细胞实验
第三章细胞生物学实验
第一节细胞培养
一、细胞培养的注意事项
细胞培养在细胞房内进行，需严格遵守细胞房操作守则操作。特别指出的是：
1、细胞房为细胞培养操作专用，不得在细胞房内进行非细胞培养操作。凡是需要在细胞房培养细胞均需经过允许，并登记备案。
2、在细胞房培养细胞者严格按照其分配的位置摆放细胞培养物品、细胞及培养试剂，并在规定的操作台使用。严禁在未告知对方的情况下随意使用他人的培养基、细胞器材！
3、在本细胞房培养细胞者进门时需要更换拖鞋、必须穿白大褂和戴手套（进行细胞操作必须佩带乳胶手套），操作之前，必须用酒精喷壶喷洒双手，保证双手均进行过消毒。每次操作前请用紫外照射台面，并擦拭台面。培养瓶进入培养箱前需要清洁其表面。如发生培养瓶内培养基漏出，立即用酒精棉将瓶外表面及箱内污迹擦拭干净。
4、细胞操作完成之后，要清理台面上任何遗留的东西，包括枪头盒、滴管、手套和用完的培养皿等。废液缸内的废液、枪头和滴管需要及时清理，再放回超净工作台内。
5、细胞房值日的同学每天清理细胞房，每周四打扫细胞房一次（包括垃圾清理和拖地），并且配制75%的酒精及灌装95%的酒精。及时补充培养箱内无菌蒸馏水并应注意CO2浓度，发现问题及时报告。
6、细胞培养箱需要每月25号进行消毒。培养细胞一经污染，需要及时汇报，寻找污染原因，并及时清理污染的培养箱和培养基。
二、细胞培养常用试剂的配制
1、0.01mM PBS：NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.44 g，KH2PO4 0.24 g，H2O 800 ml，搅拌溶解，定容至 1 000 ml，高压灭菌后4 ℃保存。
2、D-Hank’s液：NaCl 80.0 g，Na2HPO4 0.6 g，KCl 4.0 g，KH2PO4 0.6 g，H2O 800 ml，搅拌溶解，定容至1 000 ml，高压灭菌后4 ℃保存。
3、青霉素-链霉素储存液：青霉素40万U（5瓶）、链霉素4g （4瓶），H2O 400 ml，搅拌溶解，过滤灭菌后分装，-20℃保存。使用时1:1000稀释，终浓度为100 U/ml青霉素和100 μg /ml链霉素
4、0.25%胰酶：胰酶0.25g，D-Hank’s液 100ml，搅拌溶解，过滤灭菌后4 ℃保存。
5、DMEM基础培养基：DMEM干粉1瓶，NaHCO3 3.7g，HEPES 2.73g，H2O 800 ml，搅拌溶解，HCl调pH值至7.0，定容至1 000 ml，过滤灭菌后4 ℃保存。
6、DMEM完全培养基：含有10% 胎牛血清或者15%小牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg /ml链霉素的DMEM培养基，4℃保存。
7、F-12培养基：F12干粉1瓶，NaHCO3 1.176g，H2O 800 ml，搅拌溶解，HCl调pH值至7.0，定容至1 000 ml，过滤灭菌后4 ℃保存。
8、DMEM/F12培养基：50%DMEM培养基，50%F12培养基混匀。
9、EMEM基础培养基：EMEM干粉1瓶，NaHCO3 2.2g，H2O 800 ml，搅拌溶解，HCl调pH值至7.0，定容至1 000 ml，过滤灭菌后
4 ℃保存。
10、RPMI1640基础培养基：RPMI1640干粉1瓶，NaHCO3 2.0g，
H2O 800 ml，搅拌溶解，HCl调pH值至7.0，定容至1 000 ml，过滤灭菌后4 ℃保存。
11、RPIM1640完全培养基：含有10% 胎牛血清或者15%小牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg /ml链霉素的DMEM培养基，4℃保存。
12、F-12K培养基：F12K干粉1瓶，NaHCO3 2.5g，H2O 800 ml，搅拌溶解，HCl调pH值至7.0，定容至1 000 ml，过滤灭菌后4 ℃保存。
第二节贴壁细胞的培养
一、贴壁细胞的复苏
1、培养基复温30min左右；
2、准备好37℃恒温水浴锅；
3、快速从-80℃冰箱取出冻存的细胞，至于37℃恒温水浴锅摇晃至完全融化；
4、取15ml离心管加入10ml完全培养基后加入溶解的细胞悬液，1000rpm离心5min；
5、弃去上清液，用含有完全培养基重悬细胞，接种至细胞培养瓶中，置于37℃细胞培养箱；
6、次日更换一次培养液，继续培养。
二、贴壁细胞的传代
1、D-Hanks、胰酶、培养基复温30min左右；
2、将D-Hanks、胰酶、培养基瓶盖依次打开。准备好所需的吸管和移液管；
3、将细胞从培养箱中取出，弃去废旧的培养基，用D-Hanks洗
1次；
4、加入0.25%胰酶，消化至培养瓶壁上呈雾状，弃去胰酶；
5、加入完全培养基终止消化，用吸管将细胞从壁上吹下，并吹打成单细胞悬液；
6、接种至新的培养瓶中，补足培养基，轻轻摇匀，标注细胞名称、传代日期及培养者姓名后置于培养箱培养，次日观察。
三、贴壁细胞的冻存
1、D-Hanks、胰酶、培养基复温30min左右；
2、配制细胞冻存液，完全培养基中加入5-10%的DMSO；
3、将细胞从培养箱中取出，弃去废旧的培养基，用D-Hanks洗
1次；
4、加入0.25%胰酶，消化至培养瓶壁上呈雾状，弃去胰酶；
5、用配制好的细胞冻存液吹打细胞，吹匀后分装于 1.5ml EP 管中；
6、标注细胞名称和冻存日期，用封口膜包好。4℃放置半小时，-20℃放置半小时，保存至-80℃冰箱。
第三节悬浮细胞的培养
一、悬浮细胞的复苏：与贴壁细胞相同。
二、悬浮细胞的传代：
因悬浮生长的细胞不贴壁，故传代时不需要胰酶的消化。通常采取直接传代或离心收集后传代。
（一）直接传代：
