DNA分子标记在雌雄异株植物性别鉴定中的应用

DNA分子标记在雌雄异株植物性别鉴定中的应用
DNA分子标记在雌雄异株植物性别鉴定中的应用

植物杂交种鉴定的方法综述

Open Journal of Nature Science 自然科学, 2018, 6(3), 170-173 Published Online May 2018 in Hans. https://www.360docs.net/doc/665493977.html,/journal/ojns https://https://www.360docs.net/doc/665493977.html,/10.12677/ojns.2018.63026 A Review of Methods in Plant Hybrids Identification Zhie Liu College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan Hubei Received: May 4th, 2018; accepted: May 22nd, 2018; published: May 29th, 2018 Abstract Hybridization is extremely prone to occur in nature, especially in the plant kingdom, which plays an important role in shaping the diversity of plants. Therefore, it is extremely significant to select suitable methods for identifying hybrids, and to have a certain understanding of the formation of hybrids and the conservation of species, which has an essential guiding significance. This article summarizes two methods of morphological identification and molecular marker aiming to provide reference for follow-up research. Keywords Hybridization, Identification, Methods, Review 植物杂交种鉴定的方法综述 刘志娥 武汉大学生命科学学院,湖北武汉 收稿日期:2018年5月4日;录用日期:2018年5月22日;发布日期:2018年5月29日 摘要 杂交在自然界极易发生,尤其在植物界,其在塑造植物的多样性中具有重要作用,因而选择合适的方法鉴定植物杂交种显得极其重要,对了解杂交的形成及在物种保育上具有一定的指导意义。本文简要综述了形态鉴定和分子标记两种鉴定方法,以期为后续研究提供借鉴。

分子标记技术综述

分子标记技术及其在植物药材亲缘关系鉴定中的应用 分子标记技术 分子标记(Molecular Markers)是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记,是DNA水平遗传多态性的直接反映[1]。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比,DNA分子标记具有极大的优越性:大多数分子标记为共显性,对隐性性状的选择十分便利;基因组变异极其丰富,分子标记的数量几乎是无限的;在生物发育的不同阶段,不同组织的DNA都可用于标记分析;分子标记揭示来自DNA的变异;表现为中性,不影响目标性状的表达,与不良性状无连锁;检测手段简单、迅速[2]。 技术种类及原理 分子标记技术自诞生起已研究出数十种,尽管方法差异显著,但都具有一个共同点,即用到了分子杂交、聚合酶链式反应(PCR)、电泳等检测手段。应用较为广泛的技术有以下几种: 1.限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphisms,RFLP) RFLP是最早开发的分子标记技术,指基因型间限制性内切酶位点上的碱基插入、缺失、重排或突变引起的,是由Grodzicker等于1974年创立的以DNA-DNA杂交为基础的遗传标记。基本原理是利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA,得到大小不等的DNA片段,所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况[3]。通过凝胶电泳分析这些片段,就形成不同带,然后与克隆DNA探针进行Southern 杂交和放射显影,即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点,可靠性高,不受环境、发育阶段或植物器官的影响。RFLP标记位点数量不受限制,通常可检测到的基因座位数为1—4个,标记结果稳定,重复性好。RFLP技术也存在一些缺陷,主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难;另外,RFLP分析工作量大,成本高,使用DNA量大,使用放射性同位素和核酸杂交技术,不易自动化,尽管结合PCR技术,RFLP仍在应用,但已不再是主流分子标记。 2.随机扩增多态性DNA(Random Amplification Polymorphism,RAPD) RAPD技术是1990年由William和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法,其基本原理是利用随机引物(一般为8—10bp)通过PCR反应非定点扩增DNA片段,然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同,但对任一特定引物,它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点,一旦基因组在这些区域发生DNA片段插人、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化,从而导致扩增产物数量和大小发生改变,表现出多态性[4]。就单一引物而言,其只能检测基因组特定区域DNA多态性,但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组,因此,RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测,也可用于构建基因组指纹图谱。 与RFLP技术相比,RAPD技术操作简便快速,省时省力,DNA用量少,同时无需设计特定的引物,扩增产物具有丰富的多态性。但RAPD也存在一些缺点:(1)RAPD标记是一个显

