满意度为97.5%明显高于对照组87.5%，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。观察组术后没有出现麻木、剧烈疼痛、不适感，没有种植体暴露、创口裂开、出血等，X线显示愈后较好。结论：对于牙种植患者，使用引导骨组织再生技术，可以有效改善术中骨组织不足的症状，对其进行综合护理干预可以提高治疗的效果的满意度，值得在今后患者的治疗过程中应用。 種植牙主要是指在缺牙位置的牙槽骨里面采取措施植入种植体，等到种植体和骨组织整合后，可以把它作为支持，从而对缺牙进行完整的修复，是现在临床上比较常用的治疗方法[1]。据不完全统计，种植牙的效果较好，成功率达到百分之九十以上[2]。但是也有患者在种植的时候需要配合引导骨组织再生技术进行修复，该技术对于种植成功率有很大的影响[3]。为此，本研究选择2015年1月-2017年 1月本院牙种植患者80例，把引导骨组织再生（GBR）技术用于种植牙的修复，同时进行综合性的护理配合，具体如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料选择本院2015年1月-2017年1月牙种植患者80例，根据随机数字表法分为两组，每组各40例。纳入标准：均取得所有患者的知情同意，临床资料齐全。排除标准：（1）不能正常沟通交流的患者；（2）其他严重内科疾病的患者；（3）临床资料不全的患者。本研究已经伦理学委员会批准，患者知情同意。 1.2 护理方法对照组采用常规入院护理，即告知患者种植牙的方法，注意事项等；观察组采取综合护理干预，具体如下。 1.2.1 术前护理（1）护理评估：首先对患者的具体情况进行合理的评估，了解患者的全身情况，对有禁忌证的患者要注意检查是否有高血压、心脏病、牙周疾病等，再询问并记录患者的生活习惯，看是否吸烟喝酒，以及是否有咬坚硬物的习惯[4-5]。（2）心理护理：术前大多数患者都会出现焦虑、紧张的情绪症状，特别是对于年纪较小或者是较大的患者来说更加明显。护理人员在进行护理时要和患者进行亲切的沟通交流，了解患者的具体需求，并告知其种植牙的过程、注意事项、时间、植骨的要求，住院花费等，以便于提高患者的认知水平，从而提高治疗的依从性[6-7]。告知患者如果感觉到身体不适的时候及时告诉护理人员，
植骨术加正畸引导骨组织再生的临床研究
龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/5614022376.html, 植骨术加正畸引导骨组织再生的临床研究 作者：薛超 来源：《健康必读（上旬刊）》2019年第08期 【摘 ;要】目的：探究植骨术加正畸引导骨组织再生治疗牙周炎骨缺损的临床效果。方法：选择我院自2016年1月至2017年12月收治的1例牙周炎骨缺损患者作为研究对象，对 其行植骨术加正畸引导骨组织再生术治疗，统计患者治疗后的症状改善情况，并对比患者治疗前和术后2周的骨缺损高度、牙槽骨密度、牙周袋深度及出血指数。结果：术后2周拆线可见，患者牙龈红肿症状消失，软组织愈合良好，且未见引导性组织再生膜外露，X线片检查显示骨袋底部钙化增加明显，已达根中1/3，术后3月对患者进行X线片检查复诊，原骨缺损处生出大量新生骨，远中面探针深度颊舌侧为3mm;术后2周，患者骨缺损高度（1.34±0.78）mm、牙周袋深（2.71±0.23）mm及出血指数（0.63±0.11）均显著低于术前（4.15±1.22）mm、（5.16±0.85）mm、（1.48±0.52），患者牙槽骨密度（725.13±10.82）HU顯著高于术前（610.78±9.45）HU，前后对比具有统计学意义（P结论：植骨术加正畸引导骨组织再生治疗牙周炎骨缺损的临床效果显著，值得应用和推广。 【关键词】植骨术;正畸引导骨组织再生术;牙周炎骨缺损 【中图分类号】R782.1;;;;;;【文献标识码】A; ;;;;【文章编号】1672-3783（2019）08-0127-01 牙周炎骨缺损是一种由牙周炎发展而来的口腔疾病，指的是牙周炎发展至中晚期引发患者牙槽骨缺损和形成深的牙周袋[1]。其不仅会对患者口腔的外在美观性和牙齿咀嚼功能造成严重的影响，同时，还易导致其牙齿松动、脱落等，从而对患者日常生活和预后质量造成严重的影响，因此，需积极探寻有效方案对患者进行治疗[2]。以往，临床多采用植骨术对患者治疗，虽具有一定的效果，但整体疗效有待加强，我院在植骨术的基础增加正畸引导骨组织再生术对1例牙周炎骨缺损患者进行治疗，获得了满意效果。现将植骨术加正畸引导骨组织再生治疗牙周炎骨缺损的临床效果分析报告如下。 1 资料与方法 1.1一般资料