1、培养基复温30min左右；
2、在传代前将细胞培养瓶竖立，让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底下；
3、将上清吸掉1/2~2/3,然后用吸管吹打成细胞悬液后，传代接种。
（二）离心传代法
1、培养基复温30min左右；
2、将细胞连同培养液一并转移到离心管内；
3、800~1200r/min离心5min，然后去除上清；
4、加新的培养液到离心管内，用吸管吹打使之形成细胞悬液，传代接种。
三、悬浮细胞的冻存
1、培养基复温30min左右。
2、配制细胞冻存液，完全培养基中加入5-10%的DMSO。
3、将细胞从培养箱中取出，连同培养液一并转移到离心管内；3、800~1200r/min离心5min，然后去除上清；
5、用配制好的细胞冻存液吹打细胞，吹匀后分装于 1.5ml EP管中；
6、标注细胞名称和冻存日期，用封口膜包好。4℃放置半小时，-20℃放置半小时，保存至-80℃冰箱。
四、悬浮细胞培养的注意事项
1、悬浮细胞培养时，培养基较贴壁细胞应相对多点。
2、悬浮细胞培养过程中容易结团（clump），是悬浮细胞的大忌，因及时吹打。
3、悬浮细胞培养过程中的凋亡或死亡细胞可以用低速离心的方法去除。
第四节原代细胞的培养
一、原代星形胶质细胞的培养
新生大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养：
1、取出生1-3d以内的新生SD大鼠l0只。
2、75％的酒精浸泡消毒后，采用无菌方法迅速取出大脑，用预冷的D-Hanks液清洗并剔除脑膜、血管、海马，取大脑皮质，置于D-Hank’s液中剪碎。
3、收集脑组织至15ml离心管中，加入等量0.25%胰酶37℃培养箱里消化8min（每2-3min摇一次确保消化完全），加含15%小牛血清DMEM/F12完全培养基终止消化。
4、1500 r／min离心5 min后，弃上清，加入含15%小牛血清DMEM／F12完全培养基，吸管吹散组织，制成细胞悬液，静置后取上清400目滤网过滤。
5、将悬液以5×105／cm2的密度约接种于已灭菌的培养瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。3d后换液，以后每3d半量换液1次。9~10d后待细胞基本融合。
6、将培养瓶置于37℃恒温旋转摇床215 r／min，20 h后除去
悬浮的细胞，D-Hanks液清洗3次，加入培养基培养即可得纯化的星形胶质细胞。
二、原代小胶质细胞的培养
新生大鼠大脑皮层小胶质细胞原代培养：
1、取出生1-3d以内的新生SD大鼠l0只；
2、75％的酒精浸泡消毒后，采用无菌方法迅速取出大脑，用预冷的D-Hank’s液清洗并剔除脑膜、血管、海马，取大脑皮质，置于D-Hank’s液中剪碎；
3、收集脑组织至15ml离心管中，加入等量0.25%胰酶37℃培养箱里消化8min（每2-3min摇一次确保消化完全），加含10%胎牛血清的DMEM完全培养基终止消化；
4、1500 r／min离心 5 min后，弃上清，加入10%胎牛血清DMEM完全培养基，吸管吹散组织，制成细胞悬液，静置后取上清400目滤网过滤；
5、将悬液以5×105／cm2的密度约接种于已灭菌的培养瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。3d后换液，以后每3d半量换液1次。9~10d后待细胞基本融合；
6、将培养瓶置于37℃恒温旋转摇床260 r／min 2 h，此时小胶质细胞为悬浮状。收集培养基装入培养瓶中培养，24h后更换培养基。
三、原代神经元培养
孕鼠原代皮层/海马神经元培养：
1、提前一天，用0.01%的多聚赖氨酸包被培养皿及培养板；
2、乙醚及10%水合氯醛麻醉孕鼠后解剖孕鼠，分离胎鼠，剥离胎鼠全脑置于预冷的HBSS缓冲液中，分离大脑皮层及海马，在HBSS剥离液中剔除脑膜、血管，取大脑组织，置于HBSS液中剪碎；
3、收集脑组织置于15ml离心管中，0.25%胰酶：HBSS=1:1消化10min（每2-3min摇一次，确保消化完全），加含10%胎牛血清DMEM/F12完全培养基终止消化，静置后去除上清。
4、加入含15%小牛血清DMEM/F12完全培养基，吸管吹散组织（吹打时尽量少泡沫），制成细胞悬液，静置后取上清400目滤网过滤；
5、将悬液以5×105／cm2的密度约接种于已灭菌的培养瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。
6、4-24 h全部更换为Neurobasal完全培养基，以后每3天半量换液，14-21天可使用。
四、胶质细胞的混合培养
新生大鼠大脑皮层胶质细胞混合培养：
1、取l0只出生1d的新生SD大鼠。
2、75％的酒精浸泡消毒后，采用无菌方法迅速剪开颅骨，取出脑组织至预冷的D-Hank’s液清洗并剔除脑膜、血管、海马，取大脑皮质，置于D-Hank’s液中剪碎。
3、收集脑组织至15ml离心管中，加入等量0.125%胰酶37℃培养箱里消化8min（每2~3min摇一次），加DMEM完全培养基（含10％胎牛血清）终止消化，静置后去除上清。
4、加入DMEM完全培养基，用吸管反复吹打至悬液，1500 r／min离心5 min后，取上清400目滤网过滤；
5、将悬液以5×105／cm2的密度约接种于已灭菌的培养瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。
五、原代施万元培养
（一）新生大鼠施万细胞原代培养：
1、提前一天，用0.01%的多聚赖氨酸或鼠尾胶包被培养皿及培养板；