植物病毒分子检测方法概述

植物病毒分子检测方法概述 邵碧英 (福建出入境检验检疫局 福州 350001) 植物病毒粒体主要由核酸和蛋白外壳构成,蛋白外壳由许多外壳蛋白(CP)组成。 CP和核酸因病毒的不同而异,是检测、鉴定植物病毒的主要依据。广义的植物病毒分子检测方法包括蛋白质检测(或血清学试验)和核酸检测方法,本文分别介绍。 1 以病毒外壳蛋白为基础的检测方法 植物病毒的CP具有抗原性,很多病毒可以被提纯并制备成高效价的抗血清,根据特异性的抗原抗体反应可检测植物病毒的存在。血清学方法有很多,应用较广泛的是酶联免疫吸附反应,在此基础上加以改进也发展了一些新的检测方法。 111 酶联免疫吸附反应(EL ISA) EL ISA是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板)吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法。酶标抗体(或抗抗体)与相应抗原反应时形成酶标记的免疫复合物,酶遇到相应的底物时产生颜色反应,颜色深浅与抗原量正相关。该方法已被用于各种植物病毒检测。 后来发展的用酶标A蛋白取代酶标抗抗体的EL ISA被称为A蛋白酶联吸附法(SPA-EL ISA)。几种植物病毒的SPA-EL ISA诊断试剂盒已被研制成功[1]。 EL ISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测。 112 斑点免疫吸附法 20世纪80年代发展的以硝酸纤维素膜(NCM)为固相载体的酶联免疫吸附试验—斑点免疫吸附法,检测原理类似于EL ISA,但酶与底物反应产生不溶性产物,在NCM 上形成有色斑点,斑点颜色深浅与抗原的量成正比。也已用于各种病毒检测。 斑点法简便,反应时间短,反应结果可长期保存,不需任何特殊设备,也适合于大量样品的测定。 113 直接组织斑免疫测定法(IDD TB)与EL ISA相比,斑点法更为简便,但仍然需要提取病毒的粗提液或提纯制剂,试验过程较繁琐。改进后的直接组织斑免疫测定是直接把植物组织切块固定于膜上,然后利用抗原抗体特异反应来检测植物病毒。 鞠振林等[2]以IDD TB检测病组织中的马铃薯X病毒Potato virus X等多种病毒获得较好结果。徐明全等[3]采用IDD TB法从兰花叶片中检测到建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus。把石斛兰叶片从叶尖至叶尾每0.5cm切割1次并压印在膜上,检测结果可直接显示出感染病毒的具体部位。 组织印迹法明显比EL ISA和DIBA的试验程序简单、快速。但病毒在植物的不同部位分布不均匀,同一样品要重复多次,以提高检测的准确性。 114 电印迹免疫分析(EBLA) 电印迹免疫分析方法首先用SDS2PA GE 分离病毒CP,把蛋白带转移到膜上,再进行抗原杭体反应,根据CP分子量和吸附特异性抗血清的特殊带来判断该病毒的存在与否。 EBLA和EL ISA、DIBA相比具有明显的优点,通过电泳将植物病毒的CP和植物组织中的其它蛋白分离开来,排除了杂蛋白的干扰,可检测低浓度的植物病毒。此方法 — 7 7 3 —

DNA分子标记技术及其应用

DNA分子标记技术及其应用 摘要:分子遗传标记是近年来现代遗传学发展较快的领域之一。本文系统阐述了DNA分子标记的概念,以及RFLP、RAPD、ALFP、STS、SSR和SNP为代表的分子标记技术的原理和主要方法,并简单介绍了DNA分子标记技术的应用。最后探讨了其进展以及存在的一些问题。 关键词:分子标记;应用 分子遗传标记技术作为一种新的分子标记技术,在分子生物学特别是在分子遗传学的研究中得到了广泛的应用和发展,其所构建的遗传图谱具有高度的特异性。与其它遗传标记相比较,DNA分子标记具有诸多优点,如:遗传稳定,多态性高,多为共显性,数量丰富,遍及整个基因组,操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面,成为分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一。 1DNA分子标记的概念 遗传标记是基因型特殊的易于识别的表现形式,在遗传学的建立和发展过程中起着重要作用。从遗传学的建立到现在,遗传标记的发展主要经历了4个阶段,表现出了4种类型:1形态标记(Morphological Markers),指生物的外部特征特性,包括质量性状作遗传标记和数量性状作遗传标记;2细胞标记(Cytological Markers),主要指染色体组型和带型;3生化标记(Biochemical Markers),指生物的生化特征特性,主要包括同工酶和贮藏蛋白两种标记;4DNA分子标记(Molecular Markers)是以生物大分子(主要是遗传物质DNA)的多态性为基础的一种遗传标记。前3种标记是对基因的间接反映,而DNA分子标记是DNA水平遗传变异的直接反映。与其它遗传标记相比较,DNA分子标记具有诸多优点,如:遗传稳定,多态性高,多为共显性,数量丰富,遍及整个基因组,操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面。目前,被广泛应用的DNA分子标记主要有RFLP(限制性片段长度多态性)、RAPD(随机扩增多态性DNA)、ALFP(扩增片段长度多态性)、STS(序列标记位点)、SSR(简单重复序列)和SNP(单核苷酸多态性)等。 2分子遗传标记技术的种类 2.1RFL P标记 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制性片段长度多态性)标记,是人类遗传学家Botstein等于1980年提出的,是以Southern杂交为核心的第一代分子标记技术。它是用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后,用印迹转移杂交的方法检测同源序列酶切片段在长度上的差异。这种差异是由于变异的产生或是由于单个碱基的突变所导致的限制性位点增加或消失,或是由于DNA序列发生 插入、缺失、倒位、易位等变化所引起的结构重排所致。其差异的检测是利用标记的同源序列DNA片段作探针进行分子杂交,再通过放射自显影(或非同位素技术)实现的。 与传统的遗传标记相比,RFL P标记具有下列优点: (1)RF LP标记无表型效应,其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响;