引导组织再生膜的开发
各位老师、同学，下午好，，欢迎参加我的毕业答辩。 我的汇报分为以下5个方面，首先是研究背景和立题依据。 肿瘤、感染、外伤、手术等均可导致骨缺损。如果缺损小于临界骨缺损，则其可以自行愈合，而当缺损大于临界值，则需要一定的治疗手段辅助其愈合。自体骨移植是骨缺损修复的金标准，但是由于供骨量有限，且会对患者造成二次损伤，使其在应用中受到极大制约。随着骨组织工程的发展，骨组织工程支架和引导组织再生膜将逐渐取代传统的治疗方法。 GTR膜覆盖于缺损区域，主要是作为物理屏障阻止生长速度较快的纤维结缔组织长入，为骨组织的生长提供空间，从而使骨生成细胞从邻近的骨缺损边缘或骨髓组织迁移入缺损区域，在无干扰的情况下完成骨再生 以种植体周围骨量不足为例，如果牙槽脊萎缩等情况造成种植体周围骨量不足，直接缝合皮瓣，会造成纤维样修复，导致种植体松动从而失败。如果在缺损处覆盖GTR膜，则可以形成物理屏障，阻止软组织侵入，为骨组织生长提供空间，最终缺损形成新骨。GTR膜可以和骨组织工程支架一起使用，在阻止软组织长入的同时，防止骨粉的外溢。 鉴于GTR膜的使用目的，要求----良好地生物相容性, 合适的支撑强度, 在体内保持一定时间。目前，市场上的GTR膜分为可吸收和非可吸收，每种膜片都有其优缺点。 非可吸收膜以聚四氟乙烯膜为代表，其具有良好的稳定性和生物相容性，机械性能良好，能较好地维持空间形态，且可以根据需要调整其在体内的滞留时间。但是给其不能降解，所以需要二次手术取出。可吸收膜以盖氏公司的胶原膜为代表，其为双层不对称膜片，上层致密可阻止软组织的长入，下层疏松，可为骨组织的生长提供支架。可吸收膜往往降解过快，机械强度较差，易发生塌陷。 所以理想的GTR膜片应当具备良好地生物相容性、适当的降解速度、降解产物无毒性，可阻止上皮细胞的长入，具有一定的机械强度和良好地可操作性 壳聚糖及其衍生物因具有良好地生物相容性、抗菌、可降解等优点，所以广泛应用于医用生物材料领域。本研究欲筛选出一种壳聚糖衍生物，调控其降解速度，探究合适的方法来构建一种组织引导再生膜。 第一部分实验，进行了材料的筛选和膜片的制备 实验中选择了对骨修复有促进作用的四种材料----。首先提取了大鼠骨髓间充质干细胞，用MTT法检测了四种材料在不同浓度下对细胞增殖的影响。结果显示在糖的浓度为200μg/ml 时对细胞的影响最为明显。由图片可知，除了磺酸化壳聚糖对细胞的影响表现出先促进后抑制，其他三种糖均对细胞表现出不同程度的促进作用。所以，最后我们选择了促进作用最为明显的羧甲基壳聚糖和硫酸软骨素构建膜片。 但是以羧甲基壳聚糖和硫酸软骨素为原材料构建的膜片机械性能较差,且呈现弱酸性，这可能会导致膜片支撑强度不足，引起炎症反应，所以我们在膜片中添加一定的纳米羟基磷灰石。，羟基磷灰石是天然骨的主要的无机成分，具有极好的生物相容性和骨诱导能力，且呈弱碱性，可以提高膜片机械强度中和膜片中酸性物质。将含有不同比例纳米羟基磷灰石的膜片制出浸提液，通过细胞毒性实验来选择合适的比例。结果显示含有--- 综合膜片的细胞毒性和机械强度，最终选择添加10%纳米羟基磷灰石。 确定了原材料后，进行了膜片的制备工作，过程如下。先将羧甲基壳聚糖、硫酸软骨素、纳米羟基磷灰石、Nacl、DMSO配制成溶液，流延法铺膜，表面加入DMSO后放入-80度中冷冻，然后用CaCl2和1,4-丁二醇双缩水甘油醚进行交联，交联完成后清洗记得到我们需要的膜片。经测量，膜片的厚度为0.03mm，机械性能良好，左图为膜片的纵截面，上表面较为致密，下表面疏松多孔，下表面的横截面如右图所示，孔径约为50-200μm。 第一部分实验所得出结论如下， 羧甲基壳聚糖和硫酸软骨素可以促进BMSCs的增殖，以羧甲基壳聚糖、硫酸软骨素和纳米羟基磷灰石为原料，所构建的膜片为双面不对称膜片，膜片具有良好地机械性能 然后，在第二部分实验对膜片的生物安全性和降解性能进行了验证