2、出生1-2天的Sprague-Dawley大鼠，75%酒精浸泡消毒30秒后断头；
3、无菌条件下取出坐骨神经、臂丛神经、背根神经节，在DMEM基础培养基中剥去神经外膜及部分神经束膜并洗净；
4、将神经段剪碎成糊状。等量加入0.25%胰蛋白酶和0.03%胶原酶，置入1.5 ml离心管中于5% CO2培养箱中37 ℃消化30 min，每隔10 min振荡一次以加速消化；
5、1 000 rpm/min离心5 min，弃上清，用培养基重悬沉淀；
6、重悬细胞接种于多聚赖氨酸包被的培养皿，加入适量10%胎牛血清的DMEM完全培养基置培养箱中。
（二）施万细胞纯化培养：
1、为了减少分化的成纤维细胞的数量，施万细胞先在含 5 mol/L Ara-C的DMEM完全培养液中培养48 h，后换为无Ara-C的DMEM完全培养基培养12 h，再进入含Ara-C培养液中培养24 h，之后在DMEM完全培养基中培养。
2、残余的成纤维细胞通过补体介导的细胞毒作用而消除，即兔抗Thy-1.1 IgM型抗体（1:1000）37 ℃，作用30 min，洗净抗体后，加入兔血清（1:200），37 ℃，作用30 min。以后细胞进入含福司可林（2 μm）的DMEM完全培养基中，每2~3天更换培养液一
次。
六、原代DRG神经元培养
（一）新生大鼠DRG神经元原代培养：
1、提前一天，用0.01%的多聚赖氨酸或鼠尾胶包被24孔培养板；
2、出生1-2天的Sprague-Dawley大鼠，75%酒精浸泡消毒30秒后断头；
3、无菌条件下取出背根神经节，在DMEM基础培养基中剥去神经外膜及部分神经束膜并洗净；
4、收集DRG神经元置1.5 ml离心管中，加入0.25%胰蛋白酶5% CO2培养箱中37 ℃消化10 min，每隔10 min振荡一次以加速消化；
5、1 000 rpm/min离心5 min，弃上清，用培养基重悬沉淀。
6、重悬细胞接种于多聚赖氨酸包被的培养皿，加入适量DRG生长培养基置细胞培养箱中。
（二）DRG神经元的纯化培养：
为了减少成纤维细胞存在的数量，DRG神经元在DRG纯化培养基
中生长2天，后换成含有DRG生长培养基培养2天，如此重复两次，去
除培养物中的成纤维细胞。
七、施旺细胞和DRG神经元的共培养
1、纯化后的DRG神经元在DRG生长培养基中继续维持3-5天；
2、将纯化后的施旺细胞加入DRG中在DRG生长培养基中贴附过夜；
3、共培养的细胞在分化培养基中维持一周，之后更换为髓鞘形成培养基；
4、成髓鞘的过程大概需要28天，在此过程中每2-3天更换新鲜髓鞘形成培养基。
附：试剂配制
1、DRG生长培养基：含有50 ng/mL NGF、10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg /ml链霉素的的EMEM培养基。
2、DRG纯化培养基：含有10 μM uridine、10 μM deoxyuridine、50 ng/mL NGF、1×N2 supplement、100 U/ml青霉素和100 μg /ml链霉素的EMEM培养基。
3、分化培养基：50 ng/mL NGF、1×N2 supplement、100 U/ml 青霉素和100 μg /ml链霉素的DMEM/F12培养基。
4、髓鞘形成培养基：50 ng/mL NGF、50 μg/mL 维生素C、15%
胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg /ml链霉素的EMEM培养基。
第五节细胞转染
一、脂质体介导的细胞转染
（一）Lipofectamine 2000脂质体转染
1、细胞传代：
贴壁细胞：转染前一天，将0.5-1.5×106细胞用无抗性的完全培养基传代至6cm培养皿中，使得第二天转染时融合度在80-90%左右；
悬浮细胞：在即将转染之前，将2-6×106细胞用无抗性的完全培养基传代至6cm培养皿中；
2、将2-4ug的质粒加入200ul的无血清培养基中，混匀；
3、将Lipofectamine 2000取出，轻柔摇匀，再将质粒量1-3倍量（以1ug质粒：1ul lipo2000=1：1为准）的Lipofectamine 2000用另一200ul的无血清培养基稀释，吹打混匀，静置5min；
4、将质粒和Lipofectamine 2000混匀，室温静置20min；
5、将混合物加入培养皿中，轻柔地摇匀，静置，16-36h后检测蛋白表达；
转染4-6小时后换液
（二）Fugene HD脂质体转染
1、细胞传代。贴壁细胞：转染前一天，将0.5-1.5*106细胞用无抗性的完全培养基传代至6cm培养皿中，使得第二天转染时融合度在80%左右；悬浮细胞：在即将转染之前，将2-6*106细胞用无抗性的完全培养基传代至6cm培养皿中；
2、每种细胞在转染之前，需要测试质粒和转染试剂的合适比例，以转染试剂：质粒=4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.5:1的比例进行测试，获得最佳的转染比例；
3、转染之前，将Fugene恢复至室温，在1.5ml离心管中加入98ul的完全培养基，加入2ug的质粒DNA，混匀；
4、加入适量的Fugene HD，吹打混匀，室温静置15min；
5、将转染复合物加入细胞中，轻柔混匀；
二、细胞电转染
1、收集细胞，把细胞转入50毫升的离心管中，室温下1000g 离心2分钟。
2、加入电转缓冲液，用吸管轻轻吹打细胞，使细胞充分悬浮，细胞浓度控制在1-5×106。
3、打开电转仪，调好电转的条件，备用。
4、在电转杯中加入质粒DNA，DNA 的量取决于细胞的类型，开始浓度为10-50 μg/ml.
4、在电转杯中加入细胞，轻敲混匀。
