CRISPR简述
CRISPR简述
1、CRISPR 研究历史
1987 年，日本课题组Ishino Y等在K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后的研究发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002 年，Jansen等将其将其正式命名为clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)．2007 年，Barrangou 等首次发现并证明细菌可能利用CRSPR 系统对抵抗噬菌体入侵．2008 年，Marraffini 等又发现细菌CRISPR 系统能阻止外源质粒的转移。2013 年初，CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术出现。
2、CRISPR的分布与分类
已测序的接近90%的古细菌和40%的细菌的基因组或是质粒中至少存在一个CRISPR 基因座。
根据Cas 基因核心元件序列的不同, CRISPR/Cas 免疫系统被分为3 种类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas 免疫系统需要多个Cas 蛋白形成复合体切割DNA 双链, 而Ⅱ型CRISPR/Cas 免疫系统只需要一个Cas9 蛋白来切割DNA 双链,目前Ⅱ型系统是被改造的最为成功的人工核酸酶。
3、CRISPR 位点结构
CRISPR系统通常包括: 由不连续的重复序列(repeats,R) 与长度相似的间区序列( spacers,S) 间隔排列而成的CRISPR 簇，前导序列( Leader,L) 以及一系列CRISPR 相关蛋白基因(cas) 。前导区一般
是处于CRISPR位点上游由300bp~500bp 碱基组成的一个AT 富集的区域。这个区域一般来说在种内是比较保守的但在种间却有显著的差异。重复序列一般由23bp-50bp的碱基组成, 其平均长度在31bp左右。间区由17bp-84bp 碱基组成平均长度在36bp左右。
4、CRISPR/Cas 作用机制
对于CRISPR/Cas 的作用机理可以分为三个阶段来理解，第一是CRISPR 的高度可变的间隔区的获得，第二是CRIPSR 基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工)，第三是CRISPR/Cas 系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰。
新间隔序列的获得可能分为三步：首先识别入侵的核酸和扫描外源DNA 潜在的PAM(protospacer adjacent motifs)，将临近PAM 的序列作为候选protospacer（噬菌体或是质粒上与间隔序列对应的序列）；然后在CRISPR 基因座的5' 端合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间。
多个研究表明CRISPR 基因座首先被转录成前体CRISPR
RNA(pre-crRNA)，然后在Cas 蛋白或是核酸内切酶的作用下被剪切成一些小的RNA 单元，这些小RNA 即为成熟crRNA，由一个间隔序列和部分重复序列组成[43-48]．Type域型CRISPR/Cas系统crRNA 的
成熟除了需要Cas9 和RNase芋参与以外，还需要tracrRNA 的指导[36]．CRISPR 基因座在没有受到外界压力的情况下表达水平很低[44, 49]．当外源的质粒或是噬菌体入侵宿主菌时CRISPR 的表达很快被诱导上调.
干扰是CRISPR/Cas 发挥抵御外源遗传物质入侵最关键的步骤，成熟的crRNA 与特异的Cas 蛋白形成核糖核蛋白复合物，再与外源DNA 结合并扫描到外源DNA，寻找其上的靶序列，crRNA 的间隔序列与靶序列互补配对，外源DNA 在配对的特定位置被核糖核蛋白复合物切割．
1.4 ZFNs、TALENs 和CRISPR/Cas 系统的比较
ZFNs 和TALENs 这两项技术在具体的实施操作过程中技术难度较大、构建组装时间较长,成本高，一般实验室很难得到有效利用。CRISPR/Cas系统制作简单、成本低、作用高效，能同时作用于多个靶位点。
CRISPR操作系统(原理)
近日，Cell发表了一篇名为“SnapShot: CRISPR-RNA-Guided Adaptive Immune Systems”的精华文章，用一张图，就全解析了CRISPR系统的“中心法则”。今天就让麦子带大家分解此图，真正掌握时下这个可以对人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物等细胞内的基因进行精确编辑的热门技术之精髓： 细菌和古细菌已经根据CRISPR（规律成簇的间隔短回文重复，Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）位点和多样化CRISPR 相关（CRISPR-associated，Cas）基因，进化出了复杂的CRISPR适应性免疫系统。CRISPR系统可以分为三种类型（I-III）及至少11种不同的亚型（I-A~I-F，II-A~II-C，III-A~III-B）。但是所有的CRISPR-Cas 免疫系统都是通过主要的三个阶段来行使功能： ?外来DNA的采集 ?CRISPR RNA的生物合成 ?靶向干扰 第一阶段：外来DNA的采集（Foreign DNA Acquisition）
宿主通过Cas蛋白来识别外源核苷酸，入侵细菌的短片段DNA称为protospacers，它们作为间隔区序列插入到了宿主的CRISPR位点。在I和II型系统中，protospacers选择自入侵DNA旁出现PAM的区域（PAM：protospacer adjacent motif，对于CRISPR结合至关重要）。一般protospacers通过包含Cas1、Cas2和游离3'-羟基等元件的机制连接在CRISPR位点的前导区(Leader)。Protospacer的整合也伴随着末端重新序列复制，这可能涉及宿主聚合酶和DNA 修复机制。 第二阶段：CRISPR RNA的生物合成（crRNA Biogenesis）
CRISPR cas9基因敲除原理及其应用
CRISPR/Cas9基因敲除原理及其应用 CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件[1]。 目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。 由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统[1]。 通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作[2,3]。
