微生物基因组测序分析策略

DNA测序常见问题及分析

DNA测序过程可能遇到的问题及分析对于一些生物测序公司（如Invitrogen等），我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题，但几天后的测序结果却无法另人满意。为什么呢？ PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理，通常PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿峰），也就是双脱氧核甘酸ddNTP终止反应的位置之前的A,A后的信号会迅速减弱。 N值情况一般是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰。该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器377以下的测序仪无法正确判断出为何碱基。有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。在序列的3’端易产生N值。一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基（ABI3730可以达到1200bp），但是，只有一般600bp以前的碱基是可靠的，理想条件下，多至700bp的碱基都是可以用的。一般在650bp以后的序列，由于测序毛细管胶的分辩率问题，会有许多碱基分不开，就会产生N值。测序模板本身含杂合序列，该情况主要发生在PCR产物直接测序，由于PCR产物本身有突变或含等位基因，会造成在某些位置上有重叠峰，产生N值。这种情况很容易判断，那就是整个序列信号都非常好，只有在个别位置有明显的重叠峰，视杂合度不同N值也不同。测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的，所以就看不到引物序列。有两种方法可以得到引物序列。1.对于较短的PCR产物（<600bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测通，可以在序列的末端得到该引物的反向互补序列。对于较长的序列，一个测序反应测不通，就只能将PCR产物片段克隆到载体中，用载体上的通用引物(T7/SP6)进行测序。载体上的通用引物与所插入序列间

全基因组重测序数据分析

全基因组重测序数据分析 1. 简介(Introduction) 通过高通量测序识别发现de novo的somatic和germ line 突变，结构变异-SNV，包括重排突变（deletioin, duplication 以及copy number variation）以及SNP的座位；针对重排突变和SNP的功能性进行综合分析；我们将分析基因功能（包括miRNA），重组率（Recombination）情况，杂合性缺失（LOH）以及进化选择与mutation之间的关系；以及这些关系将怎样使得在disease（cancer）genome中的mutation产生对应的易感机制和功能。我们将在基因组学以及比较基因组学，群体遗传学综合层面上深入探索疾病基因组和癌症基因组。实验设计与样本（1）Case-Control 对照组设计；（2）家庭成员组设计：父母-子女组（4人、3人组或多人）；初级数据分析 1．数据量产出：总碱基数量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads统计，测序深度分析。 2．一致性序列组装：与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。3．SNP检测及在基因组中的分布：提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。并根据参考基因组信息对检测到的变异进行注释。 4．InDel检测及在基因组的分布: 在进行mapping的过程中，进行容gap的比对并检测可信的short InDel。在检测过程中，gap的长度为1~5个碱基。对于每个InDel的检测，至少需要3个Paired-End序列的支持。 5．Structure Variation检测及在基因组中的分布: 能够检测到的结构变异类型主要有：插入、缺失、复制、倒位、易位等。根据测序个体序列与参考基因组序列比对分析结果，检测全基因组水平的结构变异并对检测到的变异进行注释。

Ion torrent微生物(细菌)全基因组重测序文库构建实验方案

微生物（细菌）全基因组重测序文库构建实验方案一、重测序原理全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。二、技术路线 ↓基因组DNA提取细菌DNA（纯化） ↓超声波打断 DNA片段化 ↓ 文库构建 ↓Ion OneTouch 乳液PCR、ES ↓Ion PGM、Ion Proton 上机测序 ↓ 生物信息学分析三、实验方案 1.细菌总DNA的提取液氮速冻、干冰保存的细菌菌液：若本实验室可以提供该细菌生长的条件，则对菌液进行活化，培养至对数期时，对该细菌进行DNA提取；若本实验室不能提供该细菌的生长条件，则应要求客户提供尽可能多的样本，以保证需要的DNA量。细菌DNA采用试剂盒提取法（如TianGen细菌基因组提取试剂盒）。取对数生长期的菌液，按照细菌DNA提取试剂盒操作步骤进行操作。提取完成后，对基因组DNA进行纯度和浓度的检测。通过测定OD260/280，范围在1.8-2.0之间则DNA较纯，使用Qubit对提取的DNA进行定量，确定提取的DNA 浓度达到文库构建的量。

2.DNA片段化采用Covaris System超声波打断仪（Covaris M220），将待测DNA打断步骤： 1）对待打断的DNA进行定量，将含量控制在100ng或者1μg 2）打开Covaris M220安全盖，将Covaris AFA-grade Water充入水浴容器内，至液面到最高刻度线（约15mL），软件界面显示为绿色 3）将待打断DNA装入Ep LoBind管中，其中DNA为100ng或1μg，加入Low TE 至总体积为50mL 4）将稀释的DNA转移至旋钮盖的Covaris管中（200bp规格），转移过程中不能将气泡带入，完成后旋紧盖子 5）选择Ion_Torrent_200bp_50μL_ScrewCap_microTube，将对应的小管放入卡口，关上安全盖，点击软件界面“RUN” 6）打断结束后，将混合液转移至一支新的1.5mL离心管中 3.末端修复及接头连接 3.1 末端修复使用Ion Plus Fragment Kit进行，以100ng DNA量为例，各组分使用前瞬时离心2s 步骤： 1）加入核酸酶free水至装有DNA片段的1.5mL离心管中，至总体积为79μL 2）向体系中加入20μL 5×末端修复buffer，1μL末端修复酶，总体积为100μL 3）室温放置20min 3.2 片段纯化片段纯化使用Agencourt AMpure XP Kit进行步骤： 1）加入180μL Agencourt AMpure XP Reagent beads于经过末端修复的1.5mL离心管中，充分混匀，室温放置5min

