化学发光

化学发光免疫测定（CLIA）技术

化学发光免疫测定（Chemiluminesent Immunoassay,CLIA）是免疫测定技术继酶免技术（EIA）、放免技术（RIA）、荧光免疫技术（FIA）和时间分辨荧光免疫技术（TRFIA）之后发展的一项新兴测定技术。要谈化学发光免疫测定技术就必须先谈化学发光。

化学发光技术是近二、三十年来发展起来的一种测定方式，其利用化学反应释放的自由能激发中间体(常用碱性磷酸酶－金刚烷胺），使其从激发态回到基态，当中间体从激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而进行定量分析。化学发光具有荧光的特异性，同时不需要激发光，就避免了荧光分析中激发光杂散光的影响有很高的灵敏度，并且不象放射分析那样存在强烈的环境污染和健康危害，是一种非常优秀的定量分析方法。

虽然化学发光具备很高的特异性和很小的干扰，但化学分析本身的不特异性，制约了整个方法的使用。因此，如同RIA、FIA等一样利用免疫反应的特异性和化学发光本身的信号特异性形成了目前所说的化学发光免疫测定（CLIA）技术。

CLIA是一种高度敏感的微量测定技术，凡具有抗原性的物质（包括半抗原）都可以用CLIA测定。其起步于80年代初，快速发展于90年代，在国外CLIA的应用处于蓬勃发展的阶段,其具备以下特点

①高度敏感，极限达10-17－10-19M/L，远高于RIA、EIA，与TRFIA相当但比TRFIA便宜。

②特异性强，重复性好C.V.＜5％。

③测定范围宽，可达7个数量级。

④试剂稳定性好，无污染有效期6－12月。

⑤操作简单，易于自动化。

在对环保很重视的国家，CLIA成了取代RIA的首选方法。

电化学发光分析技术特点

最先进的分析原理

专利的电化学发光分析技术（ECL）。ECL是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应。包括了两个过程。发光底物二价的三联吡啶钌及反应参与物三丙胺在电极表面失去电子而被氧化。氧化的三丙胺失去一个H成为强还原剂，将氧化型的三价钌还原成激发态的二价钌，随即释放光子恢复为基态的发光底物。

最好的发光标记物-三联吡啶钌

分子量小，结构简单。可以标记于抗原，抗体，核酸等各种分子量，分子结构的物质。从而具有最齐全的检测菜单。三联吡啶钌为水溶性，且高度稳定的小分子物质。保证电化学发光反应的高效和稳定，而且避免了本底噪声干扰。

最先进的包被技术

采用罗氏公司专利的链霉亲和素-生物素包被技术。链霉亲和素-生物素是最牢固和特异的结合。保证了牢固的包被效果和特异的检测结果。

特殊的磁性微粒子载体以及磁性分离技术

由聚苯乙烯包被的磁性微粒子为载体，直径仅为2.8um。同类型产品最小；

提供类均相的反应环境，增加反应面积，提高反应速度；

保证最终检测结果的高灵敏度；

利用磁性分离技术，实现全自动化分析；

与其它几种标记免疫测定技术相比，电化学发光具有以下的优点：

1. 高灵敏度，检测下限达1pmol；

2. 线形范围宽，达7个数量级；

3. 快速，出第一个结果的时间仅需数分钟；

4. 应用范围广，可以同样的灵敏度和线性范围检测各种物质，包括DNA；

5. 试剂稳定，无污染和衰变问题；

6. 自动化程度高。

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概述

化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay,CLIA）是将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。这种方法不仅具有化学发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性,而且还具有分离简便特点,可以实现自动化分析,使之成为医学、生物学研究领域中一种新的重要的免疫学分析手段。

发光与化学发光剂

1〃发光

一种物质由电子激发态回复到基态时，释放出的能量表现为光的发射，称为发光(luminescence)。根据形成激发态分子的激发能可将发光分为三种类型:光照发光、生物发光和化学发光。

