SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量

项目三SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定蛋白质分子量

一实训目的

1掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的操作步骤

2学会聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理

二实训原理

用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质(protein),主要依赖于电荷效应和分子筛效应。再与标准样品对照即可确定各区带的成分。要利用凝胶电泳测定某样品的蛋白质分子量就必须去掉其电荷效应,因此,当电泳时,蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小。SDS能破坏蛋白质分子间以及其他物质分子间的非共价键使蛋白质的构象发生变化,继而使蛋白质变性解离成单一亚基,从而降低或消除了各种蛋白质分子间的天然电荷差异,形成SDS-蛋白质负离子,因此,当电泳时,蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小,当蛋白质分子量在1.2X104~16.5X104之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈直线关系,符合下列方程。

LogMW=K-bm

(LogMW为分子量的对数,K、b为常数,m为迁移率)

若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋

白质在相同条件下进行电泳根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得其分子量.

三、实训器材

配制方法

1、浓缩胶缓冲液:1.5克Tris、12.0毫升1mol HCl,加水混匀定容至25毫升。

2、分离胶缓冲液:18.15克Tris、48.0毫升1 mol HCl,加水混匀定容至100毫升。

3、电极缓冲液:3克Tris,14.4克甘氨酸、1克SDS,加水混匀定容至1000毫升。

4、1%过硫酸铵:1克过硫酸铵溶于l00ml蒸馏水中,临用前配制。

5、样本缓冲液(Tris-HCl pH6.8 I=0.0625M):取浓缩胶缓冲液(B液)1:7(v/v)稀释。

6、样本变性液(Tris-HCl pH6.8 I=0.01M,2%SDS,10%蔗糖,0.001%溴酚兰);0.8克SDS,

4克蔗糖溶于样本缓冲液定容至20毫升,再1滴0.1%溴酚兰。使用时与样本l:1(v/v)混匀。

7、固定液:57.0克TCA,17.0磺基水杨酸,150毫升甲醇,加水350毫升混匀。

或25%异丙醇和10%乙酸的混合液中1h,蛋白质就得到固定了。

8、染色液:1.25克考马斯亮兰R-250,227毫升甲醇,227毫升水,46毫升冰乙酸混匀,滤

纸过滤。

9、脱色液:10%乙醇-70%醋酸。100毫升乙醇,70毫升醋酸加水混匀定容至1000毫升。

10、保存液:10%乙醇-10%醋酸-10%甘油,100毫升乙醇,100毫升醋酸,100毫升甘油加

水混匀定容至1000毫升。

11、指示染料液:0.1溴酚兰(BPB),100毫克溴酚兰溶于100毫升水中。

四、实训步骤

(一)制备聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.电泳槽的安装:

干燥的两块玻璃板装入配套塑料夹套内,垂直固定在电泳槽上,周边用1.5%的琼脂密封。

2. 样品处理:

将各种标准蛋白质和待测样品分别溶于蛋白质处理液(浓度2mg/ml),在沸水中加热3~4min,待冷却后作点样用。

3. 制胶:选择合适的胶浓度按下表配制7.5%的分离胶,(为小孔胶,进行电泳和分子筛分离)

1、分离胶的制备:10%(催化剂过硫酸铵,加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)

试剂分离胶(10%)(单位:ml)

A液 3

C液 1.85

蒸馏水 3.5

1%TEMED 0.6

E 0.05

总量9ml,化学聚合30-60分钟

2、浓缩胶的制备:4.5%为大孔胶,进行样品浓缩,

试剂浓缩胶(10%)(单位:ml)

A液0.43

C液 1.25

蒸馏水0.9

1%TEMED 0.25

E 0.015

总量2.845ml,光聚合30-60分钟(催化剂核黄素,加速剂(TENED)

混合后将其沿长玻璃板加入两块玻璃板之间(小心不要产生气泡),加到距短玻璃板上边缘3cm处,立即覆盖2~3mm水层,静止聚合约40min左右。胶聚合好的标志是胶与水之间形成清晰的界面。吸取分离胶的水分,将配制好的浓缩胶注入分离胶之上,立即插上有机玻璃的点样槽模板,待浓缩胶聚合好备用。

4. 点样:

用微量注射器分别吸取标准蛋白质样品液5μl,按分子量(从小到大)的顺序注入样品槽内的浓缩胶面上,同时吸取待测样品液25μl,注入其它样品槽内,在样品上小心地注入电极缓冲液。

5. 电泳:

加样完毕,两槽注入电极缓冲液,接通电源(上负下正),调节电流为15mA,当指示剂进入分离胶后,电流需加大到30mA,电压恒定在80~100伏之间,约3~4h后,指示剂达到距前沿1~2cm时,可终止电泳。

6. 固定:

胶取出后,在水中浸泡10min,浸出部分SDS,然后将胶浸泡在25%异丙醇和10%乙酸的混合液中1h,蛋白质就得到固定了。

7. 染色:

取出凝胶板,测定胶长(D1)后,加入染色液染色2h。

8. 脱色

将胶放在脱色液中脱色0.5h,每隔0.5h换一次脱色液,至少换3次,待蓝色基本脱掉,再放在脱色液里浸泡至蛋白质谱带清晰为止,精确测定胶长(D2)。

(二)、蛋白质标准样品迁移率和待测样品分子量的计算

根据蛋白质分子量对数和电泳迁移率的关系,精确测量溴酚蓝和各种蛋白质迁移距离。把溴酚蓝迁移的距离定为d1,蛋白质迁移距离定为d2,并以D1定为凝胶染色前的长度,D2定为凝胶染色后的长度。根据下面公式计算各种蛋白质的迁移率Rm:Rm=d2d1×D1D2以标准蛋白质的迁移率为横座标,以其对应的分子量对数为纵座标,绘制标准曲线,可得到一条直线,然后根据未知样品的迁移率,在半对数座标图上查出其对应的分子量。要得到一个可靠的结果,实验需多次重复。