微生物基因组研究

微生物基因组研究微生物是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活密切相关。微生物在自然界中可谓“无处不在，无处不有”，涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、医药、工农业、环保等诸多领域。微生物对人类最重要的影响之一是导致传染病的流行。在人类疾病中有50％是由病毒引起。世界卫生组织公布资料显示：传染病的发病率和病死率在所有疾病中占据第一位。微生物导致人类疾病的历史，也就是人类与之不断斗争的历史。在疾病的预防和治疗方面，人类取得了长足的进展，但是新现和再现的微生物感染还是不断发生，像大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治疗药物。一些疾病的致病机制并不清楚。大量的广谱抗生素的滥用造成了强大的选择压力，使许多菌株发生变异，导致耐药性的产生，人类健康受到新的威胁。一些分节段的病毒之间可以通过重组或重配发生变异，最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大流行流感病毒都与前次导致感染的株型发生了变异，这种快速的变异给疫苗的设计和治疗造成了很大的障碍。而耐药性结核杆菌的出现使原本已近控制住的结核感染又在世界范围内猖獗起来。微生物能够致病，能够造成食品、布匹、皮革等发霉腐烂，但微生物也有有益的一面。最早是弗莱明从青霉菌抑制其它细菌的生长中发现了青霉素，这对医药界来讲是一个划时代的发现。后来大量的抗生素从放线菌等的代谢产物中筛选出来。抗生素的使用在第二次世界大战中挽救了无数人的生命。一些微生物被广泛应用于工业发酵，生产乙醇、食品及各种酶制剂等；一部分微生物能够降解塑料、处理废水废气等等，并且可再生资源的潜力极大，称为环保微生物；还有一些能在极端环境中生存的微生物，例如：高温、低温、高盐、高碱以及高辐射等普通生命体不能生存的环境，依然存在着一部分微生物等等。看上去，我们发现的微生物已经很多，但实际上由于培养方式等技术手段的限制，人类现今发现的微生物还只占自然界中存在的微生物的很少一部分。微生物间的相互作用机制也相当奥秘。例如健康人肠道中即有大量细菌存在，称正常菌群，其中包含的细菌种类高达上百种。在肠道环境中这些细菌相互依存，互惠共生。食物、有毒物质甚至药物的分解与吸收，菌群在这些过程中发挥的作用，以及细菌之间的相互作用机制还不明了。一旦菌群失调，就会引起腹泻。随着医学研究进入分子水平，人们对基因、遗传物质等专业术语也日渐熟悉。人们认识到，是遗传信息决定了生物体具有的生命特征，包括外部形态以及从事的生命活动等等，而生物体的基因组正是这些遗传信息的携带者。因此阐明生物体基因组携带的遗传信息，将大大有助于揭示生命的起源和奥秘。在分子水平上研究微生物病原体的变异规律、毒力和致病性，对于传统微生物学来说是一场革命。以人类基因组计划为代表的生物体基因组研究成为整个生命科学研究的前沿，

全基因组从头测序(de novo测序)

全基因组从头测序(de novo测序) https://www.360docs.net/doc/5917536858.html,/view/351686f19e3143323968936a.html 从头测序即de novo 测序，不需要任何参考序列资料即可对某个物种进行测序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、细菌、真菌的全基因组序列，从而推进该物种的研究。一个物种基因组序列图谱的完成，意味着这个物种学科和产业的新开端！这也将带动这个物种下游一系列研究的开展。全基因组序列图谱完成后，可以构建该物种的基因组数据库，为该物种的后基因组学研究搭建一个高效的平台；为后续的基因挖掘、功能验证提供DNA序列信息。华大科技利用新一代高通量测序技术，可以高效、低成本地完成所有物种的基因组序列图谱。包括研究内容、案例、技术流程、技术参数等，摘自深圳华大科技网站 https://www.360docs.net/doc/5917536858.html,/service-solutions/ngs/genomics/de-novo-sequencing/ 技术优势: 高通量测序：效率高，成本低；高深度测序：准确率高；全球领先的基因组组装软件：采用华大基因研究院自主研发的SOAPdenovo软件；经验丰富：华大科技已经成功完成上百个物种的全基因组从头测序。研究内容: 基因组组装■K-mer分析以及基因组大小估计；■基因组杂合模拟（出现杂合时使用）； ■初步组装；■GC-Depth分布分析；■测序深度分析。基因组注释■Repeat注释； ■基因预测；■基因功能注释；■ ncRNA 注释。动植物进化分析■基因家族鉴定（动物TreeFam；植物OrthoMCL）；■物种系统发育树构建； ■物种分歧时间估算（需要标定时间信息）；■基因组共线性分析； ■全基因组复制分析（动物WGAC；植物WGD）。微生物高级分析 ■基因组圈图；■共线性分析；■基因家族分析； ■CRISPR预测；■基因岛预测（毒力岛）； ■前噬菌体预测；■分泌蛋白预测。熊猫基因组图谱Nature. 2010.463:311-317. 案例描述大熊猫有21对染色体，基因组大小2.4 Gb，重复序列含量36%，基因2万多个。熊猫基因组图谱是世界上第一个完全采用新一代测序技术完成的基因组图谱，样品取自北京奥运会吉祥物大熊猫“晶晶”。部分研究成果测序分析结果表明，大熊猫不喜欢吃肉主要是因为T1R1基因失活，无法感觉到肉的鲜味。大熊猫基因组仍然具备很高的杂合率，从而推断具有较高的遗传多态性，不会濒于灭绝。研究人员全面掌握了大熊猫的基因资源，对其在分子水平上的保护具有重要意义。黄瓜基因组图谱黄三文, 李瑞强, 王俊等. Nature Genetics. 2009. 案例描述国际黄瓜基因组计划是由中国农业科学院蔬菜花卉研究所于2007年初发起并组织，并由深圳华大基因研究院承担基因组测序和组装等技术工作。部分研究成果黄瓜基因组是世界上第一个蔬菜作物的基因组图谱。该项目首次将传

