HRP标记方法

标记比例：（抗体:HRP标记质量比位1：1；抗原:HRP质量比为1：4左右）；

根据标记比例计算所需HRP量X。

一、蛋白透析

1、目标蛋白透析到CB(pH9.6，50mM)中，换液2次以上；

二、酶的氧化

2、称取X mg HRP干粉(Biozyme or Sigma)溶于X/20 mL ddH2O 中。

3、称取NaIO4 y mg( y>X)，溶于y/20 mL的ddH2O中，吸取X/20 mLNaIO4溶液与X/20 mL 的

HRP溶液缓慢混合，4℃下静置30min。（此时溶液为绿色）注意：此后的操作均在避光条件下进行。

4、吸取XμL乙二醇（体积太小，难以控制，所以请应事先用水稀释至50μL进行）缓慢加

入氧化后的HRP溶液，室温避光静置30min。（此时溶液为褐色）

三、标记

5、将氧化好的HRP直接加入到已透析充分的抗原/抗体蛋白

6、继续透析到CB(pH9.6，50mM)中，换液2次以上；

7、加入X/5mg NaBH4到其中（需新鲜配置，先溶于10XμL的ddH2O 中），4℃静置2hr

（不能再透析），每30min摇动1 次。

8、PBS(10mM，pH7.2)透析过夜，标记液中加入体积比50%的甘油，混匀后置于-20℃保存。