五、实训结果

分离胶未凝固

六、实训结果分析

1、加入催化剂过硫酸铵的量或浓度不够,导致分离胶的聚合时间过长,可适当加大过硫酸铵的量或增大过硫酸铵的浓度,

2、操作的室温温度过低,延长聚合时间,必要时可用电炉在电泳槽旁加热,缩短聚合时间

3、过硫酸铵过期,起不到催化作用

4、垂直玻璃板的底部应与底部橡胶边缘紧密结合,避免分离胶凝固就漏胶。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳色谱

(免费共享)SDS-PEGA聚丙烯酰胺凝胶电泳常见问题及分析

常见问题及分析 1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响? 在SDS-PAGE不连续电泳中,制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统,浓缩胶是pH6.7,分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中,其pH 环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,其在电场的作用下,泳动效率低;而CL离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比,这一区带便形成了较高的电压梯度,压着蛋白质分子聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后,由于胶中pH的增加,呈碱性,甘氨酸大量解离,泳动速率增加,直接紧随氯离子之后,同时由于分离胶孔径的缩小,在电场的作用下,蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。 所以,pH对整个反应体系的影响是至关重要的,实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况,应首要考虑该因素。 2. 样品如何处理? 根据样品分离目的不同,主要有三种处理方法:还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。 1) 还原SDS处理:在上样buffer中加入SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后,蛋白质构 象被解离,电荷被中和,形成SDS与蛋白相结合的分子,在电泳中,只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理,样品稀释适当浓度,加入上样Buffer,离心,沸水煮5min,再离心加样。 2) 带有烷基化作用的还原SDS处理:碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保 护SH基团,得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT,而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺,并在室温保温30min。 3) 非还原SDS处理:生理体液、血清、尿素等样品,一般只用1%SDS沸水中煮3min, 未加还原剂,因而蛋白折叠未被破坏,不可作为测定分子量来使用。 3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用? 聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关; 制胶缓冲液:浓缩胶选择pH6.7,分离胶选择pH8.9,选择tris-HCL系统,TEMED 与AP:AP提供自由基,TEMED是催化剂,催化自由基引起的聚合反应进行;十二烷基磺酸钠(SDS):阴离子去污剂,作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径? 聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝胶的分辨率。建议做法:待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺。 一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料,不同染料又各自不同的染色方法,具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

聚丙烯酰胺

聚丙烯酰胺 1、定义 丙烯酰胺聚合物是丙烯酰胺的均聚物及其共聚物的统称。工业上凡是含有50%以上的丙烯酰胺(AM)单体结构单元的聚合物,都泛称聚丙烯酰胺。其他单体结构单元含量不足5%的通常都视为聚丙烯酰胺的均聚物。 聚丙烯酰胺,polyacrylamide(PAM),CAS RN:[9003-05-8],结构式为: n是聚合度。n的范围很宽,数量级为102~105,相应的相对分子质量由几千到上千万。 分子量是PAM的最重要参数。按其值得大小有低分子量(<100×104)、中等分子量(100×104~1000×104)、高分子量(1000×104~1500×104)和超高分子量(>1700×104)四种。不同分子量范围的PAM有不同的使用性质和用途。 2、分类 聚丙烯酰胺按在水溶液中的电离性可分为非离子型、阴离子型、阳离子型、两性型。 非离子型聚丙烯酰胺(NPAM)的分子链上不带可电离基团,在水中不电离;阴离子型聚丙烯酰胺(APAM)的分子链上带有可电离的负电荷基团,在水中可电离成聚阴离子和小的阳离子;阳离子型聚丙烯酰胺(CPAM)的分子链上带有可电离的正电荷基团,在水中可电离成聚阳离子和小的阴离子;两性的聚丙烯酰胺(AmPAM或ZPAM)的分子链上则同时带有可电离的负电荷基团和正电荷基团,在水中能电离成聚阴离子和聚阳离子,ZPAM的电性依溶液体系的PH值和何种类型的电荷基团多寡而定。 PAM的电性称谓和所带的电荷基团解离后的电性称谓相同。 按照聚合物分子链的几何形状可把PAM分为线型、支化型和交联型。PAM分子链的形状一般是线型结构。但是在丙烯酰胺自由基聚合反应的过程中会发生链转移反应。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实 验原理和操作步骤 实验原理: SDS-PAGE是对蛋白质进行量化,比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。 SDS是一种去垢剂,可与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后,电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。 试剂和器材: 试剂:1. 5x样品缓冲液(10ml):0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油,2ml 10%的SDS,0.5ml巯基乙醇,1ml 1%溴酚蓝,0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周,或在-20℃保存数月。 2. 凝胶贮液:在通风橱中,称取丙烯酰胺30g,甲叉双丙烯酰胺0.8g,加重蒸水溶解后,定容到100ml。过滤后置棕色瓶中,4℃保存,一般可放置1个月。 3. pH8.9分离胶缓冲液:Tris 36.3g ,加1mol/L HCl 48ml,