微生物基因组研究进展及意义

微生物基因组研究进展及其意义近年来，病原微生物的基因组研究取得了飞速的进展。所谓基因组研究是指对微生物的全基因进行核苷酸测序，在了解全基因的结构基础上，研究各个基因单独或数个基因间相互作用的功能。由于过去人们大多从表型分析入手，寻找已知功能的编码基因，实际只了解微生物中极少数的基因，如链球菌的链激酶基因、结核杆菌编码的热休克蛋白基因等。还有大量未知基因未被发现。通过基因组研究，则从根本上揭示了微生物的全部基因，不仅可发现新的基因，还可发现新的基因间相互作用、新的调控因子等。这一研究将使人类从更高层次上掌握病原微生物的致病机制及其规律，从而得以发展新的诊断、预防及治疗微生物感染的制剂、疫苗及药品。此外，新发现的微生物酶及蛋白还可能有在工农业生产上的应用价值。因此，全球除已完成了70余株覆盖重要病毒科的病毒代表株全基因组研究外，据美国基因组研究所（The Institute for Genomic Research, TIGR）报道，目前已完成了19种微生物基因组测序，其中11种与人类及疾病相关（嗜血流感杆菌，生殖道支原体，肺炎支原体，幽门螺杆菌，枯草杆菌，伯氏疏螺旋体，结核杆菌，梅毒螺旋体，沙眼衣原体，普氏立克次体）。另外，还有40余种微生物已被登记正在进行测序，预计在1999～2000年完成〔1〕。病毒基因组研究进展病毒因其基因组小，是进行基因组研究最早的生物体。早在1977 年已完成了噬菌体DNA的全基因测序。存在于脊髓灰质炎疫苗中的SV40，是最早完成全基因测序的与疾病相关的病毒；此后，许多病毒均已完成了全基因测序，并根据序列的开放阅读框架（ORF）对编码蛋白进行了推导。已对相当一些病毒蛋白进行了重组表达，还对一些病毒基因编码的调控序列进行了研究。除一般大小的病毒已完成了基因组测序，对大基因组病毒，疱疹病毒科，如水痘病毒基因组为0.125Mb(Mega-basepair,兆碱基对)〔2〕。巨细胞病毒，基因组为0.229Mb〔3〕。我国已对痘苗病毒天坛株（约0.2Mb）进行了全基因测序，发现与国外的痘苗毒株序列有明显的差异〔4〕。我国还对甲、乙、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒进行了国内毒株的全基因测序。近来还对国内2株发现的虫媒病毒毒株完成了全基因测序。我国从不同来源的标本中发现了不少乙肝病毒变异株，有的具有特殊的生物学特性〔5〕。对病毒基因中调控因子的分析，发现了与乙肝病毒增强子作用的新细胞核因子〔6〕。因此，目前对病毒的基因组研究已进入了后基因组阶段，即从全基因水平研究病毒的生物学功能，同时发现新的基因功能。对于医学病毒学当前主要方向是研究病毒基因组中与致病及诱生免疫应答相关的基因，从而揭示和解决迄今尚未解决的问题，以达到控制或消灭一些重要病毒感染的目的。建议目前可进行后基因组研究的领域为： 1．病毒持续性感染：基因组中与持续性感染相关的基因，基因变异或调控因子研究。已报道的乙肝病毒的前核心基因出现终止密码突变，

DNA测序标准实验流程(V1.3版)