5、把电转杯放入ShockPod，关闭盖子，按下开关一次。
6、电转后立即把细胞转移到含有0.5毫升培养基的培养瓶中。
7、轻摇细胞，使其在培养瓶内分布均匀，之后放入培养箱中生长。
第六节细胞增殖检测
一、CCK-8法检测细胞增殖：
1、在96孔板中接种细胞悬液 (100 μL/孔 )，密度为104-105/ml，将培养板在培养箱预培养过夜 (在37℃，5% CO2的条件下)，刺激细胞
2、到达时间点后换液，向每孔加入100 μL含10 μL CCK-8溶液的细胞培养基 (注意不要在孔中生成气泡，它们会影响O.D值的读数)。
3、将培养板在培养箱内孵育 1.5-2 h。（不同时间点要保持相同的时间）
4、用酶标仪测定（测定波长490，参照波长630）处的吸光度。
二、Brdu掺入法检测细胞增殖：
1、实验终止前将BrdU抗原（BrdU labeling solution，10 μl/well）加入培养有细胞的96孔板中，37 ℃培养箱中孵育2 h，在此过程中BrdU掺入处于增殖期的细胞中。
2、移去上清培养基，加FixDenat 200 μl/well，室温固定30 min。
3、移去固定液，加接有过氧化物酶的anti-BrdU-POD working solution，100 μl/well，室温孵育90 min，在此过程中，BrdU与其抗体相结合。
4、洗去抗体复合物，加Substrate solution 100 μl/well，室温孵育20 min。
5、加Stock Solution 25 μl/well终止反应，用酶标仪在370nm波长下测定OD值，计算样品浓度。
注：本实验设置未加BrdU抗原的实验组为对照，每组样品设双复孔，3次重复实验。
第七节细胞凋亡检测
一、PI染色流式细胞分析术检测细胞周期：
1、收集细胞：培养细胞到合适时间点，胰酶消化后，用完培终止并收集到5 mL EP管中离心，1200 rpm离心5min，弃掉培养基，用预冷的细胞PBS重悬洗涤2次，
2、固定：再离心，弃掉PBS，用70%乙醇重悬，置于-20 ℃固定至少24小时。
3、1200 rpm离心5min，弃乙醇，用PBS洗涤3次，并用含1% triton X-100 的PBS 4 ℃通透10 min，每管200 μL。
4、加入RNase A，与triton X-100的PBS比例为1:1000，避光4 ℃反应20 min，每管300-400 μL。
5、加入200 μL PI染色剂，避光4 ℃染色20 min，每管200 μL，过滤（400目筛子）。
6、置于冰盒内，流式细胞仪检测。
试剂配置：
PI染色液：浓度为0.5 mg/mL，如 4 mL含 2 mg，可以先配10×，用含triton X-100的PBS稀释
二、AnxinV检测细胞凋亡：
（一）流式细胞仪检测：
1、收集细胞：贴壁细胞予胰酶消化后收集细胞，大约106个细胞，用细胞PBS重悬洗涤，200 g离心5 min。
2、用Anxin-V标记溶液重悬细胞，室温孵育10-15 min，每管100 μL。
3、每管加入0.5ml孵育溶液（bottle 3）后上机流式细胞分析检测。
（二）免疫荧光检测：
1、细胞接种到小圆片上，培养过夜。
2、到达合适的时间点，弃掉培养基，用Anxin-V标记溶液室温孵育10-15 min，每孔100 μL。
3、激发波长为488 nm， 515–565 nm绿色光检测细胞免疫荧光。
试剂配制：
Anxin-V标记溶液：20μL Anxin-V标记试剂（vial 1）溶在1ml孵育溶液（bottle 3）中，在加入20μL PI试剂（vial 2）
八体外哺乳动物细胞染色体畸变试验
九、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test 1 范围 本规范规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997) 3试验目的 本试验是用于检测培养的哺乳动物细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性。 4 定义 染色体型畸变(Chromosome-type aberration)：染色体结构损伤，表现为在两个染色单体相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。 染色单体型畸变(Chromatid-type aberration)：染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。 染色体数目改变(Numerical aberration)：所用细胞株的正常染色体数目的变化。 结构畸变(Structural aberration)：在细胞分裂的中期相阶段，用显微镜检出的染色体结构改变，表现为缺失、断片、互换等。 有丝分裂指数(Mitotic index)：中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值；是一项反映细胞增殖程度的指标。 5 试验基本原则 在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染色，分析染色体畸变。 6 试验方法 6.1 试剂和受试物制备 6.1.1 阳性对照物：可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，阳性对照物应是已知的断裂剂，能引起可检出的、并可重复的阳性结果。