肌肉抑制素基因与RNA干扰的应用前景

文章编号:1003—2843(2005)ZK—0020—04

肌肉抑制素基因与RNA干扰的应用前景

苏畅,徐亚欧3,马嵬,於建国,毛德才

(西南民族大学生命科学与技术学院,成都610041)

摘　要:本文综述了肌肉抑制素基因的研究进展,以及RNA干扰技术的功能.展望了RNA干扰技术在肌肉抑制素基因中的应用前景.

关键词:肌肉抑制素基因;双肌;RNA干扰

中图分类号:S813 文献标识码:A

在畜牧业中,肌肉的产量和质量是肉用畜禽的重要经济性状,对肉用畜禽饲养业的经济效益起决定性作用.在研究优良经济性状的主效基因时,人们对造成牛肌肉异常发达的“双肌”性状的肌肉生长抑制素基因越来越感兴趣,该基因已经成为研究畜禽肉质性状的主要基因之一.RNA干扰技术的发现和应用,为开发功能基因提供了一个广阔的平台.将RNA干扰技术应用于肌肉生长抑制素基因的开发,可以有效提高畜禽产肉量,获得重大的经济效益.

1　肌肉生长抑制素基因与双肌现象

1.1　肌肉生长抑制素基因

肌肉生长抑制素(myostatin,MST N)基因[1],又称G DF-8基因(gr owth differentiati on fact or8),是TGF-β(transf or m ing gr o wth fact or beta,转化生长因子β)超家族中G DF亚族的成员.TGF-β是一种抑制肌细胞分化的分泌型多肽.Myostatin基因具有TGF-β超家族成员的特点即,N-端有疏水的分泌用的信号肽序列,可以通过此信号肽跨越内质网膜;前区的糖基化位点,紧挨着生物活性区由4个氨基酸(RSRR)组成的蛋白酶加工位点;以及C -末端包含9个保守的半胱氨酸的生物活性区.Myostatin基因表达26K D的成熟糖蛋白,分泌到胞外发挥生理功能.

1.2　双肌现象

早在1807年英国的Culley[2]就在牛中发现了双肌现象,利用这一现象人们通过选育得到了世界上有名的2个双肌牛品种,即比利时蓝牛和皮尔蒙特牛,但直到20世纪60年代人们才对双肌性状进行仔细的研究.双肌牛的外部特征是臀部、大腿、上臂、胸及起支撑作用的中前端肌肉群异常发达,皮下脂肪发育不良,皮肤薄.1983年,人们在陶赛特羊中也发现了双肌现象,其臀部肌肉显著发达于普通羊,并能遗传给后代.

1.3　肌肉抑制素基因的发现

1997年美国John Hopkins大学的Mcpherr on和Lee在研究调节细胞生长和分化的一组蛋白时,发现了双肌基因(double-muscling gene),他们采用简并PCR技术,首次在小鼠骨骼肌c DNA文库中鉴别出G DF-8,得到全长的c DNA序列[3].因其在骨骼肌中特异表达,是骨骼肌的负调控因子,可通过调控成肌细胞的增殖影响肌肉的生长与发育,对骨骼肌生长具有重要的调节作用[4～6],故将其命名为肌肉生长抑制素基因—Myostatin基因,其变异或缺失会导致肌细胞增生与肌纤维肥大.Gr obet等通过分离分析和微卫星标记分析,确证了Myostatin基因的突变

收稿日期:2005-10-11

作者简介:苏畅(1981-),女,西南民族大学动物遗传育种与繁殖专业在读硕士研究生.

3通讯作者

是造成牛“双肌”的原因[7].

McPherr on和Gr obet等几乎同时发现:双肌牛肌肉量显著增加是由于Myostatin基因编码序列发生突变而造成的.McPherr on[8]等通过基因打靶技术敲除老鼠体内Myostatin基因,使其不能正常发挥作用.结果在My ostatin 敲除的老鼠体内,肌纤维得到广泛的增生和肥大,导致骨骼肌肌肉质量显著增加,其平均体重超过正常老鼠的261%,而且突变型小鼠骨骼肌纤维的数量较野生小鼠高出86%.

Thomas[9]等将不同浓度的外源性表达的Myostatin蛋白质加入到C2C12成纤维细胞的培养物中,发现加入的Myostatin浓度的增加和培养时间的延长与成肌细胞的增殖速度和数量成反比.结果表明Myostatin对成肌细胞增殖有抑制作用,证实了Myostatin能抑制成肌细胞的增殖,从而对骨骼肌生成进行负调控.