DNA测序标准实验流程（V1.2版）1．对DNA的要求纯度：OD 260 / OD 280 = 1.6 ~ 2.0， PCR产物用量：每反应15 -20ng（片段大于3KB可加两倍DNA）。质粒DNA用量：每反应20 -25ng（插入片段大于3KB质粒要加两倍DNA）。 1300载体本身序列就比较长，我们建议每反应加50-80ng。每个小组一次配100份BD MIX(BD 0.4ul,5*buffer 1.8ul,water 2.8ul)长期保存，每个反应体系加5ul 2．P CR产物的测序PCR反应（测序PCR反应中只要加一个引物就可以，需要加热盖）标准反应体系： 10ul体系试剂用量纯化的P CR产物(15-20 ng / μL) 1 μL （片段大于3KB可加两倍DNA）引物(2 pmol / μL) 1 μL BigDye (2.5 x) 0.4 μL BigDye Seq Buffer (5 x) 1.8μL 灭菌去离子水 5.8μL 96 °C 1 min → (96 °C 10 sec → 50 °C 5 sec → 60 °C 2 min) x 25个循环→ 4 °C保温质粒DNA的测序PCR反应标准反应体系： 10ul体系试剂用量质粒DNA (20-25 ng / μL) 1 μL （插入片段大于3KB质粒要加两倍DNA）引物(2 pmol / μL) 1 μL BigDye (2.5 x) 0.4 μL BigDye Seq Buffer (5 x) 1.8 μL 灭菌去离子水 5.8 μL 96 °C 1 min → (96 °C 10 sec → 50 °C 5 sec → 60 °C 2 min) x 25个循环→ 4 °C保温注意：BigDye (2.5 x)是一种含有DNA聚合酶和荧光物质的混合物，非常昂贵，平时都放在-20度保存。加之前拿出来放在冰上融化，用完马上放回-20冰箱。BigDye (2.5 x)和BigDye Seq Buffer (5 x)可以混合后一起加到反应体系，有多的话可以放在-20冰箱，下次还能使用。 BIGDYE尽量避光，一般用铝珀纸遮盖。P CR样品处理过程中如在室温放置和酒精挥发阶段都尽量用铝珀纸遮盖或者放入抽屉，有利于样品的稳定性。 3．测序产物纯化单个0.2 mL离心管离心方法： 1. 每孔加入1μL 7.5M NH3Ac，26μL 100%酒精，盖好，震荡4次。（酒精和NH3Ac先混合好，而且要比样品数多预算几个） 2. 台式离心机12000 x g 4°C离心20 min，马上用枪吸尽上清液。(DNA很微量，基本看不到，所以枪头不要碰到DNA沉积处) 3. 每孔加入100μL 75% 酒精，12000 x g 4°C离心10 min，马上用枪吸尽上清液。（如果不是马上操作，DNA沉淀很可能浮起，被吸走，所以如果没有及时吸去上清的话，要重新离心5MINS。） 4. 让酒精在室温避光（抽屉）挥发干净(至少20mins)，加入10 μL Hi-Di Formamide溶解DNA。 5. 在PCR仪上变性：95 °C 4 min，4 °C 4 min。上机测序。 96孔板整板离心方法： 1. 每孔加入1μL 7.5M NH3Ac，26μL 100%酒精，盖好，震荡4次。（酒精和NH3Ac先混合好，而且要比样品数多预算几个） 2. 板式离心机4000 x rpm 4°C离心30min；马上倒置96孔板，弃上清，倒置在洗水纸上，离心500rpm，1mins。 3. 加100μL 75% 酒精，4000 rpm 4°C离心20 min；马上倒置96孔板，弃上清，离心500rpm,1mins。 4.让酒精在室温避光（抽屉）挥发干净（至少15mins），加入10 μL Hi-Di For mamide溶解DNA。 5. 在PCR仪上变性：95 °C 4 min，4 °C 4 min。上机测序。 4. 部分相关试剂酒精：100%酒精使用国产分析纯；75%酒精用去离子水配制。 BigDye (2.5 x) -20度保存 BigDye Seq Buffer (5 x) 4度保存 7.5M NH3Ac 4度保存 Hi-Di For mamide -20度保存黄方亮 2009.10.27日整理

高通量测序生物信息学分析(内部极品资料,初学者必看)

基因组测序基础知识㈠De Novo测序也叫从头测序，是首次对一个物种的基因组进行测序，用生物信息学的分析方法对测序所得序列进行组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。目前国际上通用的基因组De Novo测序方法有三种： 1. 用Illumina Solexa GA IIx 测序仪直接测序； 2. 用Roche GS FLX Titanium直接完成全基因组测序； 3. 用ABI 3730 或Roche GS FLX Titanium测序，搭建骨架，再用Illumina Solexa GA IIx 进行深度测序，完成基因组拼接。采用De Novo测序有助于研究者了解未知物种的个体全基因组序列、鉴定新基因组中全部的结构和功能元件，并且将这些信息在基因组水平上进行集成和展示、可以预测新的功能基因及进行比较基因组学研究，为后续的相关研究奠定基础。实验流程：公司服务内容 1.基本服务：DNA样品检测；测序文库构建；高通量测序；数据基本分析（Base calling，去接头，去污染）；序列组装达到精细图标准 2.定制服务：基因组注释及功能注释；比较基因组及分子进化分析，数据库搭建；基因组信息展示平台搭建 1.基因组De Novo测序对DNA样品有什么要求？

(1) 对于细菌真菌，样品来源一定要单一菌落无污染，否则会严重影响测序结果的质量。基因组完整无降解(23 kb以上)， OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；每次样品制备需要10 μg样品，如果需要多次制备样品，则需要样品总量=制备样品次数*10 μg。 (2) 对于植物，样品来源要求是黑暗无菌条件下培养的黄化苗或组培样品，最好为纯合或单倍体。基因组完整无降解(23 kb以上)，OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；样品总量不小于500 μg，详细要求参见项目合同附件。 (3) 对于动物，样品来源应选用肌肉，血等脂肪含量少的部位，同一个体取样，最好为纯合。基因组完整无降解(23 kb以上)，OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；样品总量不小于500 μg，详细要求参见项目合同附件。 (4) 基因组De Novo组装完毕后需要构建BAC或Fosmid文库进行测序验证，用于BAC 或Fosmid文库构建的样品需要保证跟De Novo测序样本同一来源。 2. De Novo有几种测序方式目前3种测序技术 Roche 454，Solexa和ABI SOLID均有单端测序和双端测序两种方式。在基因组De Novo测序过程中，Roche 454的单端测序读长可以达到400 bp，经常用于基因组骨架的组装，而Solexa和ABI SOLID双端测序可以用于组装scaffolds和填补gap。下面以solexa 为例，对单端测序(Single-read)和双端测序(Paired-end和Mate-pair)进行介绍。Single-read、Paired-end和Mate-pair主要区别在测序文库的构建方法上。单端测序(Single-read)首先将DNA样本进行片段化处理形成200-500bp的片段，引物序列连接到DNA片段的一端，然后末端加上接头，将片段固定在flow cell上生成DNA簇，上机测序单端读取序列(图1)。 Paired-end方法是指在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点，在第一轮测序完成后，去除第一轮测序的模板链，用对读测序模块(Paired-End Module)引导互补链在原位置再生和扩增，以达到第二轮测序所用的模板量，进行第二轮互补链的合成测序(图2)。图1 Single-read文库构建方法图2 Paired-end文库构建方法