当外源性活化系统不存在时，可使用甲磺酸甲酯（methyl methanesulphonate (MMS)）、甲磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate(EMS)）、乙基亚硝基脲(ethyl nitrosourea)、丝裂霉素C(mitomycin C)、4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide）。当外源性活化系统存在时，可使用苯并（a）芘[benzo(a)pyrene]、环磷酰胺(cyclophosphamide)。 6.1.2 阴性对照物：应设阴性对照，即仅含和受试物组相同的溶剂，不含受试物，其它处理和受试物组完全相同。此外，如未能证实所选溶剂不具有致突变性，溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异，还应设空白对照。 6.1.3 受试物 6.1.3.1 受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加入试验系统和/或用前稀释至适合浓度。受试物应在使用前新鲜配制，否则就必
细胞工程实验方案设计
目录一、基本原理 （一）基本概念 （二）细胞冻存及复苏原理 二、操作器材、设备及灭菌处理（一）准备室的设备 （二）配液室的设备 （三）培养室的设备 （四）细胞培养用液的配制器材与试剂（五）灭菌操作 三、基本用液的配置 （一）水的制备 （二）PBS的制备与消毒 （三）胰蛋白酶溶液的配制与消毒（四）血清的灭活 四、实验步骤 （一）传代前准备工作 （二）取材 （三）原代培养 （四）传代培养
（五）细胞纯化 （六）细胞系的建立 （七）细胞冻存 （八）冻存细胞的复苏 五、实验记录及基本注意事项（一）基本注意事项 （二）实验记录
小鼠肝脏上皮细胞系的建立 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的中，让这些和增殖。这个实验方案就是选取小鼠肝脏上皮利用动物细胞培养技术建立细胞系。 一、基本原理 （一）基本概念 1、原代培养（primary culture） 直接从有机体中取出的细胞、组织或器官开始进行体外培养直到第一次传代为止。这种培养称之为原代培养。 2、传代培养（subculture） 细胞从一个培养皿以1：2或1：2以上的比率转移或移植到另一个器皿的培养，这种培养称之为传代培养。 （二）细胞冻存及复苏原理 在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
病毒感染细胞实验整体流程及原理
病毒感染细胞实验整体 流程及原理 Standardization of sany group #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 慢病毒 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 、腺病毒 原理
细胞培养实验技术大全
细胞培养实验技术大全 第一章细胞培养的基本原理与技术 现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。 第一节体外培养的概念 一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。 组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。 细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。 器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。 二、体内、外细胞的差异和分化 1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。 2、分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。 第二节细胞培养的一般过程 一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。 二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则
细胞工程实验课题
盐城师范学院海洋与生物工程学院 ——细胞工程实验微课题设计 细胞工程微课题实验方案 不同浓度磷元素对鱼肝细胞的活性 的影响 专业：生物技术 班级：技术14（1）班 成员：14243148杨永周14243150朱剑秋14243146 王宁14243138 胡峰 14243140 李强14243136 陈一帆 14243137 贡森森 日期：2016年11月
磷元素对鱼肝细胞活性的影响 一、实验目的 随着农业的不断高速发展，我国农村为了更高的产量施大量的氮磷钾肥，虽然极大提高了农作物的存活率，但是肥料过剩所产生的水质问题也日趋显著。在这些问题中尤为突出的就是磷元素对水质的影响，调查发现，磷元素过多会使水富营养化从而产生水华破坏水中鱼类的生存环境导致大量鱼类死亡，所以我们今天想研究磷元素过多对鱼的细胞有什么影响，从而警醒人们关注水质安全不要过多施肥。 二、实验原理 草鱼是我国目前养殖产量最大的淡水鱼类之一，在人工养殖过程中，由于水质、饲料等因素易出现以脂肪性肝病为特征的营养性疾病。肝脏作为鱼体最大的解毒和营养代谢器官，在营养物质的消化吸收和保障鱼体健康方面起着重要作用。体外肝细胞分离和原代培养是研究肝细胞功能的有效方法，培养体系中的肝细胞可以很好的模拟体内肝脏的生理环境，用不同浓度的的磷化合物对其进行耐性实验，测试其生物活性。 