1.4　肌肉抑制素基因的同源性和组织特异性

和许多功能基因一样,Myostatin序列在各物种进化过程中是高度保守的.用鼠抗My ostatin C-端保守区的探针筛查发现,大鼠、小鼠、人、猪、火鸡和鸡的同源性为100%,狒狒、绵羊和牛也仅有1～3个碱基不同,表明Myo2 statin基因在各个物种间高度保守.

最初,McPherr on发现Myostatin基因在胚胎发育过程和成年个体骨骼肌中表达.胚胎发育的早期,该基因的表达局限于发育体节的肌节区,此后在躯体的很多不同的肌肉中表达.但后来J i[10]等对生长发育期猪的组织进行测定,发现肌肉抑制素的mRNA主要分布于骨骼肌,在脂肪组织、脑、舌、心、肺、小肠、肾、肝和骨髓也有分布,但含量较少.而且在哺乳动物的乳腺中也有肌肉抑制素分布.Shar ma[11]等也证实Myostatin基因在胎儿和成年个体心肌中也有表达,主要分布在浦肯野氏纤维和心肌细胞中.此外,脂肪组织中也检测到相当低的水平.

1.5　肌肉抑制素基因的生物学功能

肌肉抑制素基因的主要作用是对肌肉生长起负调节因子的作用,即抑制肌肉生长发育,如果缺失或突变就会导致肌肉过度生长或肥大,即双肌现象.

为了确定G DF-8的生物学功能,McPherr on等通过基因打靶定点突变小鼠ES细胞的G DF-8基因,将表达蛋白质的基因缺失C端区域失活的ES细胞重新植回小鼠胚胎,通过杂交获得的G DF-8突变的纯合体小鼠可以成活和生育,而且其个体比野生型小鼠大30%左右,其肌肉较野生型大2～3倍.G DF-8的生物学特性在某些方面类似于抗肥胖蛋白,其生理作用的分子机制还有待进一步研究.

此外,实验还证明肌肉抑制素基因除了影响骨骼肌发育外还对脂肪沉积起抑制作用,Myostatin基因突变纯合体小鼠与对照组比平均体脂肪减少70%.因此,可以推断突变纯合体小鼠体重升高的原因之一是脂肪沉积减少.

Sha ma[11]等实验表明,当心肌梗塞时,受损部位周围的心肌细胞肌肉抑制素基因表达增加,推测肌肉抑制素基因在心肌发育和生理过程中期起重要作用.另外,也有报道肌肉抑制素与成年动物肌肉萎缩和肌肉再生有关. 1.6　肌肉抑制素基因的研究现状

自小鼠Myostatin被鉴定出以后,研究者们便开始对该基因进行深入的研究,陆续对多种动物的Myostatin进行定位、克隆以及测序研究.

Gonzalez-Cadavid[12]通过研究将人的肌肉抑制素基因定位于人染色体的2q32,2,其全长约7.7kb,共包括3个外显子和2个内含子,内含子1和内含子2分别为1.8kb和2.4kb.三个外显子编码的氨基酸长度分别为:125, 124和126.该基因在成年人的肌肉中同样表达,起到抑制肌肉发育的作用.成人血清中肌肉抑制素的含量与去脂肪体重成反比.

Sonstegard[13]等分析了猪肌肉生长抑制素基因,该基因已定位于15号染色体的15q2.3.c DNA有一个可读框(opening reading fra me,ORF)编码376个氨基酸的核苷酸序列组成,包含三个外显子和两个内含子.欧阳红生等[14]对猪的Myostatin基因进行克隆和序列测定.张玉静等,对猪的Myostatin构建了原核表达载体,并进行了原核表达.

朱大海、杨威[15]等克隆了鸡Myostatin基因组全序列,用已克隆的鸡Myostatin的c DNA序列作为标记探针,成功地表达了G DF-8蛋白,并进行了抗体的制备,试图从鸡的骨骼肌细胞中分离和提纯G DF-8受体,进一步研究

其结构与功能关系.

2　RNA干扰及其功能

随着人类基因组计划以及多种动植物基因组测序工作的相继完成,人们对基因的研究已经从序列转向了对基因的生物学功能的研究中.在传统的基因功能研究的基础上,新型的研究基因功能的实验技术不断涌现和快速发展.RNA干扰(RNA interference,RNA i)技术将为基因功能研究提供一条新的途径.