DNA测序结果分析比对(实例)

DNA测序结果分析比对（实例）关键词：dna测序结果2013-08-22 11:59来源：互联网点击次数：14423 从测序公司得到的一份DNA测序结果通常包含.seq格式的测序结果序列文本和.ab1格式的测序图两个文件，下面是一份测序结果的实例： CYP3A4-E1-1-1(E1B).ab1 CYP3A4-E1-1-1(E1B).seq .seq文件可以用系统自带的记事本程序打开，.ab1文件需要用专门的软件打开。软件名称：Chromas 软件Chromas下载 .seq文件打开后如下图： .ab1文件打开后如下图：通常一份测序结果图由红、黑、绿和蓝色测序峰组成，代表不同的碱基序列。测序图的两端（下图原图的后半段被剪切掉了）大约50个碱

基的测序图部分通常杂质的干扰较大，无法判读，这是正常现象。这也提醒我们在做引物设计时，要避免将所研究的位点离PCR序列的两端太近（通常要大于50个碱基距离），以免测序后难以分析比对。我的课题是研究基因多态性的，因此下面要介绍的内容也主要以判读测序图中的等位基因突变位点为主。实际上，要在一份测序图中找到真正确实的等位基因多态位点并不是一件容易的事情。一般认为等位基因位点假如在测序图上出现像套叠的两个峰，就是杂合子位点。实际比对后才知道，情况并非那么简单，下面测序图中标出的两个套峰均不是杂合子位点，如图并说明如下：

说明：第一组套峰，两峰的轴线并不在同一位置，左侧的T峰是干扰峰；第二组套峰，虽两峰轴线位置相同，但两峰的位置太靠近了，不是杂合子峰，蓝色的C峰是干扰峰通常的杂合子峰由一高一略低的两个轴线相同的峰组成，此处的序列被机器误判为“C”，实际的序列应为“A”，通常一个高大碱基峰的前面 1~2个位点很容易产生一个相同碱基的干扰峰，峰的高度大约是高大碱基峰的1/2，离得越近受干扰越大。一个摸索出来的规律是：主峰通常在干扰峰的右侧，干扰峰并不一定比主峰低。最关键的一点是一定要拿疑似为杂合子峰的测序图位点与测序结果的文本序列和基因库中的比对结果相比较；一个位点的多个样本相比较；你得出的该位点的突变率与权威文献或数据库中的突变率相比较。通常，对于一个疑似突变位点来说，即使是国际上权威组织大样本的测序结果中都没有报道的话，那么单纯通过测序结果就判定它是突变点，是并不严谨的，因一份 PCR产物中各个碱基的实际含量并不相同，很难避免不产生误差的。对于一个未知突变位点的发现，通常还需要用到更精确的酶切技术。 (责任编辑：大汉昆仑王)

人类全基因组测序

1 技术优势全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）是利用高通量测序平台对人类不同个体或群体进行全基因组测序，并在个体或群体水平上进行生物信息分析。可全面挖掘DNA 水平的遗传变异，为筛选疾病的致病及易感基因，研究发病及遗传机制提供重要信息。全基因组测序平台优势 HiSeq X 测序平台读长：PE150 通量：1.8T/run 测序周期：3 天专为人全基因组测序准备、测序周期短、通量高

生物信息分析技术路线技术参数样品要求样本类型：DNA 样品样本总量：≥1.0 μg DNA (提取自新鲜及冻存样本) ≥1.5 μg DNA (提取自FFPE 样本)样品浓度：≥ 20 ng/μl 测序平台及策略HiSeq X PE150 测序深度肿瘤：癌组织(50X),癌旁组织/血液样本(30X)遗传病：30~50 X 项目周期37天

3 案例解析该研究选取3个家系中6个患者和1个正常个体，首先使用基因芯片寻找纯合突变位点，然后对其中无亲缘关系的2例患者采用全基因组测序研究，在2例患者非编码区域均发现相同的变异，10号染色体PTF1A 末端发生一个点突变（chr10：23508437 A>G），且变异在患病人群和细胞试验中均得到了验证。研究解释了生长发育启动子隐性变异是罕见孟德尔遗传病的常见致病原因，同时说明许多疾病的致病突变也可能位于非编码区。图1 检出的变异信息智力障碍是影响新生儿心智发育的一类疾病。这项研究选取50个经过基因芯片和全外显子测序未确诊致病因子的trio 家系，全基因组测序检出84个de novo SNVs 和8个de novo CNVs，及一些结构变异（如VPS13B、STAG1、IQSEC2-TENM3），检出率为42%。揭示编码区的de novo SNVs 和de novo CNVs 是导致智力障碍的主要因素，全基因组测序可以作为可靠的遗传性检测应用工具。案例一单基因病研究——全基因组测序鉴定PTF1A末端增强子常染色体隐性突变导致胰腺发育不全[1] 案例二复杂疾病研究——全基因组测序解析智力障碍的主要致病因素[2] 图2 PTF1A 的家系图谱