愈伤组织的诱导和培养
班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223 愈伤组织的诱导和培养 一、实验目的及意义 植物愈伤组织的诱导和培养在植物科学的基础研究和应用研究中都有重要的意义。通过本次实验，可以初步掌握植物外植体材料消毒、接种的无菌操作技术，愈伤组织的诱导方法和愈伤组织继代培养的方法。 二、实验原理 植物组织与细胞培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择适当的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得植物组织培养，成功的基本前提和重要保证。由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织（callus）。植物生长调节剂如2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）等是诱导外植体形成遇上组织的重要因素。 三、实验仪器与药品 超净工作台，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，75%乙醇，酒精消毒棉 材料：烟草无菌苗，甘薯无菌苗 四、实验步骤 1.按下表分别配制培养基
将配置的四种培养基分别分装入20个培养瓶，高温灭菌后水平放置凝固 2.接种前，将实验所需器具放入超净工作台，打开紫外灯灭菌20~30min，关闭紫外灯，开启通风开关。洗手后用酒精喷洒消毒手、手臂、实验材料及培养基外部等进入超净工作台的部分。进入超净工作台，用酒精棉擦拭台面（手勿伸出工作台），台面完全风干后点燃酒精灯。 3.接种开始时，将镊子及手术刀在酒精中浸泡，并在酒精灯外焰上烧炽片刻，充分冷却。取幼嫩的烟草（甘薯）叶片，用手术刀切割成小片，再用镊子将其接种至相应的培养基上，每瓶接种3~5片，封口后取出超净工作台，标注姓名、日期、培养基和接种材料。 4.将上述培养材料常温暗培养，每隔7天观察一次，并记录培养情况 五、实验结果
8.引导骨再生(一)硬组织处理引导骨再生技术(一)
引导骨再生技术（一） 讲师：Dr. Lim Sang-Chul 硬组织处理 微创手术 ?某些骨增量技术是由于解剖或生理条件限制而提出的。然而因为带来多次手术、额外费用和更长的治疗时间，造成许多病人难以接受。 用于后牙区的短种植体 ?近年来，短种植体临床应用越来越多?短种植体减少了骨增量操作 ?还可减少类如上颌窦穿孔和下唇麻木等种植风险 Nobel Shorty Dentium Superline Branemark Shorty 使用短种植体时的考虑要点 ?是否能获得很好的初期稳定性?避免单端桥Five ‐year clinical evaluation of short dental implants placed in posterior areas: a Retrospective study ‐Survival rates: 99.2%(Anitua et al., J Periodontol 2008) ?尽量消除侧向力 ?分散夹板带来的压迫力量 Straumann短种植体
又粗又短的种植体 Dentium Superline FX7008SW 窄颈种植体 ?窄颈种植体有很高的成功率和留存率（99.4%）， 与常规直径种植体相近 ?未检查到种植体折裂 ?不同窄颈种植体类型未发现明显差异 (Degidi et al., J periodontol2008)
术后26个月Narrow ridge 窄牙槽嵴 空间填充 某些病例，既可以做GBR，也可以单纯填充缺失空间
种植体侧穿做松弛切口 骨移植材料必须填于缺损部位和骨膜之间 引导骨再生（GBR） ?骨量不足，不管是局部不足还是整体不足，都是种植治疗中的巨大挑战。目前已有充分研究证实，引导组织再生可应用于种植体周围的骨组织重建。 ?屏障膜的目的是隔离出骨新生的空间，诱导骨组织在未完全埋入的种植体表面生长(Dahlin and Senner by1991) 。 ?牙槽嵴增宽效果与具体手术步骤和术者经验有很大关系，而种植体的留存率则与种植体周的骨组织有关，与骨移植材料关系不大。 GBR成功要点 ? 1.使用合适的屏障膜 2. 软组织初期关闭 3. 维持空间 4. 骨粉和屏障膜位置要稳定 5. 足够的愈合时间