目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下：Cas9质粒构建 设计2条单链oligo序列； 退火形成双链DNA pGK1.1 将双链DNA连接到载体 中 转化G10competent cell 筛选阳性克隆；测序验证 序列；质粒大提；电转染 靶细胞 在细胞内crRNA识别靶 位点，Cas9对靶位点进行 随机剪切 Cruiser TM酶切细胞池，计 算突变率；Cruiser TM酶切 初筛阳性克隆；将阳性克 隆测序验证；做敲除序列 比对分析。
CRISPRCas9技术简介
CRISPR/Cas9技术详解，简单易懂 6月2日，Science杂志发表了关于CRISPR技术的突破性成果，确定了一个靶向RNA而非DNA的新型CRISPR 系统特征。来自麻省理工学院-哈佛大学Broad研究所、麻省理工学院、美国国立卫生研究院、罗格斯大学新布朗斯维克分校和俄罗斯Skolkovo理工学院的研究人员共同取得了这项研究成果，拥有“CRISPR/Cas之父”之称的著名科学家张锋也是这项研究的主导者之一。这再次让CRISPR技术成为了人们瞩目的焦点（最新论文PDF请见附件abudayyeh2016.pdf） CRISPR/Cas这项明星技术自问世以来，已经吸引了无数欢呼和掌声。在短短两三年之内，它已经成为了生物科学领域最炙手可热的研究工具，并有近700篇相关文献发表。CRISPR/Cas技术的先驱者们，包括张锋以及两位美女科学家珍妮弗·杜德娜和艾曼纽·夏邦杰，更是获得了众多荣誉和奖项。 CRISPR/Cas技术是什么？ CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒和外源质粒。同时，它为细菌提供了获得性免疫：这与哺乳动物的二次免疫类似，当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，从而可以抵抗它们的再次入侵。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。这与真核生物中RNA干扰（RNAi)的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas 系统被开发成一种高效的基因编辑工具。在自然界中，CRISPR/Cas系统拥有多种类别，其中CRISPR/Cas9系统是研究最深入，应用最成熟的一种类别。CRISPR/Cas9是继锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。凭借着成本低廉，操作方便，效率高等优点，CRISPR/Cas9迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手。在TALEN和ZFN的时代，科学家们往往要花费重金，把基因编辑工作交给生物公司。而现在，在实验室里，人们就可以使用CRISPR/Cas9技术轻松的实现基因编辑。 CRISPR/Cas9如何工作？ CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，充当了防御外源遗传物质的“基因武器”。CRISPR全称Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列，分布在40%的已测序细菌和90%的已测序古细菌当中。图1展示了完整的CRISPR位点的结构。其中，CRISPR 序列由众多短而保守的重复序列区（repeat）和间隔区（spacer）组成。重复序列区含有回文序列，可以形成发卡结构。而间隔区比较特殊，它们是被细菌俘获的外源DNA序列。这就相当于细菌免疫系统的“黑名单”，当这些外源遗传物质再次入侵时，CRISPR/Cas系统就会予以精确打击。而在上游的前导区（leader）被认为是CRISPR 序列的启动子。另外，在上游还有一个多态性的家族基因，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用。因此，该基因被命名为CRISPR关联基因（CRISPR associated，Cas）。目前已经发现了Cas1-Cas10等多种类型的Cas基因。Cas基因与CRISPR序列共同进化，形成了在细菌中高度保守的CRISPR/Cas系统。
CRISPR实验流程
CRISPR/Cas9 实验流程 交流企鹅: 2621697472（大家做哪块？） 一、利用Cas9质粒建立knock-out细胞系实验的详细过程 1.1 确定待敲除基因的靶位点 1.2 设计识别靶位点的识别的一对DNA Oligo（引物） 1.3 构建表达sgRNA的质粒 1.4 sgRNA活性检测 1.5 利用Cas9质粒建立knock-out细胞系 1.1、确定待敲除基因的靶位点 根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。找到该基因CDS区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。 1.2、设计识别靶位点的一对DNA Oligos 确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input框中（https://www.360docs.net/doc/5618650328.html,/），然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列（网站设计一般很慢或数据输出不完整，可使用我的内部软件，2天内输出全部结果，无物种限制）。一般地，
基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列（Protospacer Adjacent Motif）前间区序列邻近基序，这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割）的20个nt。而PAM序列的特征为NGG（其中N为任意核苷酸）。因此，sgRNA模板序列选择非常方便，即使没有软件，研究者也可手工进行选择。不过，在线软件可以给出该序列在基因组中存在相似序列的情况，即可能的脱靶位点。因此，利用在线软件可以选择脱靶机会小的序列作为sgRNA模板序列。 根据选择的sgRNA模板序列，合成一对序列互补的DNA Oligos（同时设计检测目的基因的引物一起合成）。 1.3、构建可表达sgRNA的质粒 （Precut SgRNA Cloning kit and pSD-gRNA Plasmid构建试剂盒） 企鹅: 2621697472 将合成的Oligos以逐步降温的方法退火成双链，然后与我们提供的质粒进行连接，连接后转化感受态的大肠杆菌，再进行涂板。 次日在LB琼脂平板上，挑取单克隆6个，溶于20ul LB液中，涡旋后，将部分菌液接种到LB液中，37oC下250 rpm生长，另部分的菌液用作模板进行快速PCR，经电泳确定阳性克隆后，将相对应的细菌送商业公司测序，同时将部分菌液接种到LB液体，37oC下250 rpm培养过夜。 1.4、sgRNA活性检测 1.4.1 sgRNA活性预检测--SSA活性检测 （Precut pSG-target Cloning kit & SSA assay检测试剂盒） 企鹅: 2621697472 ? SSA检测：根据客户要求检测sgRNA的活性及敲除效率，客户也可