基因组重测序分析流程-代码文件

差异位点分析流程步骤分解数据准备： mkdir 1.QC cd 1.QC ln -s /root/mdna-data/reseq/1.QC/*.fastq . Ls cd .. mkdir 2.mapping cd 2.mapping ln -s /root/mdna-data/reseq/2.mapping/ref.fasta . 步骤1：参考基因建索引 cd 2.mapping ##bwa建索引： bwa index ref.fasta Expected Result：得到一系列BWA 进行alignment 需要的文件。 ##samtools建索引： samtools faidx ref.fasta Expected Result：生成refgene.fasta.fai。每行都是fasta 文件中每条contig 的record，每条record 由contig name, size, location, basesPerLine 和bytesPerLine 组成。 ##生成字典： java -jar /root/mdna_software/picard-tools-1.102/CreateSequenceDictionary.jar R=ref.fasta O=ref.dict Expected Result：生成refgene.dict。描述fasta 文件内容，类似SAM header 格式。步骤2：bwa比对 ##用bwa作比对： nohup bwa aln -e 3 -i 10 -t 1 -R 100 -q 20 ref.fasta ../1.QC/test_trim1.fastq -f 1.sai & nohup bwa aln -e 3 -i 10 -t 1 -R 100 -q 20 ref.fasta ../1.QC/test_trim2.fastq -f 2.sai & nohup bwa aln -e 3 -i 10 -t 1 -R 100 -q 20 ref.fasta ../1.QC/test_trim_unpaired.fastq -f s.sai & jobs

基因组DNA测序文库构建

基因组DNA测序文库构建 1.对收到的DNA样品进行检测，取2-3ul样品，用1%的琼脂糖胶检测，对于纯度不够（含 RNA或蛋白）的DNA样品需要柱纯化后重新检测。对于细菌基因组需要扩增16S全长序列，进行验证。对于噬菌体或者质粒样品，若用16S全长引物扩增，无目的条带则无细菌基因组污染，若出现目的条带则存在污染，需要去除后建库。 2.用Qubit检测DNA样品浓度。 3.吸取部分DNA样品，用TE或Elution Buffer稀释，终浓度在10ng/ul-30ng/ul之间，体积为130ul。用Covaris破碎，破碎时请根据需要片段大小，按标准操作流程操作。 4.样品足够多的情况下，可以取适量破碎后的产物进行PAGE胶或者琼脂糖胶检测。 5.对破碎后的产物进行柱式法（5倍体积的B3+100-200ul异丙醇）浓缩回收，加入50-100ul TE或Elution Buffer洗脱。回收产物用Qubit测值。 6.修平和磷酸化 100ul体系

DNA 1ug 5 X T4 polymerase buffer 20ul BSA (5mg/ml) 2ul ATP (100mm) 1ul dNTP（10mm）10ul T4 DNA Polymerase (5U/ul) 1ul Klenow（10U/ul）1ul T4 PNK (10U/ ul) 1.5ul 22°C反应20min，柱式法纯化,50-100ul TE洗脱。纯化后Qubit测值。 7.加‘A’ 100ul体系 DNA 0.5-2.5ug 10 X klenow buffer 10ul dATP(10mm) 1-3ul Klenow(exon-)（5U/ul）1-3ul 37°反应20min，柱式法纯化，50-100ul TE洗脱。纯化后Qubit测值。 8.连接头 200ul体系 10 X T4 DNA ligase buffer 20ul PEG4000 30ul ATP(100mm) 2ul DNA X 接头 Y T4 DNA ligase 1.5-2ul 加水至 200ul DNA与接头的摩尔比约在1:3至1:10之间。 9.连接产物用柱式法纯化后，跑琼脂糖胶切割目的区域回收。 10.PCR扩增 10 X TagE buffer 5ul Mg2+ 4ul dNTP(10mm) 1ul lib-PCR-F 0.5ul

第四章基因组测序及分析

第四章基因组测序及分析人类基因组和其它一些生物基因组的大规模测序将成为科学史上的一个里程碑。基因组测序带动了一大批相关学科和技术的发展，一批新兴学科脱颖而出，生物信息学、基因组学、蛋白质组学等便是一批最前沿的新兴学科。可以说，基因组测序及其序列分析使整个生命科学界的真正认识了生物信息学，生物信息学也真正成为了一门受到广泛重视的独立学科。基因组测序及其分析实际是人类的又一场“淘金”和“探险”运动。哥伦布等一大批探险家在几百年前发现了美洲、澳洲等一大批新大陆，最终使人类认识了地球上的每一块处女地。于是有人形象地把人类目前的基因组研究形象地比喻为“地球探险”，并把基因组研究称为基因组地理（genomic geography）。我们不妨想象一下，人类基因组的各条染色体就如同人类基因“地球”上的7大洲，寻找新基因和搞清楚基因组结构与功能的过程恰如开垦地球上的每一块处女地，而这些处女地上可能蕴藏着无穷的宝藏。目前人类全基因组序列已基本测定完成，另有一大批生物也已完成基因组测定或正在进行。世界上无数大型测序仪（最好的测序仪一次可以阅读1000多个碱基）日夜不停地运转，每日获得的序列数据以百万和千万计。同时，来自政府和企业的大量投资，使整个世界的测序能力与日俱增。面对基因组的天文数据，分析方法举足轻重，大量新的分析方法被提出和改进，大量重要基因被发现；大量来自基因组水平上的分析比较结果被公布，这些结果正在改变人类已有的一些观念。第一节 DNA测序及序列片段的拼接一．DNA测序的一般方法1 1．DNA测序的基本原理 DNA序列测定的工作基础是在变性聚丙烯酰胺凝胶(测序胶)上进行的高分离度的电泳过程。这些所谓的测序胶能在长达500bp的单链寡核苷酸中分辨出一个脱氧核苷酸的差异。操作时，在相应的待测DNA区段产生一套标记的寡核苷酸单链，它们有固定的起点，但另一端是按模板序列连续终止于各不相同的核苷酸。确定每个脱氧核糖核苷酸的序列的关键，是在4个独立的酶学或化学反应中产生终止于所有不同的A、T、G、C位点的寡核苷酸链，而这4个反应的寡核苷酸产物在测序胶的相邻泳道中都能被一一分辨出来。由于在4个泳道中再现了所有的可能寡核苷酸链，DNA的序列能从图4.1所示的4个寡核苷酸“阶梯”中依次直接读出。实际上，从一套测序反应中所能获得的信息量受限于测序胶的分离度。虽然最新的测序技术经常可从一套测序反应中测到高达500核苷酸的信息，但获得的可靠序列信息大约在300个核苷酸。因此，如果待测DNA的区段在300核苷酸以 1本部分内容主要取自F．奥斯伯，R．E．金斯顿等．精编分子生物学实验指南，北京：科学出版社，1998