引导骨再生膜技术
引导骨再生膜技术 第十六章引导骨再生膜技术 膜技术的原理及技术 膜的分类及用途 骨缺损GBR膜植入术(以不可吸收Gore-Tex膜为例) 膜技术的原理及作用 引导骨再生的生物膜技术(Guided Bone Regeneration，GBR technique)最早始于牙周病学领域，称为引导组织再生技术(guided tissue regeneration，GTR technique)。根据各类不同组织细胞迁移速度不同，即上皮细胞、纤维组织细胞比形成牙骨质、牙周韧带及骨组织的细胞快，采用生物材料人工制成一种带微孔的生物膜，起屏障作用，以阻止软组织中成纤维细胞及上皮细胞长入骨缺损区，避免这些细胞与有骨生成能力的细胞产生竞争抑制，保护血块的稳定，维持血块充填的间隙，使有骨生成能力的细胞缓慢进入骨缺损区，修复骨缺损。 ________________________________________ 返回页首 膜的分类及用途 GBR膜有不可吸收（生物不降解）及可吸收（生物降解）两类。不可吸收
膜以聚四氟乙烯膜（expended polytetrafuorethylene-ePTFE,又称 Gore-Tex膜）临床应用最多，它又分两种类型：一种为中间硬，边缘柔软，微孔为0.45um，孔大允许结缔组织长入；另一种为膜中加钛网支架或聚丙烯网架，以保持骨缺损间隙。可吸收膜目前尚不成熟，有聚乳酸膜、聚乙烯酯膜、共聚物膜及胶原膜等，但因其降解速度与成骨速度的控制尚不理想，临床应用受到限制。GBR膜技术应用于种植外科始于80年代末 90年代初，已取得了满意的效果，有很好的应用前景。 ________________________________________ 返回页首 骨缺损GBR膜植入术（以不可吸收Gore-Tex膜为例） 【适应证】 ⑴术前增加种植区因失牙后或外伤缺损之骨量； ⑵拔牙后即刻种植种植体颈部骨缺损； ⑶种植手术中造成的骨裂开或骨旁穿； ⑷由种植体周围炎造成的骨吸收。 【术前准备】 ⑴全身情况、口腔检查及Ｘ检查，同一般种植手术。 ⑵准备生物膜：根据骨缺损准备好适当大小的生物膜（ePTFE，Gore-Tex 膜）及固定钛螺钉； ⑶备好植骨材料：如取自体骨，应先选定取骨部位及骨科手术器械。 【麻醉及体位】 同拔牙麻醉。患者取平卧位，手术者在头顶或右侧。
实验1 愈伤组织的诱导
实验1 愈伤组织的诱导 1、实验目的 （1）学习植物材料表面灭菌的常规方法； （2）了解接种的无菌操作技术； （3）学习诱导植物器官形成愈伤组织的方法。 2、实验原理 植物组织培养是应用无菌操作的方法，培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。 由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上，可以通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织。 3、实验仪器和试剂 仪器：超净工作台、光照培养箱、酒精灯、打火机、记号笔、脱脂棉、75%酒精及棉球。 无菌器材：无菌吸水纸（定性滤纸）、灭菌培养皿、无菌水、镊子、解剖刀。 植物材料：直根胡萝卜、烟草叶片。 试剂：95%乙醇、0.1%氯化汞。 培养基：MS+1mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+10g/L琼脂,pH5.8 4、实验步骤 （1）接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种间紫外灯，照射约30 min，然后关闭紫外灯，通风20 min后，打开日光灯即可进行无菌操作。 （2）外植体预处理：将胡萝卜根用流动的自来水冲洗干净，用小刀削去其表皮1-2mm，切成大约15-20mm厚的块段。 （3）以75%乙醇棉将手擦试一遍。以下操作全部在无菌条件下进行。