1光照发光(photoluminescence) 发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。

2）生物发光(bioluminescence) 典型例子为萤火虫发光。反应底物为萤火虫荧光素(firefly luciferin)，在荧光素酶(luciferase)的催化下利用ATP产能，生成激发态的氧化荧光素(oxyluciferin)，后者在回复到基态时多余的能量以光子形式放出3）化学发光(Chemiluminescence) 在常温下经化学反应所产生的发射光。化学发光是一个多步骤的过程，其机制为某些化合物(发光剂或发光底物)可以利用一个化学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基态时，以发射光子的形式释放能量(即发光)。

2〃化学发光剂

发光剂是指在发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，根据上述发光特点可将发光剂分为荧光素、生物发光剂和化学发光剂三种。下面主要叙述化学发光免疫技术中常用的化学发光剂或发光底物。

1）酶促反应的发光底物是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物，目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。HRP的发光底物为鲁米诺或其衍生物和对-羟基苯乙酸。AP 的发光底物为3-（2-螺旋金刚烷-4-甲氧基-4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）和4-甲基伞形酮磷酸盐（4-MUP，荧光底物）。

（1）鲁米诺或其衍生物: 鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，通常以0.1mol/L pH8.6Tris缓冲液作底物液。要注意是:首先,鲁米诺和H2O2在无HRP催化时也能缓慢自发发光，而在最后光强度测定中造成空白干扰，因而宜分别配制成2瓶试剂溶液，只在用前即刻混合;其次, HRP发光增强剂如某些酚试剂（如邻－碘酚）或萤火虫荧光素酶可增强HRP催化鲁米诺氧化的反应和延长发光时间，提高发光敏感度。

（2）对-羟基苯乙酸（HPA）: 对-羟基苯乙酸（HPA）在H2O2存在下被HRP氧化或氧化二聚体（荧光物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长的荧光，可用荧光光度计测量。

（3）AMPPD: AMPPD在碱性条件下，被ALP酶解生成相当稳定的AMP-D阴离子，其有2-30min的分解半衰期，发出波长为470nm的持续性光，在15min时其强度达到高峰，15-60min内光强度保持相对稳定。

（4）4-MUP: 4-MUP被ALP催化生成4-甲基伞形酮，在360nm的激发光的作用下，发出448nm的荧光，用荧光光度计进行测量。

2）直接化学发光剂这类发光剂不需酶的催化作用，只需改变溶液的pH等条件就能发光的物质，如吖啶酯（acridinium, AE）在有过氧化氢的稀碱溶液中即能发光。

3）电化学发光剂是指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+（图16-7）和电子供体三丙胺（TPA）在阳性电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。二价的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，成为强氧化剂，TPA失去电子后被氧化成阳离子自由基TPA+，它很不稳定，可自发地失去一个质子（H+），形成自由基TPA.，成为一种很强的还原剂，可将一个高能量的电子递给三价的[Ru(bpy)3]3+使其形成激发态的[Ru(bpy)3]2+.。激发态的三联吡啶钌不稳定，很快发射出一个波长为620nm的光子，回复到基态的三联吡啶钌。这一过程可在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号增强。

化学发光免疫测定技术主要根据发光剂不同分为化学发光免疫测定技术、发光酶免疫测定技术和电化学发光免疫测定技术，其中发光酶免疫测定技术又可分为荧光酶免疫测定技术和化学发光酶免疫测定技术；也可根据分离方法的不同进行分类，如微粒子化学发光免疫测定技术和磁颗粒化学发光免疫测定技术等，本章主要根据不同发光剂的化学发光免疫测定技术进行介绍。

发光酶免疫测定

原理：发光酶免疫测定技术（luminescence enzyme immunoasssay， LEIA）属于酶免疫测定中一种。只是最后一步酶反应所用底物为发光剂，通过发光反应发出的光在特定的仪器上进行测定。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）,根据酶促反应底物不同，可分为荧光酶免疫测定技术和化学发光酶免疫测定技术。

荧光酶免疫测定技术就是利用理想的酶荧光底物，生成的产物稳定并有强的荧光强度，通过测定荧光强度进行定量（图16-9）；化学发光酶免疫测定技术就是利用酶对发光底物催化作用而直接发光，通过光强度的测定而直接进行定量。

图1荧光酶免疫测定技术反应原理

图2 化学发光酶免疫测定技术反应原理

技术类型：

1〃分离技术:

(1) 磁颗粒分离法：用抗原或抗体包被磁颗粒,与标本中相应抗原或抗体和酶标的抗体或抗原通过一定模式的免疫学反应后,最终通过磁场将结合酶标记物免疫复合物和游离酶标记物进行分离的技术.