加重蒸水80ml使其溶解,调pH8.9,定容至100ml,4℃保存。 4. pH6.7浓缩胶缓冲液:Tris 5.98g ,加1mol/L HCl 48ml,加重蒸水80ml使其溶解,调pH 6.7,定容至100ml,4℃保存。 5. TEMED(四乙基乙二胺)原液 6.10%过硫酸铵(用重蒸水新鲜配制) 7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液:称取Tris 6.0g,甘氨酸28.8g,加蒸馏水约900ml,调pH8.3后,用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存,临用前稀释10倍。 8. 考马斯亮蓝G250染色液:称100mg考马斯亮蓝G250,溶于200ml蒸馏水中,慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸,最后补足水到250ml,搅拌1小时,小孔滤纸过滤。 器材:电泳仪,电泳槽,水浴锅,摇床。 实验操作

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量 一、前言 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳,简称PAGE,是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成,聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂,以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中,TEMED催化过硫酸铵产生自由基,后者引发丙烯酰胺单体聚合,同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联,从而形成三维网状结构。 PAGE根据其有无浓缩效应,分为连续系统和不连续系统两大类,连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性,这是样品浓缩的主要因素。

SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇,二硫糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。 SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统,与连续缓冲系统相比,能够有较高的分辨率。 浓缩胶的作用是有堆积作用,凝胶浓度较小,孔径较大,把较稀的样品加在浓缩胶上,经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液,电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后,HCl解离成氯离子,甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷,因此一起向正极移动,其中氯离子最快,甘氨酸根离子最慢,蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大,超过蛋白,因此在后面形成低电导区,而电场强度与低电导区成反比,因而产生较高的电场强度,使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动,形成一稳定的界面,使蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一中间层。 此鉴定方法中,蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量,而与所带电荷和分子形状无关。 聚丙烯酰胺凝胶电泳作用原理 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构,具有分子筛效应。它有两种形式:

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤

【跑电泳的步骤】 1、取出电泳仪器和四个烧杯; 2、将超纯水倒入烧杯中,保鲜膜封口; 3、配制过硫酸铵溶液(AP):0.1gAP+0.9g超纯水,保鲜膜封口; 4、取出所有药品。Tris-HCL(88,6.8),TEMED,SDS,Acry-bis,按次序排好; 5、拿卷纸平铺,移液枪枪头:三个蓝,两个黄,一个白,移液枪3只; 6、先配分离胶 7、组装凝胶模具,插好板 (1)海绵用自来水润湿,插在下面槽里; (2)板:Bio-Rad前后玻璃板,注意前后顺序,夹子夹好,塞枪头于夹子上。 8、配胶见配方,用2号蓝混匀所有试剂; 9、加液至支架上方,用超纯水液封(不能用气泡); 10、待界面清晰后,用滤纸将水吸干; 11、配浓缩胶; 12、插梳子:一个个斜着插,有字面朝向我; 13、拔下梳子,转移(有字朝里,白色架子垫黄纸,将玻璃板卡在绿卡下面,不要有空隙,装去离子水,不能漏(1h),等待。),样品煮沸3分钟; 14、用10uL移液枪移液,移液,每个依次加入梳槽内; 15、电压(浓缩胶)90V,电流20mV; 16、盖上盖子:红对红,黑对黑;插上电源插头:红对红,黑对黑。 【附配方】 分离胶separating gel (5mL) ( 1个板3.5mL)1板2板

Prescription12%10%7.5% 3.5 mL7.0 mL Del H2O 1.6 mL 1.9mL 2.3 mL 1.3 3mL 2.66mL 1.5M Tris-HCL pH8.8 1.3 mL 1.3 mL 1.3 mL0.91 mL 1.82 mL 30%Acry/bis 2 mL 1.7 mL 1. 3 mL 1.19mL 1.38 mL 单体胶(29.2g+0.8g/100mL) 10%SDS50uL50uL50uL35uL70uL 10%AP50uL50uL50uL35uL70uL 7uL(夏)~8 TEMED2uL2uL(5 uL)2uL 3.5uL uL 浓缩胶Stacking gel ( 2板3mL) Prescription Volume(2 mL)(2 mL) Del H2O 1.4mL 2.1mL 0.5M Tris-HCL pH6.8250uL375uL 30%单体胶330uL495uL 10%SDS20uL30uL 10%AP20uL30uL TEMED2uL(5 uL)3uL(8 uL冬,5 uL夏) 【附所需试剂配制】 1、30%单体胶(30%单体胶即30%T,2.67%C)配制50mL:丙烯酰胺Acry:14.6g,甲叉双丙烯酰胺bis:0.4g;(100mL:Acry 29.2g,bis 0.8g) 超纯水定容至50mL,0.45 uM膜过滤,4℃保存(一个月);说明:单体浓度%T是指单体总质量(丙烯酰胺+双丙烯酰胺)在

蛋白质四级结构及其检测方法

论述一、二、三、四级蛋白质结构及其检测方法? 蛋白质定义:由一条或多条多肽链以特殊方式结合而成的生物大分子,通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。 一、蛋白质一级结构: (一)定义:蛋白质的一级结构又称为共价结构或化学结构,它是指蛋白质中的氨基酸按照特定的排列顺序通过肽键连接起来的多肽链结构。氨基酸残基主要通过肽键连接,有些蛋白质中含有二硫键。 (二)检测方法: 二硝基氟苯(DNFB)法、丹磺酰氯法、氨肽酶法、C-末端氨基酸测定(肼解法、还原法、羧肽酶法) 二、蛋白质二级结构: (一)定义:蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构,即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置,只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。并不涉及氨基酸残基侧链的构象。主要的化学键为氢键。 (二)检测方法: 构象的研究方法:X射线衍射法、核磁共振光谱法、圆二色谱CD、紫外-可见差光谱、荧光探针法、激光拉曼光谱法、红外光谱法、关联规则与遗传算法。 三、蛋白质三级结构: (一)定义:整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。主要的化学键:疏水键、离子键、二硫键、氢键和配位键稳定维系三级结构的作用。 (二)检测方法: 同源建模(比较建模SWISS-MODEL)法、穿针引线方法(折叠识别方法)、从头预测法、最速下降法、牛顿法、共轭梯度法、遗传算法、分解-结合法、离散化方法、分子动力学法、混合预测方法、粒子群优化算法(PSO)。 四、蛋白质四级结构: (一)定义:有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链,每一条多肽链都有完整的三级结构,称为蛋白质的亚基。蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用,称为蛋白质的四级结构。亚基之间的结合力主要是疏水作用,其次是氢键和离子键。 (二)检测方法: 线性降维法:Swiss-Prot数据库中抽取数据集进行四级结构预测。 Quat-PRE方法:综合运用mRMR方法和SVM的wrapper方法进行四级结构预测。 最近邻居算法:从蛋白质一级序列出发,利用蛋白质序列氨基酸组成、二肽组成以及混合组成方法对蛋白质单聚体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体和八聚体进行分类研究。