二代测序流程

Illumina测序的化学原理目前我们接触到的很多生物信息学的技术，都是基于NGS技术的，比如RNA-Seq，ChIP-Seq，FAIRE-Seq，ChIA-PET，Hi-C等等。所谓的NGS就是Next Generation Sequencing，翻译为“下一代测序技术”，或者是“第二代测序技术”。之所以这么叫，是因为相比较于第一代测序技术其测序通量有了很大的提升一些常用的基本概念介绍： flowcell：是指Illumina测序时，测序反应发生的位置，1个flowcell含有8条lane lane：每一个flowcell上都有8条泳道，用于测序反应，可以添加试剂，洗脱等等tail：每一次测序荧光扫描的最小单位 reads：指测序的结果，1条序列一般称为1条reads bp：base pair 碱基对，用于衡量序列长度双端测序：是指一条序列可能比较长，如500bp，我们可以两端各测150bp junction：在进行双端测序时，中间会留有200bp测不到的东西，我们称其为junction adapter：就是在测序时需要的一段特定的序列，有类似于引物的功能 primer：PCR中的引物测序反应基本流程介绍： 1、建库 A、将基因组DNA用超声波打断（由于Illumina测序策略本身的问题，导致其测序长度不可能太长，目前最好的X Ten测序仪也就只能双端各测150bp，所以不可能直接拿整个基因组去测序，因此在测序的时候就需要先将其打断成一定长度的片段，这个根据需要使用不同的策略，一般测人的基因组，我们是先将其打断成300-500bp长度的片段，这个是根据跑胶控制的） B、打断以后会出现末端不平整的情况，用酶补平，所以现在的序列是平末端 C、完成补平以后，在3'端使用酶加上一个特异的碱基A D、加上A之后就可以利用互补配对的原则，添加adapter，这个adpater可以分成两个部分，一部分是测序的时候需要使用的引物序列，另一部分是建库扩增时候需要用到的引物序列 E、进行PCR扩增，使得DNA样品浓度能够满足上机要求建库示意图如下：

一代测序规范操作规范

P C R产物测序实验操作流程一、实验试剂和耗材准备（一）实验试剂（二）、实验耗材

二、实验仪器三、实验操作具体步骤（一）核酸的提取按照DNA或RNA提取试剂盒操作（具体操作步骤参考试剂盒操作说明书），如是RNA需进一步反转录为cDNA。-20℃保存备用。（二）测序PCR模板的制备（1）、预先制备适量冰（2）、在冰上融化模板DNA、引物以及Extender PCR-to-Gel Master Mix （3）、按照以下反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上（4）将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序 95℃5min→

（95℃ 30sec，67℃ 30sec -0.5 ℃/循环，72℃ 1min）x14循环→ （95℃ 30sec，57℃ 30sec，72℃ 1min）x 30循环→ 72℃ 7min→4℃ Forever （5）琼脂糖凝胶电泳检测:量取适量1×TBE缓冲液并称取一定量琼脂粉溶于其中制成1%-2%的琼脂糖凝胶，在微波炉上加热溶化，待温度降至60℃-70℃左右加入荧光染料，温度降至40℃-50℃左右将琼脂粉溶液倒入插有梳子的凝胶槽中冷却，待凝胶完全凝固备用。将凝胶置于水平电泳槽中，取少量PCR产物上样电泳，将电泳好的样品置于凝胶成像系统中进行检测和分析。（6）将检测合格的PCR产物用酶解法进行纯化。根据核酸外切酶I (Exo I)，碱性磷酸酶(AIP)的作用浓度，加入到PCR反应产物中，37℃消化15min，85℃使酶失活15min。纯化体系如下：（三）、纯化后的PCR产物的测序反应 1、纯化后的PCR产物按照1:3~1:6稀释（若琼脂糖凝胶电泳条带非常亮，可以适当增大稀释倍数） 2、测序反应用引物稀释到1μM （1）PCR产物测序反应体系（10μl）： PCR产物测序体系中PCR产物的加入量如下表： DNA纯度：OD260/OD280=1.6~1.8；DNA含量（ng/μl）=OD260×50