(2) 微粒子捕获法：与磁颗粒分离法所不同是所用颗粒是无磁性微粒子作为抗体或抗原的包被载体, 然后用纤维膜柱子进行酶标记物的结合状态和游离状态的分离.

(3) 包被珠分离法：将用聚苯乙稀等实验材料制成小珠, 在小珠上包被抗原或抗体,经抗原抗体反应后,将结合状态和游离状态的酶标记物进行分离.

2.免疫学反应模式

主要有以下三类，其它免疫学反应模式请参考有关章节内容。

(1) 双抗体夹心法：用微粒子固相抗体和酶标的抗体与待测标本中相应抗原反应，生成微粒子抗体-抗原-酶复合物，经纤维膜柱子分离，加入底物，经酶促反应后发出光，其发光量与待测标本中抗原含量呈正比。

(2) 双抗原夹心法：该法常用于抗体的检测，用包被在微粒子上抗原和酶标记抗原与待测标本中相应抗体反应，生成微柱子抗原-待测抗体-酶标抗原复合物，经纤维膜柱子分离，加入底物进行酶促发光其发光量与待测标本中抗体含量呈正比。

(3) 固相抗原竞争法：该法常用于多肽类小分子抗原的测定，用已知抗原包被微粒子制成微粒子抗原，和待测标本的相应抗原与恒定的相对不足的酶标记抗体发生竞争性结合反应，反应平衡后经纤维膜柱分离微粒子，抗原与酶标抗体形成复合物，被截留在膜上。通过加入底物进行酶促发光反应，其发光量与待测标本中抗原含量呈反比。

1. 抗原抗体结合反应将已包被了抗体的乳胶微粒和待测标本加入反应杯中，经温育一定时间后,再加入碱性磷酸酶标记抗体，温育一定时间后,形成固相包被抗体-抗原-酶标抗体复合物。

2. 结合和游离部分分离将复合物转移到玻璃纤维上，用缓冲液洗涤，没结合的抗原、被洗涤下去，酶标抗体-抗原-胶乳微粒抗体复合物则被保留在纤维膜上。

3. 酶促发光反应加入底物4-MUP，酶标抗体上ALP将4-MUP分解，脱磷酸根基团后形成4-甲基伞形酮（4-MU），它在360nm激发光的照射下，发出448nm的荧光，经荧光读数仪记录，放大，最后根据标准曲线由电脑计算出所测物质的含量。

方法学评价：

1.洗涤要彻底，以免因血清中其他来源的过氧化物酶类物质所产生的非特异性反应，而影响测定结果。

2.酶标抗体或酶标抗体因非特异性吸附而造成的较高本底，实验评价应引起注意。

化学发光免疫测定：

原理：

化学发光免疫测定（chemiluminescence immunoassay，CLIA），是用化学发光剂直接标记抗原或抗体（化学发光剂标记物）,与待测标本中相应抗体或抗原、磁颗粒性的抗原或抗体反应，通过磁场把结合状态（沉淀部分）和游离状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的检测进行定量或定性检测．

图3 化学发光免疫测定技术反应原理

技术类型：

1.分离方法常用磁颗粒分离技术

2.免疫学反应模式同酶发光免疫测定技术，主要也有双抗体夹心法、双抗原夹心法和固相抗原竞争法三种主要模式，所不同只是相应标记抗原或抗体上标记的是吖啶酯而不是酶。

技术要点：

1.常用的实验材料

（1）化学发光剂标记物：临床上最常用的发光剂是吖啶酯类发光剂。吖啶酯类具有显著的优点：①氧化反应不需催化剂，只要碱性环境中就可以进行。反应物在加入H2O2后再加氢化钠溶液，发光反应迅速，本底低。②在氧化反应过程中，结合物被分解，因此游离的吖啶酯的发光不受抑制。③试剂稳定性好。