分子标记技术的类型原理及应用

分子标记 1.分子标记技术及其定义 1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。 2.分子标记技术的类型 分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。 2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术 (1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记; (2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。 2.2 以重复序列为基础的分子标记技术 (1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA; (2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA; (3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。 2.3 以PCR为基础的分子标记技术 (1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA; (2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性; (3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性; (4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性; (5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性; (6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域; (7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。 2.4以mRNA为基础的分子标记技术

分子标记与植物遗传改良

第6讲分子标记与植物遗传改良 一、分子标记在植物遗传研究中的应用p1 二、分子标记在植物育种中的应用p4 三、DNA分子标记的原理p11 四、质量性状的分子标记p25 (p1-14, p15-32) 一、分子标记在植物遗传研究中的应用 分子标记是指一类在分子水平(多为DNA)上的具有多态性的遗传标记。1980年RFLP 作为新型遗传标记首次被提出,开创了直接应用DNA变异的新阶段。分子标记技术多种多样,各具特点,在实际中应根据需要和条件来选用。从植物遗传改良的角度来看,技术难度较小、使用成本较低且准确度又较高的分子标记将更易于为人们所接受。总之,随着多种类型分子标记的发展,分子标记技术将在植物遗传研究中得到越来越广泛的应用。 (一)分子标记连锁图的构建 近年来,农作物基因组和分子生物学研究取得了巨大进展,构建了许多高密度的分子标记连锁图。 早在1988年,美国Cornell大学即用一个50株的籼粳亚种间F2群体(IR34583/Bulu Dalum)构建了第1张水稻RFLP连锁图。 1994年底,Cornell大学和日本水稻基因组研究组(RGP)同时发表了各自构建的高密度水稻分子标记连锁图。前者的作图群体为113株的野-栽回交群体(Oryza sativa/ O. longistaminata// O. sativa)。图谱全长1491cM,共含726个分子标记,其中多为基因组DNA 克隆,标记间平均距离2cM。后者是利用186株籼粳亚种间F2群体构建而成,全长1575cM,共含1383个分子标记,其中cDNA克隆883个,基因组DNA克隆265个,RAPD标记147个。(基因的遗传距离以图距为单位,1个图距单位相当于1%的重组率。cM:一种度量重组概率的单位。在生殖细胞形成的减数分裂过程中,常常会发生同源染色体之间的交叉现象,如果两个标记之间发生交叉重组的概率为1%,那么它们之间的距离就定义为1cM。对人类基因组,1cM大致相当于1Mbp。水稻基因组的大小估计为430Mb,是禾谷类作物基因组中最小的,大约为人基因组大小的1/7,)为了使两张图能相互参照,信息通用,华中农业大学从两张图中选出了400多个RFLP

分子标记在药用植物资源鉴定中的应用

论文成绩 2014 — 2015年度学年论文题目:分子标记在药用植物资源鉴定中的应用学生姓名:郭孟齐 学号: 1212402006 系部:生命科学 专业:生物科学 指导教师:赵丽娟 2014年9月25日