聚丙烯酰胺特性黏度的测定及分子量计算

聚丙烯酰胺特性黏度的测定及分子量计算 根据中国国家标准GB12005.聚丙烯酰胺的分子量用特性黏度法测定;水解度用中和法测定;残余单体的含量大于0.01%吋用气相或液相色谱法测定.大于0.5%时用溴化法测定。 (1)特性黏度的测定及分子量计算 ①测定原理:按规定条件制备浓度为0.0005-0.OOlg/mL的试样溶液,该溶液以氯化钠溶液为溶.c(NaCl)=1.00mol/L。用气承液柱式乌式毛细管黏度计分别测定溶液和溶剂的流经时间.根据测得值计算特性黏度。本方法适用于不同聚合方法制备的粉状和胶状非离子型聚丙烯酰胺和阴离子型聚内烯酰胺。 ②仪器 a、玻璃毛细管黏度计:采用GB1632规定的稀释型乌氏毛细管黏度计,如图4.73所示,阳离子聚丙烯酰胺

技术要求如下: i、应使浓度为lmol/L的氯化钠水溶液在30°下的流经时间在 100-130s范围内; ii、型号为4-0.55和4-0.57,其中4表示定量球6的容积(单位mL).0.55和0.57表示毛细管内径(单位mm)。 b、恒温水浴:控温精度士0.05°C。 c、秒表:分度值0.Is。 d、分析天平:感量0.OOOlg。 e、容量瓶:容积25mL、50mL、100mL、200mL。阳离子聚丙烯酰胺厂家 f、移液管:容积5mL、10mL、50mL? g、具塞锥形瓶:容积250mL。 h、玻璃砂芯漏斗:G-2型。 i、烧杯:容积lOOmL。

j、量筒:容积50mL。 k、注射器、乳胶管洗耳球等。 ③试剂和溶液:本分析方法所用的试剂和水,均为分析纯试剂和蒸馏水。 a、氯化钠溶液:将氣化钠用蒸馏水配制成c(NaCl)=l.OOmol/L和 c(NaCl)=2.OOmol/L的溶液。 b、铬酸洗液。阳离子聚丙烯酰胺厂家 ④试样溶液的配制 a、粉状聚丙烯酰胺:在lOOmL容量瓶中称人0.05-0.lg均匀的粉状试样,准确至0.OOOlg。加人约48mL的蒸馏水,经常摇动容量瓶。待试样溶解后,用移液管准确加人50mL浓度2.00mol/L的氯化钠溶液,放在(30±0.05)°C水浴中。恒温后,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀,用于燥的玻璃砂芯漏斗过滤,即得试样浓度约 0.0005-0.001g/mL 且氯化钠浓度为l.OOmol/L的试样溶液,放在恒温水浴中备用。 b、胶状聚丙烯酰胺:在已准确称量的lOOmL烧杯中,称人固含量为8%-30%的胶状试样0.66-1.25g.精确至0. OOOlg。加入50mL蒸馏水.搅拌溶解后,转移入200mL容量瓶中。加人lOOmL浓度为2.00mol/L 的氯化钠溶液.放在恒温水浴中。恒温后,用蒸馏水稀释至刻度.摇匀,用千燥的玻璃砂芯漏斗过滤,即得试样浓度约为0. 0005-0.001g/mL,且氯化钠浓度1.00mol/L的试样溶液,放在恒温水浴中备用。阳离子聚丙烯酰胺厂家

蛋白质含量测定方法及其比较资料2

蛋白质含量测定法(一) 蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩脲法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 五种蛋白质测定方法比较

值得注意的是,这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定,有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的,都有其优缺点。在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质;④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法(Bradford法),由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏(Kjeldahl)定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下: NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3) 反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。 二、双缩脲法(Biuret法) (一)实验原理 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。 (二)试剂与器材

