(附录61)USP37-中文翻译

非无菌产品的微生物检测：微生物计数试验

简介

此项试验将涉及需氧条件下的中温菌和真菌的定量计数。

此项试验的设计主要决定一种物质或准备物品是否与已建立的微生物质量标准相符合。当用于此项目的时，遵循以下指导，包括需检验样品的数量，并按照以下要求报告结果。

此种方法不适用于以活微生物做为活性成分的产品。

如果方法与药典的同等有效性已被论述，可采用其他方法，包括自行设计的方法。

通则

应在免受外来微生物污染的条件下检测样品。所采取的的预防污染的措施不应影响产品中将被检出的微生物。

如果被检样品有抗菌活性，应尽量移除或中和。应当阐述使用于此目的的抑制剂的对于微生物的效力和无毒性。

当进行样品准备使用表面活性物质时，其对微生物的无毒性以及与使用的抗菌剂的兼容性应当被阐述。

计数方法

按照指导，使用薄膜过滤法或者平板计数法。对于微生物计数来说，最大可能数值方法通常是最不准确的方法；但是，对于低微生物负载量的产品来说，它或许是最适当的方法。

选择方法时，一般考虑以下因素：产品的性质以及要求的微生物限度。所选方法必须有充分的样品检测来判断是否与标准相符。所选方法的适用性应当被阐述。

促生长性试验，计数方法的适用性以及阴性对照

通论

应当建立检测被检样品中微生物检验方法的有效性。

如果影响样品检测结果的变化时，如检验操作或者产品发生变化，适用性必须被确认。

实验菌株的制备

使用试验菌株的标准稳定菌悬液或按照以下描述制备。使用种子批培养维护技术（种子批系统），以使接种所使用的微生物从原始主种子批计算不会超过五代。按照表1描述，分别培养细菌和真菌试验菌株。

使用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液或者pH7.2磷酸缓冲液制备菌悬液；制备黑曲霉菌悬液时，缓冲液中可能需要添加0.05%的聚山梨酯80（吐温80）。2小时或者2℃-8℃下24时使用该菌悬液。作为用于制备、稀释黑曲霉菌和枯草芽孢杆菌的新鲜菌悬液备用选项，应当制备稳定的以及用于试验的适量的孢子悬液。该孢子悬液应当在经验证的时间周期，2℃-8℃下保存备用。

阴性对照

为了验证检验条件，应当使用稀释液代替样品制备阴性对照。应无微生物生长。按照“样品检测”项下检验样品时，也应当做阴性对照。阴性对照失败应当进行调查。

培养基的促生长性试验

测试每批已制备好的培养基以及采用脱水培养基制备或按指定的成分制备的培养基。

按照表1 指示，分别接种少量(不超过100cfu)至部分或一碟大豆酪蛋白肉汤培养基和大豆酪蛋白琼脂培养基中。按照表1指示，分别接种少量（不超过100cfu)至SDA培养基中。按照表1培养条件进行培养。

对于固体培养基，得到的生长值与标准接种量的计算值的差异应不大于2个因数值。

对于新鲜配制的培养液，微生物生长量应当与上一批经试验且合格的培养基相比较。对于液体培养基，如果与上一批经试验且合格的培养基相比较有明显的微生物生长，那么该批培养基是适用的。

产品计数方法的适用性

样品的制备

样品的制备方法取决于被检测样品的物理性质。如果以下论述不适用，可采用其他适用的方法。

水溶性产品-用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、pH7.2磷酸盐缓冲液或者大豆酪蛋白肉汤培养液溶解或稀释（通常配制成比例为1:10的稀释液）样品。如果有必要的话，将pH 调至6.0-8.0.如需进一步稀释，应使用同样的稀释液。

不溶于水的非油脂类：用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、pH7.2磷酸盐缓冲液或者大豆酪蛋白肉汤培养液（通常配制成比例为1:10的稀释液）配制成样品悬浮液。为加强不易与水混合物质的悬浮，可能需要添加表面活性剂如1g/L的吐温80.如果有必要的话，将pH 调至6.0-8.0.如需进一步稀释，应使用同样的稀释液。

油脂类：使用经过滤无菌的肉豆蔻酸异丙酯溶解，或将最少需要量的无菌吐温80与被检样品混合，或者其他非抑制类无菌的加热至不超过40℃的表面活性剂，特殊情况下，不超过45℃。仔细混合，如有需要的话，使用水浴锅来保持恒温。添加足量的预热的稀释液将样品配制成比例为1：10的待测液。小心混合，并且使温度在一个能使乳状液形成的最短时间内保持稳定。如需进一步的十倍稀释，稀释液中可能包含适当浓度的无菌吐温80或者其他非抑制类的无菌表面活性剂。