（4）外植体消毒：用0.1%的升汞消毒1min-3min（烟草叶片消毒10秒钟左右）,然后用无菌水中漂洗3次，每次2分钟。 （5）将胡萝卜片放入垫有无菌滤纸的培养皿中，一手用消毒好的镊子固定胡萝卜，一手用灭菌后的解剖刀切除胡萝卜块段截面的表面部分，余下部分切成包含形成层的长、宽约5mm，厚约5mm的小块。在完成切割后，将解剖刀和镊子放入95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后，放回原处，待冷却后即可使用。注意：在每一次使用镊子、解剖刀后，都要对其消毒一次。 （6）接种：在酒精灯焰附近处，用无菌镊子夹取胡萝卜薄片并迅速半插入琼脂培养基上，每皿放4-5片，注意将近根尖的一面接触培养基。将培养皿口在酒精灯焰上小心地轻转灼燎数秒，立即用封口膜封好瓶口。 （7）培养：将接种后的三角瓶放到光照培养箱中，在25℃下的黑暗中培养3-4周。 5、结果记录与分析 （1）接种1周-10天后，调查、计算污染率： 污染率(%)=污染的材料数/接种材料数×100% （2）每周观察并记录胡萝卜外植体产生愈伤组织的情况，包括出现愈伤组织前培养物的形态，愈伤组织出现的时间以及愈伤组织的形态特征（愈伤组织的颜色、质地等），4周后调查、计算愈伤组织诱导率： 诱导率（%）=形成愈伤组织的材料数/接种材料数×100% 6、思考题 （1）分析影响愈伤组织诱导的主要因素。 （2）以胡萝卜为材料为什么要强调要切取含有形成层部分，胡萝卜其它部分（如茎、叶、花）能否诱导出愈伤组织？ 实验二真菌菌丝DNA提取 1实验目的 学习利用CTAB法少量提取真菌菌丝体DNA，同时掌握在DNA提取中各
愈伤组织诱导及观察
一.实验目的 通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。 二.实验内容 （一）、实验原理 植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。 愈伤组织的形成 从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。 起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素(如机械损伤、改变光照强度、增加氧等)和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出
实验二 植物组织培养2-愈伤组织的诱导
中国海洋大学实验报告 2015 年 4 月23 日姓名###云年级BBB专业UUUUUU学号HHHHHHHHHHHH 课程细胞工程学实验题目植物愈伤组织诱导实验 一、实验目的 1、掌握植物愈伤组织诱导、继代、器官分化的原理； 2、掌握植物组织接种培养的整个无菌操作的过程； 3、熟悉超净工作台的使用。 二、实验原理 植物组织培养是将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。超净工作台是一种水平单向流型局部空气净化设备。 三、实验仪器试剂 1、仪器：镊子、解剖刀、烧杯、酒精灯、试剂瓶、含有培养基的培养瓶、培养皿、金属盘、记号笔 2、用品：胡萝卜、75%酒精、10%次氯酸钠、无菌水 四、实验步骤： （1）用70～75%的酒精棉擦拭双手和操作台面，进行常规的无菌操作准备。
（2）将植物体用准备好的自来水冲洗后,用酒精棉擦拭取材部位表面, 于70%酒精中浸沾数秒钟。 （3）将材料放入已灭菌的100ml试剂瓶中，加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡5分钟。（4）弃次氯酸钠浸泡液，再加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡10分钟。 （5）弃次氯酸钠浸泡液，用准备的无菌水浸泡漂洗3～4次，每次1～2分钟，用无菌镊子搅动。 （6）将已灭菌的植物材料置于平板内，按无菌操作要求剥去外皮，用解剖刀切成5mm 厚的薄片，弃去两头的两片，取中间部分的薄片，用镊子将其接种在愈伤组织诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶4～6片，均匀分散。 （7）将瓶口和瓶盖在酒精灯火焰上方一过，拧紧瓶盖。 （8）在培养瓶下部的培养基高度位置作记号。 （9）将接种后的三角瓶，培养于25℃光照条件下20天左右. （10）实验结束后用过的仪器等恢复原样，清洁实验台面，一切东西归位。 五、实验现象及结果 （1） 刚开始正常生长，从第二节实验课开始直至实验课结束，持续观察中发现组织块