三、实验器材 （1）设备 培养箱，超净工作台，倒置显微镜，高压蒸汽灭菌锅，低速离心机，冰箱，分析天平，细胞培养瓶8个，移液器，青霉素空瓶6个，血球计数板等。 （2）试剂 D-Hanks 液、PBS缓冲液、胰蛋白酶、牛跟腱胶原、10%胎牛血清、牛胰岛素、100 IU / mL 青霉素、100 μg / mL 链霉素，DMEM培养基，红细胞裂解液、细胞活性鉴别染液台盼蓝染色剂，不同浓度的磷酸溶液。 1：D-Hank’s液的配制称取KCl:0.1g，KH2PO4:0.03g，NaCl:4.0g，NaHCO3:0.175g，Na2HPO4`12H2O:0.04g，溶于双蒸水，混合均匀，定容至500ml，调节pH值7.0-7.4，高压蒸汽灭菌，4℃保存。 2：DMEM培养基的配制：血清的灭活：常用小牛血清，新鲜血清要在56℃水浴灭活30min，再经抽滤分装，即可加入培养基中；吸取配制好的青霉素、链霉素加入到50mlDMEM培养基中（不含小牛血清及双抗），再吸取5ml灭活的小牛血清和2ml 双抗加入培养基中混匀，小牛血清的含量为10%,置于4℃冰箱待用。 4：配置磷酸溶液母液，实验时候稀释成所需的浓度。 实验动物：市场售卖的鱼
病毒感染细胞实验整体流程和原理
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 慢病毒 原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 、腺病毒 原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到 1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 腺病毒包装简要流程 1）构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用 PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 、慢病毒和腺病毒的比较 2、构建目的基因到载体
高中化学实验装置图汇总情况
人教版高中化学实验装置图汇总（必修一） 章节名称实验名 称 实验原理 实验装置仪器药品清单备注 第一章第一节： 化学实验基本方法过滤 固体与液体混合物 的分离 仪器：漏斗、 烧杯、玻璃板、 铁架台（带铁 圈）、滤纸 药品：固液混 合物 操作要 点：“一 贴二低 三靠”蒸发分离溶剂中的溶质 仪器：蒸发皿、 酒精灯、玻璃 棒、铁架台 药品：食盐水 溶液 注意： 蒸发过 程中要 不断搅 拌，在 加热至 有大量 固体析 出时要 用余温
加热 蒸馏 混合物中各组分的 沸点不同仪器：蒸馏烧 瓶、酒精灯、 铁架台、冷凝 管、锥形瓶 药品：液体混 合物 加热前 一定要 检验装 置的气 密性 萃取物质在互不相容的 溶剂里的溶解度不 同，用一种溶剂把物 质从它与另一种溶 剂所组成的溶液里 提取出来 分液漏斗、烧 杯、铁架台(带 铁圈) 进行分 液操作 之前一 定要进 行检漏 第一章 第二节：化学计量在实验中的应用配制一 定量浓 度的溶 液 C=n/V 仪器：容量瓶、 量筒、烧杯、 玻璃棒、胶头 滴管、托盘天 平药品：氯 化钠固体、蒸 馏水 容量瓶 在使用 之前一 定要检 漏 第二章第一节：丁达尔 效应 当一束光线透过胶 体，从入射光的垂直 仪器：激光笔、 烧杯
物质的分类方向可以观察到胶 体里出现的一条光 亮的“通路” 药品：某种胶 体 第三章第一节： 金属的化学性质加热金 属钠 钠受热后，与氧气剧 烈反应，发出黄色火 焰，生成一种淡黄色 固体，过氧化钠 仪器：小刀、 铁架台（带铁 圈）、酒精灯 药品：金属钠 注意安 全 金属钠 和水的 反应 活泼金属和水的剧 烈反应 仪器：小刀、 烧杯 药品：蒸馏水、 金属钠、酚酞 注意观 察实验 现象 铝与盐 酸和氢 氧化钠 溶液的 反应 铝是两性金属，既能 和酸反应又能和碱 反应 仪器：试管、 架子 药品：盐酸溶 液、氢氧化钠 溶液 注意检 查生成 的气体 第三章 第二节：几种重要的金属化合过氧化 钠和水 的反应 过氧化钠可以与水 反应生成氧气 仪器：试管、 火柴 药品：过氧化 钠、蒸馏水、 注意检 验生成 的气体
体外细胞实验方法
细胞株在适当的培养基中保持10% FBS。 从Addgene(质粒)购买HA-FLAG-UCHL3。 #22564，然后再克隆到pGEX-4T-2载体(Clontech)中。UCHL3C94A和S75A突变体由位点定向突变层积产生)。抗uchl3抗体购自ProteinTech公司 (12384 - 1 - ap)。抗ub (P4D1)、抗rpa32 (9H8)、抗brca1 (D9)抗体购自Santa Cruz Biotechnology。抗rad51 (N1C2)是从GeneTex购买的。反 γH2AX(05 - 636),anti-BRCA2(OP95)和anti-MDC1(05 - 1572) 从微孔被购买。Anti-BRCA2(推上a303国道- 435 a)和 anti-γH2AX架a300型(- 081 a)从Bethyl购买实验室。抗53bp1 (NB100-304)购自Novus Biologicals。Anti-Flag(m2)、anti-HA anti-β-actin抗体 购买的σ。反磷（血清/thr）atm/atr衬底抗体（2851）是从细胞信号技术中购买的。 CRISPR / Cas9敲除 (sgRNAs)使用:sgUCHL3-1(5′-GCCGCTGGAGGCCAAT CCCGAGG-3′)和sgUCHL3-2(5′-GCCCCGAAGCGCGCCC ACCTCGG-3′)。