SDS-PAGE电泳问题总结

SDS-PAGE电泳问题总结(2012-04-19 20:07:12)转载▼ 标签:杂谈分类:々☆常用技术☆々 蛋白质条带为什么走到下面逐渐变宽发散? 回答:多数情况是因为小分子在胶里的运动不规律,这种情况常发生在高浓度胶或凝固不 一致的胶里,你可以加大阴极的缓冲液浓度,可能会有点改善 胶凝的快慢不在于TEMED多少,在于APS的量,APS提供自由基,TEMED帮助自由基作用,是催化剂,对凝固速度影响不是太大,可以试试加大APS的量 丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶的分辨范围 15 %15~45 kDa 12.5%15~60 kDa 10 %18~75 kDa 7.5%30~120kDa 5 %60~212kDa 来源于《蛋白质技术手册》汪家政 每种浓度的变性胶的分离范围不是指能跑出哪个范围分子量的蛋白质,而是指在这个区 间内,蛋白质迁移率基本和分子量成正比,也就是线性关系,为了数据的可靠性,大家 尽量根据这个来选择自己配胶的浓度。 下层也就是阳极缓冲液的作用当然是导电,用普通TRIS缓冲液做阳极缓冲液,一样跑得好,阴极就不一样了,需要提供离子强度和SDS环境,而在电泳过程中,阴极缓冲液的一些离子损失,而且与样品接触,不适合再次使用
至于有些时候跑太大浓度的胶,因为药品,BUFFER配制过程的一些问题,导致会出现蛋白带无法电泳到分离胶的最下方,胶跑得难看情况比较多,一般来说,15%的胶已经能够跑出大约15KDa左右的蛋白,对于普通SDS-PAGE已经几乎到了极限,还跑不出来的MARK带,就不必去追究商品的问题了 SDS-PAGE胶的凝结速度受温度影响很大,随着温度的升高,凝结速度越来越快,温度降 低则反之。所以,夏天时胶凝结的比较快,而冬天脚的凝结速度则变慢,甚至不能凝结,解决此类问题较可行的方法是:冬天在原配方的基础上加倍过硫酸铵和TEMED的使用量,可很好的解决胶凝结速度过慢的问题。 做SDS-PAGE的时候,除了蛋白量上样一致,最好体积也一致,这样跑出来的胶各个泳道之间的band能做到一样宽,方便后面的比较,特别是WB。做法就是拿1X的上样缓冲补全要加的样做到体积一致,否则跑出来会有的宽有的窄,特别是上样体积相差较大的 加入染色液后,先放入微波炉里加热5-10秒,使染色液微热即可(千万不要加热太久, 否则冰醋酸就挥发了)。然后放水平摇床上摇20分钟,最多半小时就染好了。脱色也很 简单,不用脱色液,直接用去离子水,放微波炉里煮沸5分钟左右,然后将水倒掉,再换上新的去离子水煮,这样反复几次,就可以了。效果可能比正常的脱色稍差一点点,不 如那样清楚,只要电泳时比平时多上1/5的样品就可以了,关键是这样省时省材料(用不着含甲醇和冰醋酸的脱色液)。方便快捷!放心,反复煮胶不会把胶煮坏的。

聚丙烯酰胺PAM

PAM申华原料规格: 申华化学工业有限公司 原料规格表M40-RAD-01 RAW MATERIAL SPECIFICATION 1、原料名称(Material) 原料编号(Code No.)M-4030 版别:1.0 原料名称(Material)聚丙烯酰胺(部分水解)〖Polyacrylamide (PAM)〗 2、规格项目(Specifications) 规格项目(Specifications)指标(Limits)测试方法(Test Method) Appearance White Grain Total Solid / % ≥90 Solubilization Speed / hr ≤1.5 Anion Content / % 20-30 即水解度 Free Monomer / % ≤0.05 3、分子式(Formula) ?[?CH2?CH?]m?[?CH2?CH?]n? ∣∣ C=O C=O ∣∣ NH2O Na 4、分子量(Molecular Weight):3000,000-13000,000 聚丙烯酰胺(cpolyacrylamids)简称PAM,是一种线型高分子聚合物,是水溶性高分子化合物中应用最为广泛的品种之一,聚丙烯酰胺和它的衍生物可以用作有效的絮凝剂,增稠剂,纸张增强剂,以及液体的减阻剂等,广泛应用于水处理、造纸、石油、煤矿、矿冶、地质、轻纺,建筑等工业部门。 一、市售产品规格及主要技术指标 技术指标名称PAM 阴离子PAM 非离子PAM 阳离子PAM 复合离子 外观白色或微黄色粉末 粒径,mm < 2 固含量(%) ≥ 88 溶速(mim) ≤ 1.5 不溶物(%) ≤ 2 分子量(万) 500-2400 300-600 300-800 800-1500 水解度(%) 13-30 5-15 离子度5-50 10-20 注:根据用户要求,分子量控制在表格所定指标的范围内根据市场价格面议 加强混凝作用 ⑴聚合氯化铝(PAC)聚合氯化铝又名碱式氯化铝或羟基氯化铝。它是以铝灰或含铝矿物作为原料,采用酸溶或碱溶法加工制成。其分子式为[Al2(OH)nCl6-n]m ,其中m为聚合度,单体为铝的羟基配合物Al2(OH)nCl6-n ,通常n=1~5,m≤10。聚合氯化铝溶于水后,即

SDS-PAGE电泳实验步骤

垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 一、实验目的 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。 二、实验原理 蛋白质是两性电解质,在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时,蛋白质本身带负电,在电场中将向正极移动;当溶液的pH小于蛋白质的等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动;蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统,调整双丙烯酰胺用量的多少,可制成不同孔径的两层凝胶;这样,当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大,不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时,受到的阻滞基本相同,因此以相同的速率移动;当进入小孔胶时,分子量大的蛋白质移动速度减慢,因而在两层凝胶的界面处,样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时,在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时,采用两种缓冲体系;上层胶pH=6.7—6.8,下层胶pH=8.9;Tris —HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH,是缓冲配对离子;CI-是前导离子。在pH6.8时,缓冲液中的Gly-为尾随离子,而在pH=8.9时,Gly的解离度增加;这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性,控制了慢离子的解离度,进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点,在进入分离胶后,各种蛋白质由于所带的静电荷不同,而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应,分子筛效应及电荷效应,使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS),由于SDS带有大量的负电荷,且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性,特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下,蛋白质分子内的二硫键被还原,肽链完全伸展,使蛋白质分子与SDS充分结合,形成带负电性的蛋白质—SDS复合物;此时,蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量,掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小,在电场中移动得愈快;反之,愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是: M r =K(10-b·m) logM r =LogK—b·R m , 式中M r ——蛋白质的分子量; logK——截距; b——斜率; R m ——相对迁移率。 实验证明,蛋白质分子量在15,000—200,000的范围内,电泳迁移率与分子量