植物愈伤组织诱导培养实验指导--李老师
植物组织培养基的配制与植物愈伤组织诱导 一、实验目的； 通过植物组织培养基和植物愈伤组织诱导实验的学习和训练，使学生了 解植物组织培养的基本原理和操作技术，初步掌握MS固体培养基制备 方法、外植体的常规灭菌技术以及愈伤组织诱导方法。 二、实验原理： 根据植物细胞全能性原理，培养植物材料。即在无菌条件下，将植物的器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）放在人工培养基上进行培养，通过细胞分裂，形成一团薄壁细胞，即愈伤组织。愈伤组织可以在适宜的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下进行再分化，重新产生出植物的各种器官和组织，进而发育成完整的植株。 三、实验内容实验包括以下3部分内容: 实验1-1、植物组织培养基母液的配制和保存 实验1-2、MS培养基的配制与灭菌 实验1-3、胡萝卜愈伤组织的诱导 实验1-1植物组织培养基母液的配制和保存 1、目的要求学习植物组织培养基母液的配制方法，为培养基的配制 做准备。 2、基本原理植物培养基是植物离体培养的组织或细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供近似活体生存的营养环境，主要包括水、大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖、凝固剂和植物生长调节等物质。
在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将培养基成分首先配 制成比实际培养基浓度大若干倍的母液，然后在配制培养基时，再根据所需浓度，按比例稀释。本实验以MS培养基为例，学习培养基母液的 配制。 MS培养基母液可分为：MS大量元素母液、MS微量元素母液、MS铁盐母液和MS有机化合物母液等。另外，还要配制生长激素母液，在不同类型的培养基中使用。 3、实验仪器设备和试剂3.1仪器、用具 分析天平、酸度计（或pH试纸）、冰箱、药匙、玻棒、称量纸、滴管、洗瓶、记号笔、烧杯（50ml、100ml、200ml）、容量瓶（100ml、500ml、 1000ml）、磨口试剂瓶（100mL、200mL、500ml、1000ml）、量杯、量 筒、移液抢、微波炉等。 3.2试剂 （1）95%乙醇、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。 （2）MS培养基成分： ①大量元素（母液I ）: NHNO、KNO CaCb2H2O MgSO7mO KHPO; ②微量元素（母液口）: KI、HBQ MnSQ4H2O ZnSQ.7H2O NQM0Q.2H2O CuSQ5H2O C0CI2.6H2Q；③铁盐（母液川）:FeSQ.7H2Q NQ.EDTA.2H2Q； ④有机成分（母液,维生素和氨基酸）：肌醇、盐酸吡哆醇（维生素&）、烟
植物愈伤组织诱导培养基的配制
实验一植物愈伤组织诱导培养基的配制 一、实验目的 1、掌握植物愈伤组织诱导、继代、器官分化的原理。 2、培养基的配制，灭菌等基本实验操作技术。 二、实验原理 植物组织培养是将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。 三、仪器试剂 培养皿及培养架、光照培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、解剖刀、弯头镊子、剪子、100ml烧杯、培养皿（或不锈钢浅盘）、封口膜、棉线、橡皮筋、次氯酸钠（或HgCl2）、MS 培养基全部试剂、植物激素及生长调节物质、无水乙醇、工业酒精、胡萝卜 四、实验步骤 1、培养基的制备 ①用于配制培养基的水最好是三蒸水。 ②所用的各种化学药品：分析纯级别的试剂，避免药品的交叉污染和混杂。 ③配制培养基最方便的方法是预先配制好不同组分的培养基母液，存放在2～4℃冰箱内，使用时按比例稀释配用即可。 2、MS培养基的制备 ①按照配方配制培养基时,先将储存母液按顺序摆放好，根据欲配制的总体积，量取各种不同体积的母液，加入2，4-D(2mg/L)，先加三蒸水至大约400ml。 ②称取加入蔗糖(浓度3%)，调节pH至5.7-5.8。