CRISPR Cas 技术原理
CRISPR/Cas9概述 技术原理： CRISPR/Cas9（Clustered Regularly?Interspaced Short Palindromic Repeats）是最新出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，是一个细菌及古细菌进化出来用以抵御病毒和质粒入侵的适应性机制。CRISPR/Cas系统的高效基因编辑功能已被应用于多种生物，包括斑马鱼、小鼠、大鼠、秀丽隐杆线虫、植物。 此系统的工作原理是crRNA (CRISPR-derived RNA) 通过碱基配对与 tracrRNA (trans-activating RNA) 结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点处剪切双链 DNA，从而实现对基因组DNA序列进行编辑；而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的gRNA (guide RNA)，足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。 作为一种 RNA导向的 dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子 (unifying factor)，它能够共定位 RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的 Cas9(Cas9 nuclease-null)融合，并表达适当的gRNA，即可靶定任何 dsDNA 序列，而 RNA 可连接到gRNA 的末端，不影响 Cas9 的结合。因此，Cas9 能在任何 dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及 RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。 CRISPR/Cas9技术特点： 1）可实现对靶基因多个位点或多个基因同时敲除； 2）可对基因进行定点修饰（Tag、GFP、RFP、点突、条件性敲除），效率高。 3）实验周期短，价格低；
CRISPRICas9基因编辑器及其原理简介
CRISPR/Cas9基因编辑器及其原理简介CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），被称为规律成簇间隔短回文重复，实际上就是一种基因编辑器，是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统，也是一种对付攻击者的基因武器。后来，研究人员发现，它似乎是一种精确的万能基因武器，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞内的基因，这也意味着基因编辑器是一种可以广泛使用的生物技术。
CRISPR担当细菌的防护罩 CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。前导区一般位于CRISPR簇上游，是富含AT长度为300～500bp的区域，被认为可能是CRISPR簇的启动子序列。重复序列区长度为21～48bp，含有回文序列，可形成发卡结构。重复序列之间被长度为26～72bp的间隔区隔开。Spacer区域由俘获的外源DNA组成，类似免疫记忆，当含有同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别，并进行剪切使之表达沉默，达到保护自身安全的目的。 通过对CRISPR簇的侧翼序列分析发现，在其附近存在一个多态性家族基因。该家族编码的蛋白质均含有可与核酸发生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且与CRISPR区域共同发挥作用，因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPR associated)，缩写为Cas。目前发现的Cas包括Cas1～Cas10等多种类型。Cas基因与CRISPR共同进化，共同构成一个高度保守的系统。
CRISPRCas基因敲除原理及其应用
C R I S P R C a s基因敲除原 理及其应用 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020
CRISPR/Cas9基因敲除原理及其应用 CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一种来自细菌降解 入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR 系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件[1]。 目前，来自Streptococcuspyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。 由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统[1]。 通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（singleguideRNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作[2,3]。 目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下： Cas9质粒构建 设计2条单链oligo序列；退火形成双链DNA
CRISPR操作系统原理