气溶胶状态的液体或固体：无菌条件下，将样品转移至薄膜过滤器或者无菌容器以供进一步的取样。使用被检容器中的全部或者一定量的样品。

皮肤药贴：揭开皮肤药贴的保护层（离型膜），黏贴层朝上，将其黏贴于无菌玻璃或者塑料盘上。用无菌多孔介质的材料（如无菌纱布）覆盖黏贴层，防止药贴黏贴在一起，将药贴转移至含有抑制剂吐温80或者卵磷脂的适量的稀释剂中。剧烈震荡配制液至少30分钟。

接种和稀释

将不少于100cfu的菌悬液接种至以上配制好的样品和对照（不含试验材料）中。接种的菌悬液量应不超过被稀释样品量的1%。

为了论述产品的合理的微生物回收率，试验时需采用被检测样品的最低稀释因子。当由于产品的抗菌活性或者难溶解性而无法获得时，必须采用进一步的适当的方案。如果无法避免样品的抑制性，在中和、稀释或者过滤后可能需要添加微生物悬液的等分试样。

中和/抗菌活性的去除

将按照“接种和稀释”项下进行稀释，按照“产品的微生物回收率”项下进行培养的样品的回收率，与对照组的微生物回收率进行比较。

如果生长被抑制（折减因子大于2），修改该项计数试验的方法来确保结果的有效性。方法的修改可包括，例如：

（1）增加稀释剂量或者培养基量；

（2）稀释剂中添加特殊的或者普通的联合中和剂；

（3）薄膜过滤；

（4）以上措施的结合。

中和剂：可使用中和剂来中和抗菌物质的活性（见表2）。在灭菌前，所选择的稀释剂中或者培养基中可添加中和剂。如果使用的话，必须采用空白对照（无产品，只有中和剂）的方法来阐述中和剂的效力及其对微生物的无毒性。

表2 干扰物质的常见中和剂/方法

干扰物质可能的中和剂/方法

戊二醛、汞亚硫酸氢钠

酚醛、乙醇、醛、山梨酸酯稀释

醛类氨基乙酸

季铵化合物、对羟基苯甲酸、双胍卵磷脂

季铵化合物、碘、苯甲酸酯聚山梨酯

汞巯基乙酸盐

汞、卤素、醛硫代硫酸盐

EDTA Mg2+ 、Ca2+

如果没有合适的中和方法，可以假定产品的抑菌活性是由于接种的微生物的难分离性引起的。此项信息说明产品不可能被已知的微生物种类所污染。然而，产品有可能只抑制在此指定的某些微生物种类，但并不抑制试验菌株中未包含的或者不具代表性的菌株。可采用与微生物生长相兼容的稀释因子以及可接受的标准来进行试验。

产品中微生物回收率

应当采用独立试验来测试所列举菌株。只对添加菌株进行微生物计数。

薄膜过滤法：采用孔径不大于0.45μm的薄膜过滤器。过滤材料是依据细菌的滞留效率不被所检测样品的成分所影响的方式进行选择的。每个薄膜过滤器只可过滤所列举的一种微生物。

将按照项目“样品的制备”“接种和稀释”以及“中和/抗菌活性物质的去除”（1g 产品较适宜，或者更少，如果需要较少的cfu）配制的适量样品转移至薄膜过滤器，立即过滤，使用适量稀释剂冲洗滤膜。

对于TAMC的计数，将滤膜转移至大豆酪蛋白琼脂培养基上进行培养。对于TYMC的计数，将滤膜转移至SDA培养基上进行培养。

平板计数法：采用平板计数法时，每个培养基应至少有两个平行样，结果采信平均值。

倾注平皿法：向直径为90mm的平皿添加按照项目“样品的制备”“接种和稀释”以及“中和/抗菌活性物质的去除”制备的1ml样品和15至20ml的大豆酪蛋白琼脂培养基和SDA培养基，两个培养基均应在不高于45℃环境下保存。如果使用较大培养基，则琼脂培养基量相应增加。表1中所列举的微生物种类，应至少做两个平行样。

按照表1指示进行培养，每个培养基均取算数平均值，计算原始接种量的cfu值。

表面平铺法：对于直径为90mm的平皿，逐个向其中添加温度在45℃左右15至20ml 的大豆酪蛋白琼脂培养基和SDA培养基，并使其凝固。如果使用较大培养基，则琼脂培养基量相应增加。晾干培养基，如使用层流柜或者培养箱。表1中所列举的微生物种类，应至少做两个平行样。将按照项目“样品的制备”“接种和稀释”以及“中和/抗菌活性物质的去除”制备的定量的不少于0.1ml的样品平铺至培养基表面。按照“平板倾注法”进行培养和计数。

最大可能值法：最大可能值得准确性和精确性比薄膜过滤法和平板计数法低。尤其对于霉菌的计数，结果并不可靠。鉴于此，当其他方法不适用时，进行TAMC计数时，采用MPN方法。如果采用此方法，则按下述继续进行操作。

按照“样品的制备”“接种和稀释”以及“中和/抗菌活性物质的去除”项配制一系列至少3个连续10倍稀释的样品。从每一级别稀释中吸取1g或1ml接种至内含9至10ml 的大豆酪蛋白琼脂培养基中。如有需要，