分子标记在药用植物资源鉴定中的应用 郭孟齐 1212402006 摘要:目前在研究药用植物资源鉴定的技术手段中,分子标记技术应用的愈来愈多。而分子标记又分为很多种技术,如RFLP、RAPD、SRAP、AFLP等。本文就这几种分子技术在药用植物资源鉴定中的应用进行了探讨,发现RAPD技术占有独特的优势,而RFLP、AFLP等技术由于种种因素的限制,应用的范围很有限,SRAP技术作为一种新型的分子标记技术,正在药用植物资源鉴定中发挥着越来越重要的作用。 关键词:分子标记,药用植物,鉴定 Application of molecular markers in identificating medicinal plant resources Abstract:At present ,in the technology of identificating medicinal plant resources , applicating of molecular marker technology is becoming more and more popular. Molecular marker is divided into many kinds of technologies, such as RFLP, RAPD, SRAP, AFLP etc. In this paper, application of this technology in the identification of several molecular medicinal plant resources are discussed.And it found that RAPD technology occupies a unique advantage while RFLP, AFLP and other technical are limited due to various factors. SRAP technology as a new molecular marker technique is playing a more and more important role in medicinal plant resources of identification. Key Words: Molecular markers, Medicinal plant,Identification

DNA分子标记及其优缺点

DNA分子标记种类及相应的优缺点 摘要: 对RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR 等常用的DNA 分子标记技术以及其他几种新兴的标记技术( SNP、EST 等) 的原理、特点进行了综述,并对各自的优缺点进行了探讨。 关键词:DNA分子标记优缺点 分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。 ②不受环境影响。因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。③标记数量多,遍及整个基因组。④多态性高,自然存在许多等位变异。⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。 1. 1 第1 代分子标记 1.1. 1 RFLP 标记技术。1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术 。RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。 优点:RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适应于构建遗传连锁图。 缺点:在进行RFLP 分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核酸杂交技术,既不安全又不易自动化。另外,RFLP 对DNA 多态性检出的灵敏度不高,RFLP 连锁图上还有很多大的空间区。 1.1. 2 RAPD 标记技术。为了克服RFLP 技术上的缺点,Williams

分子标记在植物遗传育种中的应用

分子标记在植物遗传育种中的应用 E M摘要N: 分子标记是继形态标记O细胞标记和生化标记之后发展起来的一种新的较为理想的遗传标记F已被广泛地应用于生命科学研究的各个领域P在植物遗传育种中F分子标记主要用于基因组图谱构建O基因定位O辅助标记选择O种质资源评价O基因克隆O杂种优势预测O杂交育种及跟踪育种过程等方面P文章主要介绍了分子标记在植物遗传育种中的应用原理及分析方法F并对其应用前景进行了展望PM关键词N 分子标记K植物遗传育种K遗传标记 优良品种是当今农业经济发展的基础资源F对目标性状#如丰产O优质O抗逆等$的选择是新品种选育过程的中心环节P 传统的育种方法主要是根据植物在田间的表现进行评价和选择P 但由于表型性状不仅取决于遗传组成F也受控于环境条件F有时环境条件的影响可遮盖植株在基因型上的差异F因此仅根据表型进行选择F效果不够理想P特别是对受多基因控制的数量性状的选择F更难做到准确P虽然育种学已建立了一套完整的选择程序F并在农业生产上培育出了许多高产O优质O抗逆的新品种F然而传统的育种方法仍存在周期长O预见性差O工作量大O工作效率低等问题P随着遗传学的发展F人们注意到利用易于鉴别的遗传标记 #R6=6398SA0T607$来进行辅助选择F可提高选择效果P遗传标记已逐渐成为植物遗传育种的重要工具P尤其是分子遗传学的发展及分子标记技术的建立F使作物遗传育种进入了一个新阶段P新