③加入琼脂（8-9g/L）加热搅拌溶解，沸腾后立即端离火源（第一个大气泡从缸底上升顶破泡沫层），分装在100ml的三角培养瓶中（一般以容器的1/3～1/4体积为宜），拧紧瓶盖。（培养基的pH值直接影响培养物对离子的吸收，过酸或过碱不仅影响到培养材料的生长，而且还影响到琼脂的凝固。 经高压高温灭菌后，由于某些成分的降解或氧化，酸度会增加（pH值一般可降低0.2），因此调整pH值时应加以考虑。） 3、灭菌 放入高压蒸汽灭菌锅灭菌，1.1kg·cm-2，121℃保持15～20分钟即可。为保证灭菌彻底，在增压前应先将灭菌锅内的冷空气排尽，当灭菌完成后，应切断热源，待锅内气压接近“0”时，方可打开放气阀，将余气放尽，再打开灭菌锅。 4、培养基的存放 经高压灭菌的培养基凝固后，宜放在培养室中预培养3～5天，若没有污染才可使用。暂时不用的培养基应放置在10℃以下保存，而含有生长调节物质的培养基则在4～5℃低温下保存更好。 5、植物愈伤组织诱导培养基的制备 1、每2人一小组，自由组合，固定。每5小组为1中组 2、MS培养基的配制 a、母液的配制（已准备好） b、培养瓶洗刷（每人一个） c、每中组配制500mlMS培养基，（含琼脂4.5g，蔗糖15g，2,4-D母液1ml），调节 PH，分装，灭菌 3、每人准备100ml/瓶去离子水→灭菌（无菌水) 4、每人100ml烧杯/试剂瓶→灭菌（无菌烧杯） 5、每2人一套平板，清洗，灭菌 每一中组的同学分工合作完成上述工作 五、实验结果 MS培养基植被完成。植物组织培养前期准备完成。 六、思考题 注意事项： 1、实验过程中保持安静 2、不浪费 3、学会试剂的配制，母液的稀释等 4、提前预习实验 5、所有的东西都要即时标记好，日期，名称，浓度等(标注可以组别-姓名，如1-姓名或1-姓名单字母缩写） 6、自己用过的器皿要自己洗刷，并灭菌，以备下组同学使用。 7、实验结束后用过的仪器等恢复原样，清洁实验台面，一切东西归位，每天最后一组同学统一打扫卫生。 思考题： 1、培养基配制应注意哪些问题？ 答：1、试剂称取时要准确；2、不要浪费；3、注意调节pH；4、器皿要清洗干净；5、培养基分瓶时要及时否则会凝固。
植物愈伤组织诱导实验
中国海洋大学实验报告 姓名：马宁专业年级：生命基地班2009级学号： 040212009020 课程：细胞工程实验题目：植物愈伤组织诱导实验 一.实验目的 掌握植物愈伤组织诱导的原理和方法。 二.实验原理 1、植物组织培养： 无菌条件下，培养植物的组织、器官以至单个细胞，使其分裂、增殖和分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在人工培养条件下，脱分化形成愈伤组织，愈伤组织又再分化根和芽等组织和器官。 2、植物激素控制器官分化理论。 3、超净工作台工作原理 本工作台是一种水平单向流型局部空气净化设备 室内空气→预过滤器(初滤) →小型离心风机压入静压箱→高效空气过滤器(精滤) →出风面吹出洁净气流(具有一定的、均匀的断面风速）→不断排除工作区原来的空气→形成高洁净的工作环境。 三.主要仪器试剂 每人：培养瓶（内含培养基）1个、100mL去离子水1瓶、100mL空试剂瓶1个； 两人：超净台 胡萝卜 无菌器皿、用具的准备：用酒精擦拭盘子、解剖刀及镊子，灼烧后冷却。 四.实验操作步骤 植物愈伤组织诱导 （1）用70～75%的酒精棉擦拭双手和操作台面，进行常规的无菌操作准备。 （2）将植物体用自来水冲洗后，用流水冲洗片刻后洗净，切段（5cm左右）。先在70%酒精中浸泡数秒。 （3）将材料放入已灭菌的100 ml烧杯中，加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡5分钟。（4）弃次氯酸钠浸泡液，再加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡10-15分钟。
