翅果油树中生物碱抑菌活性研究

翅果油树叶片中生物碱抑菌活性研究1

邵芬娟，曹志勇，张直峰，薛玲，闫桂琴*

（山西师范大学生命科学学院临汾 041004）

摘要采用酸性乙醇浸提翅果油树叶片中的生物碱，经硅胶柱层析纯化，所得生物碱对7种细菌和3种真菌进行抑菌作用试验。结果表明：翅果油树叶片中生物碱对细菌和真菌均有一定的抑制作用，对青枯菌的抑制作用明显强于对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用；对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和4种青枯菌（OD1、DB1、DC1和M5）的最低抑菌浓度分别为0.016 g/mL、0.032 g/mL、0.016 g/mL、0.016 g/mL、0.032 g/mL、0.016 g/mL和0.016 g/mL；对根霉和青霉表现出较强的抑制作用，而对曲霉的抑制作用较弱。

关键词翅果油树，生物碱，抑菌活性

中图分类号：O629.3

Study on Antimicrobial Activity of the Alkaloids

from Elaeagnus mollis

Shao Fenjuan, Cao Zhiyong, Zhang Zhifeng, XueLing, Yan Guiqin*

(School of Life Science Shanxi Teachers University Linfen 041004)

Abstract: The alkaloids were extracted by immersing in alcohol from the laminae of Elaeagnus mollis, and were purified by column chromatography on silica gel. In the evaluation of antimicrobial activity against various strains of bacteria and fungi, the alkaloids exhibited significant antimicrobial Activity. The antibacterial activity against Pseudomonas solanaceru was more potent than Escherichia coli, Staphyloccus aureus and Bacillus subtilis. The MIC values of Escherichia coli, Staphyloccus aureus, Bacillus subtilis and Pseudomonas solanaceru（OD1、DB1、DC1和M5）were 0.016 g/mL，0.032 g/mL，0.016 g/mL，0.016 g/mL，0.032 g/mL，0.016 g/mLand 0.016 g/mL. In the antifungal activity test, the antifungal activity against Penicillium and Rhizopus were more potent than Aspergillus.

KeyWords Elaeagnus mollis;Alkaloids; Antimicrobial Activity

翅果油树(Elaeagnus.mollis.Diels)又名泽绿旦、柴禾、车勾子等，属胡颓子科胡颓子属，落叶大灌木或小乔木。它是第四纪冰川作用后的孑遗植物之一,已被列为国家二级重点保护植物。翅果油树为我国特有种，仅分布于山西南部和陕西户县。翅果油树不仅是一种具有较高生态效益的木本植物，而且还是一种具有重要经济价值的稀有生物资源，临床试验表明，翅果油树的种子具有软化血管，降血脂、血压，降胆固醇，减少动脉粥样硬化等重要生理功能，经常食用可延年益寿、延缓衰老，还可以美容，对糖尿病有一定的抑制作用[1-2]。而对其叶片中生物碱的抑菌作用报道少见。近年来，人们把热点放在寻找有特殊结构的活性次生代谢物上，希望从天然产物中寻找有杀菌作用的高活性物质。本研究以翅果油树叶片中生物碱为药剂，采用体外抑菌活性试验方法，初步研究了翅果油树总生物碱对细菌和霉菌的抑菌活性。旨在为进一步研究开发其作为植物杀菌、杀虫农药提供依据。

1基金项目：国家自然科学基金项目（30470296）.

作者简介：邵芬娟,女,硕士研究生.E-mail:sfjstar@https://www.360docs.net/doc/687609171.html,.

* 通讯作者：闫桂琴,女,博士,教授,主要从事植物分子生态学研究.E-mail:guiqiny@https://www.360docs.net/doc/687609171.html,.

1 材料与方法

1.1供试材料

1.1.1 植物材料

翅果油树叶采自山西省翼城县甘泉林场，经山西师范大学生命科学学院毕润成教授鉴定；将采集的翅果油叶片洗净，放置于电热鼓风干燥箱中40℃烘干，经研磨粉碎后60目过筛，备用。1.1.2 供试菌种

金黄色葡萄球菌（Staphyloccus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、青霉(Penicillium sp.)、曲霉（Aspergillus niger）、根霉(Rhizopus sp.)和青枯菌(OD1、DB1、DC1和M5)，分别由山西师范大学微生物实验室和生物技术实验室提供。

1.2方法

1.2.1翅果油树叶片中生物碱的提取纯化

将采集的翅果油树叶片烘干、粉碎后称取300g，用80%酸性乙醇，60℃提取3次，每次12h，合并提取液，过滤后减压浓缩至浸膏状；经2%的盐酸溶解，过滤；滤液置于分液漏斗中，用氯仿萃取3次，除去杂质，再加浓氨水调pH至11，正丁醇萃取5次，合并正丁醇相，浓缩，所得固体即生物碱粗品[3]；用甲醇溶解生物碱粗品，通过硅胶柱层析，以氯仿:甲醇:二乙胺（7:4:0.2）为洗脱剂进行洗脱，每50mL作为一个流分，以改良碘化铋钾作为显色剂进行检测，反应呈阳性的合并，浓缩得生物碱，称重，备用。

1.2.2细菌抑制作用的测定

采用琼脂扩散法[4-5]，即将配好的培养基冷却至50℃左右，倒平板，待培养基凝固后，用微量移液器分别吸取0.1mL的菌悬液倒入对应的平板上，涂布均匀，用直径为0.4cm的打孔器在平板中央打孔，然后在孔中注入浓度为0.064 g/mL生物碱液30μl，最后将细菌置于37℃培养16～24ｈ，青枯菌置于28℃培养48h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。最低抑菌浓度（MIC）的测定采用琼脂平板稀释法[6]，即吸取１mL不同浓度的生物碱液分别加入培养皿中，将融化好的琼脂培养基各加14mL于每个培养皿中，摇动培养皿，使其与培养基充分混匀，则最终浓度为 0.0640g/mL、0.032 g/mL、0.016 g/mL、0.008 g/mL和0.004 g/mL，以无菌水和青霉素钠作为对照。将细菌于37℃培养16～24ｈ，青枯菌于28℃培养48h，观察菌体的生长情况。