gRNA序列被克隆到载体中。 LentiCRISPR-V2-puro。细胞被慢病毒感染 sgRNA-puro随后与2μg /毫升嘌呤霉素广泛的选择,和单一的克隆是通过连续稀释和放大。通过免疫印迹鉴定克隆 抗uchl3抗体，并通过DNA测序验证。 重组蛋白表达和下拉试验。 构建表达His-RAD51和GSTUCHL3蛋白的质粒，构建RAD51和UCHL3的编码序列 被亚克隆为pET-32a和pGEX-4T-2。为了产生重组蛋白，每个表达结构都转化为大肠杆菌BL21 (DE3)。总之,在LB培养基培养细菌在37°C到1.2(OD600)和冷却30分钟在冰上。然后细胞连续培养15 h在18°C添加0.8毫米isopropyl-b-D-hiogalactopyranoside之后(IPTG)。细胞 然后用超声波提取和裂解。细胞溶解产物 用16000g离心30min，得到的上清液与他的Mag Sepharose Ni (GE Healthcare)孵育，纯化His- rad51蛋白和GSH珠(Promega)，纯化 分别是GST和GST- uchl3蛋白。 体外GST-UCHL3拉试验,50μg重组GST和GST-UCHL3蛋白质绑定到谷胱甘肽珠子被5% BSA 在4°C 2 h其次是孵化与50μg His-UCHL3额外2 h在4°C。然后用不同盐浓度的NETN缓冲液冲洗5次。结合蛋白被筛选了1×SDSPAGE缓冲与加热10分钟在95°C。用单克隆抗his 抗体检测His-RAD51，用Coomassie blue染色GST-UCHL3 体内变性去泛素化实验和体外脱泛素化实验 对于体内去泛素化实验，控制U2OS细胞，UCHL3敲除U2OS细胞，或UCHL3敲除 U2OS细胞稳定表达HA-UCHL3野生型和突变Cys95阿拉巴马州(CA突变)在120年被细胞溶解μL 62.5毫米Tris-HCl(pH值6.8),2% SDS、10%甘油,20毫米NEM,1
(完整版)细胞实验技术
（一）干扰引物（shRNA）设计： 1、NCBI上下载基因序列 2、在sigema网站输入基因号设计一对21个碱基的干扰引物（上下游） 3、从起始密码（ATG）下游25bp开始； 4、GC含量介于40%~60% 5、干扰引物至少一个在SDS区，一个在3’UTR区 6、选择脱靶率低的 （二）、干扰载体构建 1、引物退火（引物加水看标签X 50,弹匀，瞬离） 退火体系： 上游：5ul 下游：5ul 10X M buffer 5ul H2O 35ul 水浴锅100℃2min，锅里隔夜 （三）、酶切plko.1载体 1、AgeI 酶切，反应体系： plko.1载体4ug AgeI 2ul 10X AgeI buffer 5ul H2O 39ul 37℃水浴2~3h 2、切胶回收AgeI 酶切产物，30ul 水洗脱 3、EcoRI酶切，反应体系： AgeI 酶切产物30ul EcoRI 2ul 10X H buffer 5ul H2O 13ul 37℃水浴2~3h 切胶回收，30ul 水洗脱，测浓度 （四）、连接 连接体系：T4连接： 退火引物2ul 退火引物5ul 酶切载体1ul 酶切载体1ul Solution I 5ul T4连接酶1ul H2O 2ul T4连接酶Buffer 1ul H2O 2ul 室温下连接4h。 （五）、转化 -80℃取感受态细胞于冰上融化，在1.5ml离心管加33ul感受态，将连接产物加入，冰上放置30min，42℃水浴60~90s，冰上放置2min，加入无氨苄培养基，37℃摇床1h，涂布在氨苄平板上，37℃，16h。 （六）、挑菌 用枪头挑取5个菌落（可送测序）扩大培养，加有氨苄的培养基，37℃过夜培养。 （七）、提质粒
细胞工程实验报告
原理，实验步骤或实验方法，实验结果与分析，注意事项，实验感悟 实验一培养基母液的配制 一、实验目的 通过配置MS培养基母液，掌握母液的配置和保存方法 二、实验原理 配置培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配置，即按培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配置即可。 三、实验材料、试剂和仪器设备 1.试剂 NH 4NO 3 ,KNO 3 ,KH 2 PO 4 , CaCl 2 ·2H 2 O ,MgSO 4 ·7H 2 O,FeSO 4 ·7H 2 O Na 2-EDTA,MnSO 4 ·4H 2 O,ZnSO 4 ·7H 2 O, , KI,CuSO 4 ·5H 2 O,CoCl 2 ·6H 2 O,肌醇，甘氨酸， 盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸，蒸馏水NAA,6-BA 2.仪器设备 电子天平，烧杯（50ml、100ml、500ml、1000ml）量筒（1000ml、100ml、25ml），容量瓶(1000ml、500ml、100ml)，试剂瓶，玻璃棒数支，药芍，称量纸等。 四、实验步骤 1 大量元素母液的配制 先用量筒称量适当蒸馏水放入500ml烧杯中，按照配方表中用量依次分别称取： NH 4NO 3 ,KNO 3 , KH 2 PO 4 , MgSO 4 ·7H 2 O, CaCl 2 ·2H 2 O，待第一种化合物完全溶解后再 加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液转移至500ml容量瓶中，用蒸馏水定容至500ml，然后转移至细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。 2 微量元素母液的配制 按照配方表中用量用电子天平依次称取MnSO 4·4H 2 O, ZnSO 4 ·7H 2 O H3BO3 , KI, Na 2 MoO 4 ·2H 2 O，CuSO 4 ·5H 2 O, CoCl 2 ·6H 2 O,按制备母液I的方法逐个 溶解，转移至容量瓶中，然后定容至500ml，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。 3铁盐母液的制备