（5）弃次氯酸钠浸泡液，用无菌水浸泡漂洗3～4次，每次1～2分钟，用无菌镊子搅动。（6）将已灭菌的植物材料置于灼烧后冷却的金属盘中或灭菌过的培养皿中，按无菌操作要求剥去外皮，用解剖刀将胡萝卜切去表皮和中柱，取皮层部分，切成0.5cm3的小块。弃去两头的两片，取中间部分的薄片，用镊子将其接种在愈伤组织诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶4～6片，均匀分散。 （7）将瓶口和瓶盖在酒精灯火焰上方一过，拧紧瓶盖。 （8）在培养瓶下部的培养基高度位置作记号。 （9）将接种后的三角瓶，培养于25℃黑暗条件下，20天左右观察，看外植体是否逐渐膨大形成愈伤组织。愈伤组织的形成标志着接种的外植体已脱离分化状态，开始重新恢复分生能力。 五.实验结果 我自己的胡萝卜褐化了。 以大组总瓶数为样本总数，每瓶为样本个体，统计记录愈伤组织诱导培养的出愈率、污染率和其他现象。 样本总数：26瓶 污染：13瓶 褐化：7瓶 出愈率：23.08% 污染率：50% 褐化率：26.92% 六.思考题 1.以大组总瓶数为样本总数，每瓶为样本个体，统计记录愈伤组织诱导培养的出愈率、污染率和其他现象。 答：在众多污染的培养基中，有的是长满了白色厚厚的丝状菌毛，有的铺遍了绿色的苔藓状的菌落，还有的是一半金色菌落，一半绿色菌落。 我自己的胡萝卜完全褐化了，连培养基的颜色也变成了褐色，胡萝卜和培养基基本快要融合在一起。另外，培养瓶外壁不够透明，也不便于观察。 统计结果见上。 2.你如何认识无菌操作对植物组织培养的重要性？你认为在具体操作时还应注意那些事项？ 答：无菌操作是植物组织培养的基础。做不到无菌操作，组织培养是根本不可能良好的进行
愈伤组织诱导及观察
实验二愈伤组织诱导及观察 .实验目的 通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。 二.实验内容 （一）、实验原理 植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。 愈伤组织的形成 从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。
起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素（如机械损伤、改变光照强度、增加氧等）和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出现愈伤组织。在植物组织培养中沿用了愈伤组织这一名词，但是植物组织培养中诱导外植体细胞分裂形成的愈伤组织，大都不是损伤的结果。外源的生长素类物质对诱导细胞开始分裂效果很好，因此生长素类物质在植物组织培养中得到广泛应用，常用的有2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、吲哚乙酸和细胞分裂素等。 分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。 处于分裂期的愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。外植体的脱分化因植物种类、器官来源及其生理状况的不同而有很大差别。例如，烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难；花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难。 分化期是指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞，等等。外植体的细胞经过起动、分裂和分化等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（如2?4周）将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。 愈伤组织的形态发生方式 经过起动、分裂和分化期产生的愈伤组织，其中虽然发生了细胞分化，但是 并没有器官发生。只有满足某些条件，愈伤组织的细胞才会发生再分化，产生芽