2.1　RNA i

RNA i是双链RNA(ds RNA)介导的特异性基因表达沉默现象.利用一些小的双链RNA来高效、特异地阻断生物体内特定基因的表达,并促使同源mRNA降解,从而诱使细胞表现出特定基因缺失的表型.RNA i是生物体中普遍存在的一种古老而又保守的基因调控机制.

2.2　RNA i的功能

对于功能未知的结构基因,可以通过RNA i手段使其沉默进行功能研究.RNA i现象于1998年被发现后,迅速成功地应用于线虫、果蝇、植物等生物体的研究中.在2001年首次报道了在哺乳动物细胞培养中成功应用RNA i 技术抑制基因表达,开创了RNA i技术应用于高等生物基因研究的先河[16].目前,RNA i技术应用于低等生物基因组功能的研究中已比较成熟;人们在较高级的哺乳动物和人类基因的功能研究中发现利用RNA i技术得到的基因功能表现与以往使用基因剔除法获得的结果一致.

RNA i还可用于疾病的治疗,研究发现利用RNA i可以直接和有效地起到抗病毒抗肿瘤的作用,为肝炎[17]、艾滋病[18]等疾病的治疗提供了新的途径.另外,RNA i还能稳定转座子,有利于遗传稳定,防止遗传损害.在信号转导通路研究中,RNA i技术可以很容易地确定复杂信号通路中不同基因的上下游关系.

RNA i作为反向遗传学的研究方法,为后基因组时代的基因功能分析提供了快速可靠的应用平台.RNA i克服了传统的基因敲除、转基因、反义技术等方法过程繁琐,技术要求苛刻等弱点,以其快速、可靠、经济的特点吸引了越来越多研究者的重视.

3　肌肉抑制素与RNA干扰的应用前景

人们对畜禽肉用性状的研究,主要集中在瘦肉量和肉质上.Myostatin是在家畜、家禽等经济动物中普遍存在的特异性抑制肌肉加倍表型的单一开关基因,一旦该基因突变或缺失,就能引起动物双肌现象.由于双肌动物具有瘦肉量多、生长速度快、瘦肉率高、节省饲料等特点,因而Myostatin是提高肉用动物肌肉产量的理想靶基因.例如,通过建立鸡胚胎干细胞系,剔除Myostatin基因,可培育出超速生长的肉用仔鸡,而通过转Myostatin基因技术,使蛋鸡Myostatin基因超常表达,抑制其骨骼肌生长,可降低培育成本.研究Myostatin的结构和功能对阐明骨骼肌生长发育的调控机理具有重要的理论意义,同时将为畜牧业肉用类动物育种开辟一条新的途径.

Myostatin基因敲除的超级鼠的成功,为利用基因打靶和动物克隆技术定点突变Myostatin基因进行经济动物定向育种奠定了基础.然而,基因敲除耗时太长,转基因又面临消费者对转基因食品的接受问题,均会影响可提高畜牧业生产效益具有重大潜在作用的基因的利用.在RNA i基础研究和应用研究取得了重大进展的同时,将RNA i 用于肌肉抑制素基因的研究可在不改变动物遗传结构的基础上增加瘦肉的产量,为研究拓宽了新的思路,增加了新的策略.

通过分子生物学手段利用RNA i手段操纵肌肉抑制素基因,能够提高经济动物肉产量获得重大经济效益.而且,利用RNA i对肌肉抑制素基因功能的定向靶缺失的同时,可以有效地提高畜禽产肉性能而不影响动物繁殖能力和健康状况的目标,动物育种提供新的途径,是动物基因工程中一个全新的研究方向.目前,RNA i在遗传育种上的应用尚处于初级阶段,但可以展望其必将在遗传育种及生产利用中发挥巨大的作用.

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Appli ca ti on prospects of m yost a ti n gene and RNA i n terference

SU Chang,XU Ya2ou,M A W e i,Y U J i a n2guo,M AO D e2ca i

(College of L ife Science and Technol ogy,South west University for Nati onalities,Chengdu610041,P.R.C.)

Abstract:I n this paper,advancement of research on myostatin gene and functi on of RNA interference aer re2

vie wed.I n additi on,the p r os pect of app licati on of RNA interference technique t o myostatin gene is su mma2

rized.

Key words:myostatin gene;double-muscle;RNA interference