（2）免疫磁颗粒：指由抗原或抗体包被的磁颗粒。

（3）反应试剂：指发光物发光时所需的氧化剂（H2O2）和PH纠正液（NaOH）。

（4）定标液和质控液。

2〃双抗体夹心法其主要步骤为：

（1）抗原抗体反应：将包被单克隆抗体的磁颗粒和待测标本加入到反应管中，标本中待测抗原与磁颗粒上抗体结合，再加上吖啶酯标记抗体，经过温育，形成磁颗粒抗体-抗原-吖啶酯标记抗体复合物。

（2）游离和结合部分的分离：在电磁场中进行2-3次洗涤后，很快地将未结合的多余抗原和标记抗体洗去。

（3）化学发光反应：经过洗涤的磁性颗粒中，加入氧化剂（H2O2）和PH纠正液（NaOH），使其呈碱性，这时吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解并发光，由集光器进行接收，经光电倍增管放大作用，记录1秒钟内所产生的光子能，这部分光的积分与被测AFP含量成正比，根据标准曲线，仪器可以自动计算出其AFP含量。

方法学评价：

1．吖啶酯作为标记物的优点是其低背景噪音、化学反应简单、快速而无催化剂。

2．吖啶酯用作标记物时，其与大分子的结合并无减少所产生的光量，从而增加灵敏

度，灵敏度可达10-15g/ml。

3．吖啶酯标记试剂有效期长，可达一年。

4．固相分离剂为极为幼细的磁粉，除增大包被面积，加快反应外，亦同时使清洗及

分离更简易、快捷。

电化学发光免疫测定：

原理：

电化学发光免疫测定(Electrochemiluminescence immunoassay, ECLI)是电化学发光（ECL）和免疫测定相结合的产物。它的标记物的发光原理与一般化学发光（CL）不同，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程。ECL与CL的差异在于ECL是电启动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光反应。用化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+标记抗体，通过抗原抗体反应和磁颗粒分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度的大小对带测的抗原或抗体进行定量或定性。

图4 电化学发光免疫测定技术反应原理

技术类型：

1.分离方法磁颗粒分离技术

2.免疫学反应模式其反应模式与酶发光免疫测定技术相同，主要也有双抗体夹心法、双抗原夹心法和固相抗原竞争法三种主要模式，所不同的只是相应标记抗原或抗体上标记的是三联吡啶钌而不是酶。

技术要点：

1〃常用的实验材料

1）三联吡啶钌的标记物：通过三联吡啶钌的N羟基琥珀酰胺酯（NHS）将其与抗原或抗体连接，制成三联吡啶钌标记物。

2）免疫磁珠：可将抗原或抗体直接或通过生物素-亲和素系统包被在磁珠颗粒上，制成免疫磁珠。

3）三丙胺溶液。

4）定标液和质控液。

2〃双抗体夹心法检测抗原，其主要步骤为：

1）三联吡啶钌标记抗体和生物素标记抗体与待测标本同时加入一个反应杯中孵育反应。

2）将链霉亲和素包被磁珠加入反应杯中，再次孵育，使生物素通过与亲和素的结合将磁珠、抗体连接为一体，形成双抗体夹心法。

3）蠕动泵将形成的[Ru(bpy)3]2+-抗体-抗原-抗体-生物素-链霉亲和素-磁珠复合体吸入流动测量室，此时，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的抗体（与生物素结合的和与[Ru(bpy)3]2+结合的抗体）也被吸出测量室。

4）蠕动泵加入含三丙胺（TPA）的缓冲液，同时电极加电压，启动ECL反应过程。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，光强度与[Ru(bpy)3]2+的浓度呈线性关系,故可测出待测抗原的含量。

5）最后，终止电压，移开磁珠，加入清洗液冲洗流动测量室，准备下一个样品测定。

方法学评价：

1．标记物的再循环利用，使发光强度更高、时间更长、易于测定。

2．具有灵敏度高，可达pg/ml水平;线性范围宽;反应时间短;试剂稳定好等特点