技术与传统方法相结合F有可能解决目前育种中一些重要环节上的主要难题F从而大大加速育种工作进程P分子标记已在遗传图谱的构建O辅助标记选择O基因克隆等方面显示出了非常诱人的前景P - 应用分子标记构建基因组图谱 基因组图谱是遗传研究的重要内容F又是种质资源O育种及基因克隆等许多应用研究的理论依据和基础P因此F基因组图谱已成为当今生命科学的重要研究领域P基因组图谱包括以染色体重组交换为基础的遗传图谱#R6=6398SA+$和以U2? 的核苷酸序列为基础的物理图谱#V4W798A’SA+$P数十年来F许多遗传学家利用形态标记O生化标记和传统的细胞遗传学方法F为构建各种主要作物的遗传图谱进行了大量工作F并取得了一定的进展P但是由于形态标记和生化标记数目少F特殊遗传材料培育困难及细胞学工作量大F因而除极少数作物#如玉米O番茄$外F在分子标记出现之前F大多数作物还没有一个较为完整的遗传连锁图F极大地限制了遗传学理论研究和应用研究的进展P 进入.,年代以来F分子标记的迅速发展F大大促进了遗传连锁图的构建P目前主要农作物O果树O蔬菜等的XCYV7OX?VU7遗传图谱已相继建立M-ZINP利用分子标记构建遗传图谱的理论基础是染色体的交换与重组P 两点测验和三点测验是其基本程序P由于作图群体的不断增大和标记数量的日益扩增F如今的遗传图谱构建已不得不计算机化了P 遗传图谱构建过程主要包括[-$选择和建立适合的作图群体

植物组织DNA的提取和鉴定

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 实验目的 1.通过实验学习并掌握用CTAB来提取DNA的方法。 2.了解CTAB的成分及作用。 3.学习PCR的原理并掌握其方法。 4.学习琼脂糖凝胶电泳的原理与方法。 实验原理 植物组织中绝大部分是核DNA,它和组蛋白、非组蛋白结合在一起,以核蛋白(即染色质或染色体)的形式存在于细胞核内。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵,简称CTAB):是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的,当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3mol/L NaCl)时从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开,然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中,再加入乙醇使核酸沉淀,CTAB能溶解于乙醇中。DNA是遗传信息的载体和基本遗传物质,它在遗传变异、代谢调控等方面起着重要作用,是分子生物学和基因工程研究的对象,但无论是研究植物DNA的结构和功能,还是开展外源DNA的转化、转导的研究,首先要做的就是从植物组织中提取天然状态的高分子量的纯化DNA。 T-DNA,转移DNA(transferred DNA ),是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA 序列,可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区,借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合,获得转基因植株。除用于转基因以外,T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活,从而产生基因敲除突变体;T-DNA大多为单拷贝插入,使其利于进行遗传分析。 PCR基本原理: 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR,是一种分子生物学技术,用于在体外快速扩增DNA,具有类似细胞内DNA的复制过程:由一对

分子标记技术原理、方法及应用

分子标记技术原理、方法及应用 一、遗传标记的类型及发展 遗传标记(genetic marker):指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征,即可遗传性和可识别性;因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。包括形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记四种类型。 形态学标记:主要包括肉眼可见的外部形态特征,如:矮秆、紫鞘、卷叶等;也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。优点: 形态学标记简单直观、经济方便。缺点: (1)数量在多数植物中是很有限的; (2) 多态性较差,表现易受环境影响; (3)有一些标记与不良性状连锁; (4)形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程,周期较长 细胞学标记:植物细胞染色体的变异:包括染色体核型(染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等)和带型(C带、N带、G带等)的变化。优点: 能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。缺点: (1)材料需要花费较大的人力和较长时间来培育,难度很大; (2) 有些变异难以用细胞学方法进行检测 生化标记:主要包括同工酶和等位酶标记。分析方法是从组织蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。优点: 直接反映了基因产物差异,受环境影响较小。缺点: (1)目前可使用的生化标记数量还相当有限; (2)有些酶的染色方

法和电泳技术有一定难度 分子标记:主要指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段,它直接反映基因组DNA间的差异,也叫DNA标记。 (1)数量多,高多态性,信息量大(2)与生长发育无关,取材不受限制(3)能明确辨别等位基因(4)均匀分布于整个基因组(5)选择中性,不影响目标性状的表达(6)检测手段简单、快速(7)成本低廉(8)稳定,重复性好(9)共显性遗传 在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经发展了很多种,一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为三大类: 第一类是以分子杂交为核心的分子标记,包括RFLP、DNA指纹技术等,这类分子标记被称为第一代分子标记; 第二类是以PCR为核心的分子标记,包括随机扩增多态性RAPD、简单序列重复SSR、扩增片段长度多态性AFLP、序列标签位点STS等,为第二代分子标记; 第三类是一些新型的分子标记,如:SNP标记、表达序列标签EST 标记等,也以PCR技术为基础,为第三代分子标记。 几种主要的DNA分子标记