蛋白质相对分子质量的测定(SDS法)

蛋白质相对分子质量的测定 (SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法) 一、实验原理 蛋白质在十二烷基硫酸钠(SDS)和巯基乙醇的作用下,分子中的二硫键还原,氢键等打开,形成按1.4gSDS/1g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物,该复合物带负电,故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移,且主要由于凝胶的分子筛作用,迁移速率与蛋白质的分子量大小有关,因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。 聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统,主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶,配制凝胶的缓冲液,其pH值和离子强度也相应不同,故电泳时,样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动,在分离胶表面形成了一个极薄的层面,大大浓缩了样品的体积,即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。 二、仪器及器材 垂直电泳槽及附件、直流稳压稳流电泳仪、移液器等。 三、试剂 1、凝胶贮备液:称取30g 丙烯酰胺(Acr)和0.8g 甲叉-双丙烯酰胺(Bis),蒸馏水溶解后定容至100mL,滤纸过滤贮存。 2、10% SDS:称取SDS 10g 加蒸馏水至100ml。 3、10%过硫酸胺(AP),用时现配。 4、N,N,N’,N’四甲基乙二胺(TEMED)。 5、电极缓冲液:3.03g Tris、14.14g甘氨酸、1.0g SDS溶于水,混匀后用HCL调节pH至8.3,加蒸馏水至1 000ml。 6、样品溶解(缓冲)液:0.6gTris、5mL甘油(丙三醇)1.0g SDS溶于水,混匀后用HCL调节pH至8.0,再加0.1g溴酚蓝、2.5mL巯基乙醇,定容至100mL。 7、下层胶(分离胶)缓冲液:18.17g Tris、0.4gSDS溶于水,混匀后用1mol/L HCL 调节pH至8.8,加蒸馏水至100ml。 8、上层胶(浓缩胶)缓冲液:6.06g Tris、0.4gSDS溶于水,混匀后用1mol/L HCL 调节pH至6.8,加蒸馏水至100ml。 9、固定液:25%异丙醇,10%乙酸。 10、染色液:0.125g考马斯亮蓝R-250加固定液250ml。 11、脱色液:冰乙酸75ml、甲醇50ml,加水定容至1000ml。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 实验报告

一、实验目的 1.学习SDS-PAGE分离蛋白质的原理; 2.掌握垂直板电泳的操作方法。 二、实验原理 1、电泳: (1)定义:是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。 (2)影响电泳效果的因素: ①带电颗粒的大小和形状:颗粒越大,电泳速度越慢,反之越快; ②颗粒的电荷数:电荷越少,电泳速度越慢,反之越快; ③溶液的粘度:粘度越大,电泳速度越慢,反之越快; ④溶液的pH值:影响被分离物质的解离度,离等电点越近,电泳速度越慢,反之越快; ⑤电场强度:电场强度越小,电泳速度越慢,反之越快; ⑥离子强度:离子强度越大,电泳速度越慢,反之越快; ⑦电渗现象:电场中,液体相对于固体支持物的相对移动; ⑧支持物筛孔大小:孔径小,电泳速度慢,反之则快。 2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) (1)定义 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE):是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。 SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基磺酸钠) (2)SDS的作用 SDS是一种阴离子去垢剂,可与蛋白质结合,形成SDS-蛋白质复合物。 由于SDS带有大量负电荷,好比蛋白质穿上带负电的“外衣”,蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。 因此在电泳时,蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小 (3) SDS-PAGE分类: ?SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类: 连续系统:电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统:缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯度均不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳 (4)聚丙烯胺凝胶的生成: 聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体(Acr)和N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下聚合而成。在具有自由基时,Acr和Bis就会聚合。 引发产生自由基的方法有两种:

SDS-PAGE凝胶电泳

蛋白质亚基分子量测定SDS-PAGE凝胶电泳 一目的 掌握SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质亚基分子量的基本原理和操作方法 二原理 SDS是一种阴离子去污剂,作为变性剂和助溶性试剂,能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白质分子的二级、三级结构;而强还原剂,如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。 因此,在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后,蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链,解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后,形成带负电的蛋白质-SDS胶束,所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量,消除了不同分子间的电荷差异;同时,蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同,这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。 基于上述SDS-PAGE的原理介绍,我们可以利用SDS-PAGE电泳进行未知蛋白质的分子量测定;以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率,制作标准校正曲线,然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳,测定迁移率,从标准曲线得到相应的分子量 三试剂和器材 试剂:1低分子量标准蛋白质 2 待测蛋白质样品(用上次测定的可溶性蛋白样液) 3 凝胶贮液:30g丙烯酰胺,0.8g甲叉双丙烯酰胺,溶于100ml蒸馏水中,过滤,于4°暗处贮存,一个月内使用 4 1mol/l,PH8.8 Tris-HCl 缓冲液,Tris121g溶于蒸馏水,用浓盐酸调至PH8.8,以蒸馏水定容至1000ml 5 10%(w/v)SDS 6 10%(w/v)过硫酸铵溶液(当天配) 7 四甲基乙二胺(TEMED) 8 电极缓冲液PH8.3:Tris30.3g,甘氨酸144.2g,SDS 10g,溶于蒸馏水并定容至1000ml,使用时稀释10倍。 9 2×样品稀释液:SDS 500mg,巯基乙醇1ml ,甘油3ml, 溴酚蓝4mg,1mol/L Tris-HCL (pH6.8),用蒸馏水溶解并定容至10ml,按每份1ml分装,可在4℃存放数周,或在-20℃保存数月。以此液制备样品时,样品若为液体,则加入与阳平等体积的原液混合即可。 10 固定液:500ml 乙醇,100ml冰醋酸,用蒸馏水定容至1000ml 11 脱色液:250ml乙醇,80ml冰醋酸,用蒸馏水定容至1000ml 12 染色液:0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250ml脱色液中 器材:微量进样针,电泳仪,电泳槽 四操作步骤 1分离胶制备: 凝胶浓度5% 7.5% 10% 12.5% 15% 凝胶贮液ml 5 7.5 10 12.5 15 1mol/LPH8.8 Tris-HClml 11.2 11.2 11.2 11.2 11.2 水ml 13.7 11.2 1.2 8.7 3.7 10% SDS ml 0.3 10% 过硫酸铵ml 0.1 TEMED (μL) 20 将上述胶液配好,混匀后,迅速加入两块玻璃板间隙中,使胶液面与矮玻璃和高玻璃之间形