一图瞧破CRISPR操作系统！ 近日,Cell发表了一篇名为“SnapShot: CRISPR-RNA-Guided Adaptive Immune Systems”的精华文章,用一张图,就全解析了CRISPR系统的“中心法则”。今天就让麦子带大家分解此图,真正掌握时下这个可以对人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫与农作物等细胞内的基因进行精确编辑的热门技术之精髓: 细菌与古细菌已经根据CRISPR(规律成簇的间隔短回文重复,Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)位点与多样化CRISPR相关(CRISPR-associated,Cas)基因,进化出了复杂的CRISPR适应性免疫系统。 CRISPR系统可以分为三种类型(I-III)及至少11种不同的亚型 (I-A~I-F,II-A~II-C,III-A~III-B)。但就是所有的CRISPR-Cas 免疫系统都就是通过主要的三个阶段来行使功能: ?外来DNA的采集 ?CRISPR RNA的生物合成 ?靶向干扰 第一阶段:外来DNA的采集(Foreign DNA Acquisition)
宿主通过Cas蛋白来识别外源核苷酸,入侵细菌的短片段DNA称为protospacers,它们作为间隔区序列插入到了宿主的CRISPR位点。在I与II型系统 中,protospacers选择自入侵DNA旁出现PAM的区域(PAM:protospacer adjacent motif,对于CRISPR结合至关重要)。一般protospacers通过包含Cas1、Cas2与游离3'-羟基等元件的机制连接在CRISPR位点的前导区(Leader)。Protospacer的整合也伴随着末端重新序列复制,这可能涉及宿主聚合酶与DNA 修复机制。 第二阶段:CRISPR RNA的生物合成(crRNA Biogenesis)
CRISPR原理
CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），被称为规律成簇间隔短回文重复，实际上就是一种基因编辑器，是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统，也是一种对付攻击者的基因武器。后来，研究人员发现，它似乎是一种精确的万能基因武器，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞内的基因，这也意味着基因编辑器是一种可以广泛使用的生物技术。 CRISPR担当细菌的防护罩 CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。前导区一般位于CRISPR簇上游，是富含AT长度为300～500bp的区域，被认为可能是CRISPR簇的启动子序列。重复序列区长度为21～48bp，含有回文序列，可形成发卡结构。重复序列之间被长度为26～72bp的间隔区隔开。Spacer区域由俘获的外源DNA组成，类似免疫记忆，当含有同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别，并进行剪切使之表达沉默，达到保护自身安全的目的。 通过对CRISPR簇的侧翼序列分析发现，在其附近存在一个多态性家族基因。该家族编码的蛋白质均含有可与核酸发生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且与CRISPR区域共同发挥作用，因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPR associated)，缩写为Cas。目前发现的Cas包括Cas1～Cas10等多种类型。Cas基因与CRISPR共同进化，共同构成一个高度保守的系统。 CRISPR的工作原理
CRISP原理
CRISPR/Cas9 基因敲除技术 CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ）是一种由RNA 指导的Cas9 核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。 CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御 机制。目前，来自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9 系统应用最为广泛。在这一系 统中，crRNA（CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与转录激活crRNA（trans-activating RNA ，tracrRNA ）退火结合形成双链RNA 能特异性识别基因组序列，Cas9 蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA 两条单链。Cas9 首先与crRNA 及tracrRNA 结合成复合物，然后通过PAM 序列结合并侵入DNA ，形成RNA-DNA 复合结构，进而对目的DNA 双链进行切割，生成DNA 双链断裂（double-strand breaks, DSBs ）。在基因组编辑过程中，tracrRNA 和crRNA 可以融合成为 1 条RNA （sgRNA ）表达同样可以起到靶向剪切的作用。 通过基因工程手段对crRNA 和tracrRNA 进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA ）。融合的RNA 具有与野生型RNA 类似的活力，但因为结构得到了简化更方便 研究者使用。通过将表达sgRNA 的原件与表达Cas9 的原件相连接，得到可以同时表达两者 的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作。 由于PAM 序列结构简单（5’-NGG-3 ’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点， 因此得到广泛的应用。 与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应核酸酶（Transcription act ivator-like effector nucleases T, ALEN ）相比较，CRISPR-Cas 系统介导的基因组靶向实验在真核细胞中具有相 似甚至更高的效率。 CRISPR/Cas9 系统可广泛应用于基因组工程，如基因抑制，基因敲除，基因敲入，基因 修复等。CRISPR-Cas9 体系的RNA-DNA 识别机制为基因组工程研究提供了一项简便而 强大的工具。其最重要的优势是Cas9 蛋白可在多个不同的gRNA 的引导下同时靶向多个基 因组位点，起到多靶点调控的作用。