几种常用植物病原细菌分子检测方法

专论与综述 R evie ws 收稿日期: 20060220 修订日期: 20060418 基金项目: 国家自然科学基金项目(39970481);国家“863”计划项目(2001AA249021)3通讯作者E 2mail :jhguo @https://www.360docs.net/doc/665493977.html, 几种常用植物病原细菌分子检测方法 尹燕妮, 黄艳霞, 葛芸英, 郭坚华3 (南京农业大学农业部病虫监测与治理重点开放实验室,南京 210095) 摘要 植物病原细菌(phytobacteria )是植物上一类重要的病原菌,这些细菌能引起多种农作物、经济作物、花卉、树木及牧草上的病害。它的快速检测是病害防治、预测预报及植物检疫必不可少的重要工作。其中,以PCR 为基础的分子检测技术的进步使植物病原细菌的检测更快速、灵敏和可靠。本文对近年来植物病原细菌分子检测技术进行介绍,尤其是应用广泛的ITS 2PCR (intergenic transcribed space 2PCR )、ARDRA (amplified ribosomal DNA restric 2 tion analysis 2PCR )、rep 2PCR (repetitive DNA 2PCR )和实时荧光定量PCR (real 2time quantitative PCR )技术,旨在促 进我国植物病原细菌研究的快速发展。关键词 植物病原细菌; 分子检测; PCR 中图分类号 S 432.42 Molecular diagnostic techniques for several commonly used phytobacteria Y in Yanni , Huang Yanxia , Ge Yunying , Guo Jianhua (Key L aboratory of Monitoring and M anagement of Plant Diseases and Pests ,M inist ry of A g riculture ,N anj ing A g ricultural Universit y ,N anj ing 210095,Chi na ) Abstract Phytobacteria are widespread and economically important plant pathogens.These bacteria cause severe diseases on many important plants such as field crop s ,economically important crops ,flowers ,trees ,and pasture.Rapid detection of phytobacteria provides a better f ramework for addressing important plant disease problems related to diagnosis and prediction of diseases ,and ultimate management of disease risks.The technology 2driven advances in PCR 2based methods make the detection of bacterial pathogens more rapid ,sensitive and reliable.In this paper ,the molecular diagnostic techniques were introduced ,especially ITS 2PCR ,ARDRA ,rep 2PCR and real 2time quantitative PCR techniques.It was aimed to promote the research of phytobacteria in China.K ey w ords plant pathogenic bacteria ; molecular detection ; PCR 传统病原细菌检测方法主要是依据症状、形态、生理生化反应和血清学等方法。这些方法耗时费力,且稳定性不高,不能直接从植物组织中检测出病原细菌。20世纪80年代基于细菌染色体分子检测方法的出现,尤其是PCR 方法的诞生及计算机辅助分析,使细菌的快速检测成为可能。细菌的分子检测方法大致可以分为非依赖PCR 及依赖PCR 两大类。非依赖PCR 的方法有两种,一种是全基因组DNA 2DNA 同源性比较或复性动力学,该方法较粗 略,现在一般不采用;另一种是限制性片段长度多态性(rest riction f ragment lengt h polymorp hism ,RFL P )分析,该技术存在操作繁琐、放射污染等缺 点,且细菌基因组较真核生物小,酶切后多态性不丰富,所以该方法一般不单独使用。PCR 是一种体外扩增核酸序列从而得到多个核酸拷贝的技术,以下主要介绍依赖PCR 的几种常用的检测方法。 1 ITS 2PCR ITS 2PCR 分析是利用保守的16S rDNA 和23S rDNA 序列,设计引物扩增转录间隔区(ITS )。16S rDNA 和23S rDNA 间的ITS 区域包括一些t RNA 基因和非编码区域。由于面临较小选择压力,ITS 区域比16S rDNA 和23S rDNA 的多态性丰富。使用通用引物扩增ITS 区域后,通过产生带的长度可