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量

实验六报告: SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量 1.研究背景及目的 根据自然界中普遍存在的电泳现象,以及实践应用的需求,科学家不断完善了电泳技术,从移界电泳法、垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳、垂直柱型盘状电泳到水平板型电泳。电泳技术广泛地应用于样品的分析鉴定。蛋白质分子量的测定在理论和实践中具有很重要的意义,比如临床中对于尿液中蛋白质分子量的测定可以监测人体内的某些疾病(肾小管损坏、多发性骨髓瘤等)。这种需要促进了相关技术的发明。具体过程见原理。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。从活性电泳到变性电泳经过了很多思考。从活性如果加入一种试剂使电荷因素及分子的形状消除,那电泳迁移率就取决于分子的大小,就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。 1967年,Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)具有这种作用[1] 。 通过向样品中添加入巯基乙醇和过量SDS,使蛋白质变性解聚,并让SDS与蛋白质结合成 带强负电荷的复合物,掩盖了蛋白质之间原有电荷的差异。SDS与蛋白质分子结合,不仅 使蛋白质分子带上大量的负电荷,而且使蛋白质分子的形状都变成短棒状,从而消除了蛋白质分子之间原有的电荷差异和分子形状的差异。因此蛋白质在SDS-PAGE中的时迁移率 主要取于其分子大小。由于SDS与蛋白质的结合,电泳迁移率在外界条件固定的情况下,只取决于蛋白质分子量大小这一因素,使得SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分辨率高、重复性好等特性,因此广泛应用于未知蛋白质分子量测定。通过本次实验,学习和掌握垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法,进一步学习和应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量。 2.原理 由于技术的发展,理论上可以通过测序测出蛋白质分子量的真值,但是实际操作过于繁琐,且生物大分子的数量级是KDa,实际中往往不需要特别精确。所以转向寻求其它方法,如果两种性质具有相关性,就会有相关理论基础和技术,发现分子量与迁移速率有关,于是寻找相关方面的技术。通过沉降平衡法测定分子量,但是需要很大的转速,且要考虑安全性和造价,于是舍弃;分子筛层析主要以分子量差异进行分离,可以用来测定分子量,但是需要很长的分离柱,分离速度较慢,还要测定OD值,操作麻烦,浪费时间,而且带 来的经济效益也不是很大;与此同时,电泳技术也发展起来,电泳相对时间较短,造价低,可操作性强。电泳与分子量、分子形状以及所带电荷量有关,其中含有分子量,理论上就可行了,于是用电泳测定分子量。首要矛盾是消除电荷差异和分子形状差异,从数学上彻底消除电荷效应是不可能的,使带电量相同也不可能实现,只有使分子带上非常大的电荷量从而使分子间的电荷差异可以忽略。想到通过引入外来物形成复合物,定量引入,定量结合,且结合后分子间差异并未发生改变。关于引入负电还是引入正电的问题,蛋白大多为球状,若结合后仍未球状,静电结合不稳定;双亲性物质彻底结合后破坏空间结构,所以引入负电,结合稳定。于是开始筛选阴离子去污剂,在众多的物质试验中,发现十二烷基硫酸钠(SDS)具有很好的效果。SDS通常与蛋白质以1.4:1的重量比结合,所引入净电 荷量约为蛋白质本身静电荷 10倍的静电荷,从而形成具有均一电荷密度和相同荷质比的SDS-蛋白质复合物,该复合物所带的电荷远远超过蛋白质原有的净电荷,从而消除或大大降低不同蛋白质之间所带净电荷

聚丙烯酰胺

阴离子聚丙烯酰胺(PAMA)根据不同用途和用户对产品性能的要求可选用不同分子量使用,可用作:1、工业废水处理;2、饮用水处理;3、淀粉厂及酒精厂的流失淀粉及洒槽的回收;4、三次采油的驱油剂;5、调剖堵水剂;6、造纸助剂阳离子聚丙烯酰胺(PAMC)是由乙烯基阳离子单体和丙烯酰胺共聚而成,是一种线型高分子聚合物,可用于:1、污泥脱水;2、生活污水和有机废水的处理;3、自来水厂的高效絮凝剂;4、造纸增强剂;5、油田化学助剂 非离子聚丙烯酰胺(PAMN)是由丙烯酰胺均聚而成,纯度高,离子化成度低,性能好,用途广。可用作:1、各种改性聚丙烯酰胺的基础原料;2、纺织工业助剂; 3、污水处理剂; 4、堤坝、地基、隧道等堵水的化学灌浆剂; 5、固沙剂; 6、土壤改良剂; 7、油田调剖堵水剂; 8、建筑业、建筑胶水,内墙涂料等方面。 两性离子聚丙烯酰胺(PAMCA)是由乙烯酰胺和乙烯基阳离子单体丙烯酰胺单 体水解共聚而成、经红外光谱分析,该产品链结上不但有丙烯酰胺水解后的“羧基阴电荷,而且还有乙烯基阳电荷。”因此,构成了分子链上既有阳电荷,又有阴电荷的两性离子不规则聚合物。可用作:1、调剖堵水剂;2、最新型水处理剂;3、污泥脱水剂;4、造纸化学助剂