07年完成基因组测序的生物

07年完成基因组测序的生物生物通报道：在即将过去的2007年，动物、植物、微生物的基因组测序工作进行的如火如荼，多项基因组测序结果被公布，包括第一个个人基因组图谱、马基因组图谱、肺癌基因组图谱和多种致病性细菌的基因组测序结果。人类基因组测序的进一步深入世界首份个人DNA图谱出炉 57年前，美国生物学家詹姆斯·沃森与弗朗西斯·克里克共同发现了脱氧核糖核酸(DNA)分子结构的双螺旋模型，并因这项基因研究领域的重大突破获得诺贝尔奖。今天，沃森成为自己研究的受益者--他将成为世界第一份完全破译的“个人版”基因组图谱的拥有者。第一个个体基因组序列公布来自美国克莱格凡特研究所（J. Craig Venter Institute，由TIGR所建立），加拿大多伦多大学，加州大学圣地亚哥分校，西班牙巴塞罗那大学（Universitat de Barcelona）的研究人员近期公布了单个个体二倍体基因组序列，为未来的基因组比较打开了一道门，也开创了个体基因组信息的新纪元。杜克大学公布第一张人类基因组印记基因图谱

来自杜克大学的研究人员创造了第一张人类基因组印记基因（imprinted genes）图谱，并且他们表示其成功的关键在于一个称为机器学习（machine learning）的人工智能形式：modern-day Rosetta stone。这项研究新发现了四倍于之前识别的印记基因，并即将公布在12月3日《Genome Research》封面上。完成测序的动物第一张马基因组图谱草图公布国际马类基因组序列计划（the international Horse Genome Sequencing Project）宣布，科学家们首次完成家马（(Equus caballus)）的基因图谱草图，得到了270万个DNA碱基对的数据，全部数据已经进入公共数据库，可免费供全世界的生物学家和兽医学家使用。《自然》封面：首个有袋动物基因组序列公布一种灰色短尾负鼠（Monodelphis domestica）的基因组测序的完成则为这一推测给出了切实的证据。负鼠是第一个完成基因组测序的有袋动物，测序结果公布在4月10日的《自然》杂志上，而且这种小动物还登上了该期杂志的封面。家猫基因组测序完成

微生物宏基因组测序

宏基因组学（Metagenomics），又称元基因组学，以特定生境中的整个微生物群落作为研究对象，采用新一代高通量测序技术，获得环境微生物基因信息总和，研究环境微生物的群落结构、物种分类、系统进化、基因功能及代谢网络等。宏基因组测序摆脱了传统研究中微生物分离培养的技术限制，直接提取环境样本DNA进行测序，具有通量高、速度快、信息全等特点，在鉴定低丰度的微生物群落、挖掘更多基因资源方面具有很大优势，基于测序技术和生物信息学的快速发展，宏基因组技术优势在微生物研究领域中愈发明显，应用范围愈发广泛。技术参数参考文献 [1] B?ckhed F, Roswall J, Peng Y, et al . Dynamics and Stabilization of the Human Gut Microbiome during the First Year of Life [J]. Cell host & microbe, 2015, 17(5): 690-703. [2] Sunagawa S, Coelho L P , Chaffron S, et al . Structure and function of the global ocean microbiome [J]. Science, 2015, 348(6237): 1261359. 案例解析［案例一］婴儿肠道微生物宏基因组[1] 肠道微生物对人体至关重要，本文采用宏基因组测序技术对98个瑞典产妇的粪便及婴儿的粪便进行分析，研究出生一年内肠道的微生物，评估分娩方式和喂养方式对肠道菌群建立的影响。与顺产婴儿的肠道微生物相比，剖腹产婴儿肠道微生物与母亲相似性明显降低。营养对肠道微生态的组成和功能有重要影响，促使婴儿肠道微生物向成人肠道微生物群转变的主要驱动力量并不是开始喂食固体食物，而是停止母乳喂养。微生物群落组成和生态网络在不同样本阶段具有明显差异，与微生物功能成熟度相关。［案例二］全球海洋微生物群体的结构与功能[2] 微生物是生物地球化学进程的主要推动力，但对它们的功能多样性、微生物种群结构以及生态因素进行总体分析还存在很大的挑战。本研究采集全球海洋68个位点的上层和中层海水的243个样本进行宏基因组分析，得到7.2TB数据。对获得的数据进行分析，发现139个样本中含有的微生物物种数目多于35,000个，而且在上层海水的垂直分层中，温度是影响微生物种群分布的主要因素。分析海洋微生物核心功能，发现其与人体肠道微生物的相似性高达73%。图1 不同生产方式及不同年龄阶段肠道菌群的差异图2 Tara Oceans在全球海洋微生物中发现的新基因多样性多样本标准分析PCA分析Heatmap Cluster Krona物种注释展示差异显著性分析OG－物种归属分析代谢通路分析样品要求文库类型测序策略数据量类型分析内容项目周期宏基因组测序 35～75个自然日 HiSeq PE150 5 Gb/10 Gb Raw data 300 bp小片段文库常见环境样本（请使用干冰或冰袋运送）土壤、淤泥、沉积物≥5 g 粪便≥2 g 组织样本≥1 g 水体送样为过滤后的滤膜（最适滤膜直径3-4cm）拭子样本≥2个 DNA样本（请使用干冰或冰袋运送）DNA：浓度≥50 ng/μl 总量≥2 ng OD260/280：1.8~2.0，无 RNA、蛋白质等杂质污染多样本高级分析MRPP分析NMDS分析Anosim分析LEfSe分析 CCA／RDA分析 O c c u r r e n c e f r e q u e n c y （n ＝15） 1