植物系统学研究中常用基因分子标记特点分析

植物系统学研究中常用基因分子标记特点分析史全良 吴均章(苏州大学水产学院生物系江苏苏州215151) 摘要 阐述了目前常用于植物系统学和进化研究的一些常用的DNA分子标记技术,分析了各自的使用范围和应用特点,提出在使用这些分子标记来研究分子系统学时必须注意的问题。 关键词 植物系统学 进化 分子标记 过去研究植物系统分类和演化的方法是在群体的整体水平上,以物种的形态特征特别是生殖系统的形态特征及繁殖方式、代谢物种类,结合古生物学、植物地理学、统计学等进行研究。随着现代生物技术迅速发展,80年代开始利用DNA分子标记技术研究植物系统学,形成了植物学研究的一个新的热点——植物分子系统学。现就目前国内外常用的基因标记种类及各自的特点做简要介绍。 1 RAPD标记 由W illiam s等首先于1990年用随机核苷酸序列作引物扩增基因组DNA以来,由于引物的随机性、对模板DNA要求较低、操作相对简便和多态性高等,RA PD(R andom Am p lified Po lym o rp h is m ic DNA)技术在植物系统学研究中已广泛地被使用。 随着RA PD技术的广泛应用,其局限性也相继被发现。T ho rm ann等(1994年)在十字花科植物的研究中,比较了R FL P和RA PD标记分别在种内和种间得出的结果,发现R FL P和RA PD标记在种内水平的结果完全吻合,但在种以上等级的结果相差甚远。他们将RA PD产物标记作探针,杂交结果表明,与探针片段迁移率一致的带有时并不同源,这种情况仅发生在种间。Sm ith等(1994年)在单胞杆菌的研究中也得出这一结论,并发现由于引物的竞争等,基因组中RA PD位点有时不能全部检测出,造成差异假象。汪小全等(1996年)探讨了RA PD应用于遗传多样性和系统学研究中的问题,认为RA PD方法可以应用于种间乃至边缘属之间亲缘关系的研究,但有一定的局限性。因不同种或属的扩增产物难以作其同源性分析,只能作表征分析,从而只能从相似性或遗传距离上分析亲缘关系,其结果可能与真实的系统关系相左。此外还因RA PD在种间或属的变异水平很高,取样代表性是一个值得重视的问题,即用1个个体代表1个种或用1个种代表1个属都可能造成结果的极大偏差。RA PD标记的这些特点大大限制了在较高分类阶元等级的应用。 2 ITS序列分析 核rDNA的内转录间隔区(In ternal T ran2 scribed Sp acer IT S)包含被5.8s rDNA所分隔的IT S1和IT S2两个片段 。如图1。 图1 植物18s~26s r D NA的基本结构 在被子植物中IT S1的长度为187~298bp,IT S2为187~252bp。张文驹等(1998年)对4个供体的普通小麦基因组的IT S1和IT S2及IT S序列分析,得出了唯一的最大简约树,三者拥有相同的分支结构,因此有些作者仅用IT S1或IT S2就能得到合理的结果。IT S序列变异较快,可以提供较丰富的遗传信息,已证实它是研究许多被子植物类群系统与进化的重要分子标记,不仅可以解决科、亚科、族、属、组内的系统发育和分类问题,而且可用于重建多倍体复合体的网状进化关系,探讨异源多倍体的起源过程。IT S之所以成为被子植物系统与进化研究中的重要分子标记,主要基于以下两个方面原因:第一,作为18s~26s rDNA的一个组成部分,IT S在核基因组中是高度重复的, — 4 —生 物 学 通 报 2000年第35卷第12期