聚丙烯酰胺简称PAM,亦称三号凝聚剂,分子式为,是线状水溶性高分子聚合物,分子量在 300-1800万之间,外观为白色粉末状或无色粘稠胶体状,无臭、中性、溶于水,温度超过120℃时易分解。 聚丙烯酰胺分子中具有阳性基因(-CONH2),能于分散于溶液中的悬浮粒子吸咐和架桥,有着极强的絮凝作用,因此广泛用于水处理及电力、采矿、选煤、石棉制品、石油化工、造纸、纺织、制糖、医药、环保等。 名称分子量(万) 离子度(%) 高效PH 固含量% 残单% 外观 阳离子聚丙烯酰胺 CPAM 300-1200 10-50 1-14 ≥90 0.05 白色干粉 名称分子量(万) 水解度(%) 高效PH 固含量% 残单% 外观 阴离子聚丙烯酰胺 APAM 300-1800 10-50 7-14 ≥90 0.05-0.15 白色颗粒粉末 名称分子量(万) 离子度(%) 高效PH 固含量% 残单% 外观 非离子聚丙烯酰胺 NPAM 200-600 ≤3 1-8 ≥90 ≤0.05 白色颗粒粉末 名称分子量(万) 阳离子度% 阴离子度% PH 固含量% 外观 两性离子聚丙烯酰胺 NPAM 1000-6000 5-50 8-25 1-14 ≥90 白色粉末 1.阴离子:结构式〔 CH2 CH 〕n CONH2 非离子:结构式:[—CH—CH2—CH—CH2—]n CONH2 CONH2 阳离子:结构式:[—CH—CH2—CH—CH2]n CONH2 CONHCH2N(CH3)2 2.物理特性;本产品为胶体和粉剂。胶体产品为无色透明、无毒性、无腐蚀。粉剂为白色粒状或细粉末状固体,两者均能溶于水。吸水速度随衍生物离子特性的区别而不同。但几乎不溶于一般溶剂(苯、甲苯、乙醇、乙醚、丙酮、酯类等),仅在乙二醇、甘油、冰醋酸、甲酰胺、乳酸、丙烯酸等溶剂中能溶解1%左右。不同品种,不同分子量的产品有不同的性质。 3.用途:主要用于采油、制糖、洗煤、选矿、造纸、涂料、湿法冶金,纺织、石料切割、化工、农药、医药以及污水处理等等。胶体及粉剂聚丙烯酰胺可根据用户提供的产品质量要求生产含量、分子量、水解度各异的产品。 PAM絮凝剂由于应用范围十分广泛,而各种应用对其所要求的性能各不相同,为满足各类用途的需要,世界各国研制了非常复杂的品种和规格,现已形成了

高等生化实验报告:蛋白质分子量的测定

实验一蛋白质分子量的测定—凝胶层析法 一、原理 凝胶层析法也称分子筛层析法,是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时,其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。 凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质,每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致,像筛子,小的分子可以进入凝胶网孔,而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时,这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动,流程短,移动速率快,先被洗出层析柱;而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部,然后再扩散出来,故流程长,移动速度慢,最后被洗出层析柱,从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质,则居二者之间从柱中流出。总之,各种不同相对分子质量的蛋白质分子,最终由于它们被排阻和扩散的程度不同,在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同,从而彼此可以分离开来。 将凝胶装在柱后,柱床体积称为“总体积”,以Vt表示。实质上Vt是由Vo,Vi与Vg三部分组成,Vo称为“孔隙体积”或“外水体

积”,即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积,相应于一般层析法中柱内流动相的体积;Vi为内体积,即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg为凝胶本身的体积。洗脱体积(Ve)与Vo与Vi之间的关系可用下式表示:Ve=Vo+KdVi。 式中Ve为洗脱体积,自加入样品时算起,到组分最大浓度(峰)出现时所流出的体积;Kd为样品组分在二相间的分配系数,也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关,而与柱的长度粗细无关,也就是说它对每一物质为常数,与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得,上式可以改写为:Kd=(Ve-Vo)/Vi。 上式中Ve为实际测得的洗脱体积;Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液(最好是有颜色以便于观察,如血红蛋白,印度黑墨水,分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等)通过实际测量求得;Vi可由g×Wr求得(g为干胶重量,单位为克;Wr为凝胶的“吸水量”,以毫升每克表示)。因此,对一层析柱胶床来说,只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积就可算出它的Kd值。 如果假定蛋白质分子近于球形,同时没有显著的水合作用,则不同大小分子量的蛋白质,在洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量的关系。在一根凝胶柱中,凝胶颗粒间空隙所含水相体积为外水体积Vo,不能进入凝胶孔径的那些大分子,当洗脱体积为Vo 时,出现洗脱峰。 凝胶颗粒内部孔穴的总体积为内水体积Vi,能全部渗入凝胶的那

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