1.2.3霉菌抑制作用的测定

采用生长速率法[7-8]，即用0. 4cm直径的打孔器在培养好的菌落外缘切下菌饼。将生物碱液稀释成一系列梯度浓度后，准确取1mL的生物碱液加入到培养基中，混合均匀后倒入培养皿内凝

固。用接种针将菌饼移植到培养基上，使菌饼带有菌丝的一面朝下，置于28℃培养48h ，取出培养皿测量菌落直径，每个菌落十字交叉测量2次直径，取平均值。按以下公式计算生长抑制率：

2结果与分析

2.1 翅果油树生物碱对细菌的抑制效果

由表1可看出，翅果油树叶片中生物碱对7种细菌均有不同程度的抑制作用，其中对青枯菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用均强于青霉素钠，差异极显著（p<0.01）；而对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用均低于青霉素钠，差异显著（p<0.05），可见对青枯菌的抑制作用明显强于对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用，差异达到显著水平。

表1：翅果油树叶片中生物碱对细菌的抑菌活性1)

待测物 抑菌圈直径/mm

Ec

Sa

Bs

OD1

DB1

DC1

M5

青霉素钠 16.4±0.24a 13.4±0.56a 7.2±0.65aA

22.5±0.44aA 18.2±0.87aA 24.1±0.32aA 20.3±0.67aA

生物碱

15.3±0.46b 9.90±1.05b 12.0±1.05bB 27.1±0.55bB 23.9±0.15bB 25.6±0.81bB 23.2±0.49bB

水

1) Sa －金黄色葡萄球菌，Ec －大肠杆菌，Bs －枯草芽孢杆菌， OD1、 DB1、 DC1 和M5为青枯菌。 2) 小写字母表示在5%水平的显著性，大写字母表示在1%水平的显著性。

由表2可看出，翅果油树叶片中生物碱对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和4种青枯菌OD1、 DB1、 DC1 和M5的最低抑菌浓度分别为0.016 g/mL ，0.032 g/mL ，0.016 g/mL ，0.016 g/mL ，0.032 g/mL ，0.016 g/mL 和0.016 g/mL 。可见翅果油树叶片中生物碱对细菌具有较强的抑制作用。

表2：翅果油树叶片中的生物碱对细菌的最低抑菌浓度(ｘ＝Σｘi/ｎ，ｎ＝４）

注：－为无菌生长，+ 少量菌生长，++ 较少量菌生长，+++ 大量菌生长。

2.2 翅果油树生物碱对真菌的抑制作用

生物碱浓度

/ g·mL -1 细 菌 生 长 情 况

Bs

Ec

Sa

OD1

DB1

DC1

M5

0.064 － － － － － － － 0.032 － － －

－ －

－ － 0.016 －

－

+ －

+ －

－

0.008 + + ++ + ++ + + 0.004 +++ ++ +++ ++ +++ +++ ++ CK

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

生长抑制率

由表3可看出，翅果油树叶片中生物碱对真菌有不同程度的抑制作用，不同浓度的生物碱对菌种的抑制程度不同，随生物碱浓度的提高，抑制作用明显提高。浓度为0.064 g·mL-1和0.032 g·mL-1的生物碱对根霉的抑制效果差异不明显（p>0.05）；不同浓度的生物碱对曲霉和青霉的抑制效果差异显著（p<0.05）。菌丝生长抑制百分率同浓度呈正相关。以48h菌丝抑制率为标准，翅果油树叶片中生物碱对根霉和青霉表现出较强的抑制作用，而对曲霉的抑制作用较弱，因此翅果油树叶片中生物碱对不同作用的菌种具有较强的选择作用。

表3 不同浓度的生物碱对真菌菌丝生长48h的抑制率

生物碱浓度/ g·mL-1

抑制率(%)

根霉曲霉青霉

0.064 98.0 a 65.6 a 92.9 a

0.032 97.0 a 59.4 b 57.1 b

0.016 96.1 b 43.8 c 42.8 c

0.008 29.0 c 25.0 d 14.2 d

0.004 9.81 d 12.5 e 7.14 e

1) 小写字母表示在5%水平的显著性。

3讨论

本试验结果表明，翅果油树叶片中生物碱在离体条件下对所测定的7种细菌和3种真菌均有很高的抑菌活性，说明翅果油树叶片中生物碱具有广谱抗菌作用，尤其是其对青枯菌的抑制作用明显强于对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，这就预示着翅果油树叶片中生物碱在植物病害防治方面具有潜在的开发利用价值。尤其在我国主要农作物中马铃薯、番茄、烟草、茄子、辣椒、花生、姜、甘薯、木麻黄、桑、油橄榄、聚合草等均受青枯菌的危害，造成不同程度的损失[9]，因此开发翅果油树叶片中生物碱成分具有重要的意义。对于翅果油树叶片中生物碱的抑菌效果，本研究仅限于体外抑菌试验，至于翅果油树叶片中生物碱在大田试验中是否具有良好的防效，其有效成分的作用方式和作用机理以及活性成分的结构尚需进一步研究和探讨。

参考文献

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Alkaloids from the Sponge Spongosorites sp[J]. Biol.Pharm.Bull. 2006，29(3)：570-573.

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