实验十二 植物中DNA的提取及鉴定

实验十二植物中DNA的提取及鉴定 一.实验目的 1.学习掌握从植物中提取DNA的方法 2.学习掌握从植物中分离核酸的原理和方法 二.实验原理 Ⅰ植物基因组DNA 的提取(CTAB法) 植物组织中绝大部分是核DNA,它和组蛋白、非组蛋白结合在一起,以核蛋白(即染色质或染色体)的形式存在于细胞核内。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵,hexadecyltrimethylammonium bromide,简称CTAB):是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的,当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3mol/L NaCl)时从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开,然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中,再加入乙醇使核酸沉淀,CTAB能溶解于乙醇中。 在DNA提取过程中必须始终注意以下几个关键问题: (1)DNA的二级结构和双链易受多种因素(如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等)的影响引起双链解开,即“变性”,因此抽提时避免使用变性的条件。(2)抑制内外源DNase的活力。DNase就象一把刀,它能把大分子的DNA切成碎片,所以要加以杜绝,现可以通过多种途径来做到这一点:a、低温操作;b、调节pH,使偏碱(pH8.0); c、抽提液中加表面活性剂; d、加螯合剂(EDTA)除去酶的铺助因子(Mg2+),使酶活性丧失。 (3)防止化学降解。如过酸或过碱以及其它化学因素,会使DNA降解,一般综合考虑,取pH8.0左右为宜。 (4)防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等,DNA分子特别大,其分子量可达1012道尔顿,极易被机械张力拉断,甚至在细管中稍急一些的流动也会使DNA断裂,所以在抽提过程中要特别注意这一点,操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数,也不要剧烈摇动。 (5)植物的次生代谢物(主要是胞质内的多酚类或色素类化合物)对核酸提取有干扰作用。因此,一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取DNA的材料,这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少,DNA含量高,且易于破碎,植物材料最好是新鲜的。 分离提取植物DNA的方法很多,本实验采用CTAB法提取DNA并通过紫外吸收法和电泳鉴定。 三.材料与方法 (1)取200mg样品(在液氮中研磨成粉末状)放入1.5mL离心管中,加入600μL DNA提取液,颠倒混匀5-6次。65℃保温35分钟以上,其间颠倒混匀一次。 (2)再加等体积的氯仿异戊醇(24:1)溶液轻轻摇晃30秒,在4℃下10000rpm/分钟离心10分钟后,取吸上清液(450μL) (3)再加两倍体积的预冷异丙醇,混匀静止10分钟以上,在4℃下10000rpm/分钟离心10分钟后,弃上清。 (4)用600μL70%乙醇洗涤沉淀,重复一次,在室温下倒置晾干。 (5)沉淀用TE溶液溶解DNA,再加入RNase至终浓度50μg/mL,在37℃下保温半小时,将DNA样品放入冰箱保存。

AFLP分子标记技术及其应用

AFLP分子标记技术及其应用 孙晓鹏 (北京师范大学生命科学学院生态学专业) 摘要:扩增片段长度多态性(AFLP,Amplified restriction fragment polymorphism),是1993年荷兰科学家Zabeau和Vos 发展起来的一种检测DNA多态性的分子标记技术。文章主要讲述该技术的原理、流程及特点,并从以下三个方面讲述该技术的应用情况:动物学方面,讲述其在动物遗传学,动物系统学,性别鉴定与繁殖行为研究上的应用;植物学方面,讲述其在种质资源鉴定,作物育种上的应用;医学方面,讲述其在肿瘤,遗传病,流行病学方面的进展。文章还分析了AFLP技术的优缺点并展望了其应用前景。 关键词:AFLP,分子标记技术,应用 目前遗传标记主要有4种类型,即形态标记(Morphological Markers)、细胞标记(Cytological Markers)、生化标记(Biochemical Markers)和分子标记(Molecular Markers) [1]。分子标记一般指DNA标记。分子标记依据所用的分子生物学技术,大致分为三大类:(Ⅰ)以电泳技术和分子杂交技术为核心,其代表性技术有RFLP和DNA指纹技术(DNA Fingerprinting) 。(Ⅱ)以电泳技术和PCR技术为核心,其代表性技术有RAPD( Random amplified polymorphism DNA) 、SSLP(Simple sequence length polymorphism ,或称Sequence-tagged microsatellitesite, STMS)和AFLP。(Ⅲ)基于DNA芯片技术的分子标记,即SNP[ 2-4 ]。其中,扩增片段长度多态性(AFLP,Amplified restriction fragment polymorphism),是1993年荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的方法,已获欧洲专利局的发明专利。该技术具有多态性丰富、灵敏度高、稳定性好、可靠性高、不易受环境影响等优点,近年来广泛应用于生命科学各项研究中。 1. AFLP分子标记技术原理、流程及特点 1.1. AFLP分子标记技术原理 AFLP技术是基于PCR反应的一种选择性扩增限制性片段的方法。由于不同物种的基因组DNA大小不同,基因组DNA经限制性内切酶酶切后,产生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板,用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增,选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性,只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检验多态性[5]。Vos等(1995)曾对AFLP的反应原理进行了验证,结果检测到的酶切片段数与预测到的酶切片段数完全一致,充分证明了AFLP技术原理的可靠性。 进行AFLP分析时,一般应用两种限制性内切酶在适宜的缓冲系统中对基因组DNA进行酶切,一种为低频剪切酶,识别位点为六碱基的rare cutter;另一种为高频剪切酶,识别位点为四碱基的frequent cutter。双酶切产生的DNA片段长度一般小于500bp,在AFLP反应中可被优先扩增,扩增产物可被很好地分离,因此一般多采用稀有切点限制性内切酶与多切点限制性内切酶相搭配使用的双酶切。目前常用的两种酶是4个识别位点的Mse I和6个识别位点的EcoR I。

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