细胞实验操作流程
细胞冻存、复苏及传代操作流程 1. 试剂与仪器： 1.1 试剂 PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022 胰蛋白酶-EDTA溶液：Gibco公司，货号15400054 100 mL； 青链霉素：Gibco公司，货号15140-112 100 mL； FBS：Gibco公司，货号10091-148 500 mL； DMEM （4.5g/L glucose）培养基：CORNING公司，货号10-013-CVR 500 mL；RPMI 1640 ：CORNING公司，货号10-040-CVR 500mL； DMSO：SIGMA公司，货号：D8418； PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022 1.2 仪器 生物安全柜： 离心机： 37℃恒温水浴箱： -80℃冰箱： 4℃冰箱： 荧光倒置显微镜： 37℃恒温培养箱： 液氮罐： 2、实验方法： 2.1 细胞冻存 配制含10% 体积DMSO的冻存培养液（90% FBS+10% DMSO或70%培养基+20%FBS+10%DMSO），冻存盒室温放置。 将正常生长的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6 cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入消化液体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离
心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬细胞，1mL分装于冻存管中，做好标记。 悬浮细胞收集细胞培养液于15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬，1 mL分装于冻存管中，做好标记。 将冻存管放入冻存盒中，放入-80℃过夜，第二天转入液氮中长期保存。2.2 细胞复苏 从液氮罐中取出冻存管，快速浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；从37℃水浴中取出冻存管，在安全柜中，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到15 mL离心管中（15 mL 离心管中已事先加入4 mL培养基）混匀，800 rpm，离心5 min，弃去上清液，加入含10%血清的培养液重悬细胞，根据离心后的细胞沉淀，将细胞培养在10 cm 皿或6 cm皿的培养皿中（一般选用6 cm皿）37℃培养箱静置培养。次日更换1次培养液，继续培养。 2.3 细胞传代 状态良好的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入胰酶体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入1-2ml培养基重悬细胞，吹打均匀后根据细胞生长速度1瓶传2瓶或1瓶传3瓶，补齐培养基（6cm皿加5ml，10cm皿加10ml）后放入37℃培养箱继续培养。 悬浮细胞在显微镜下观察，健康的细胞干净而透明，核清晰可见，静置培养时常见小细胞团。 ①若细胞状态好，培养基干净而无明显颗粒物沉淀，可直接1:2或1:3分瓶传代培养。 ②若细胞有碎片，培养基中颗粒物多，则需收集细胞培养液于15ml离心管中，600rpm离心5min，去上清，加入适量完全培养基重悬，轻柔吹打混匀后，根据细胞生长速度，1:2或1:3传代培养。 3、注意事项 1）细胞一旦染菌后直接舍弃并检查所有试剂耗材是否污染，如细胞样本非常
动物细胞培养技术实验教程内容
实验1 细胞培养概述 （一）细胞培养室的设置和无菌操作 【实验原理】 细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。一般标准的细胞培养室应包括配液室、准备室和培养室。三室既相互连接又相对独立，各自完成培养过程中的不同操作。 【实验目的】 ①了解培养室的设置和设备。 ②学习无菌概念和无菌操作要领。 【操作步骤】 1．实验室设置 （1）配液室 （2）准备室 （3）培养室 培养室内要完全密闭，保持恒定的温度，在设计上要注意以下几点： ①培养室的位置最好设在阴面，阳光不能直接照射的地方，防止室内温度增高。 ②天花板的高度不要超过2米，以保证紫外灯的有效杀菌效应， ③门一般用拉门，以防止空气流动。 ④天花板、地板和四周墙壁要光滑无死角，要镶瓷砖或涂油漆，这样设计，一是便于清洗和消毒，另外也不易在墙角堆积灰尘。 2．实验室常用设备 （1）准备室的设备 ①双蒸馏水蒸馏器：制备双蒸水。 ②酸缸：盛洗液，浸泡玻璃器具。 ③干燥箱：洗涤完的玻璃器皿用干燥箱烘干。 ④高压锅：玻璃器皿、解剖用具、部分液体、塑料器具等灭菌。不同物品其有效灭菌压力和时间不同。 ⑤储品柜1：放置未消毒物品。 ⑥储品柜2：放置已消毒物品。 准备室注意事项： ①预防蒸馏器被烤干。 ②勿将酸液溅到衣物或地面。
③勿将高压锅排气阀和安全阀堵塞。 ④已消毒物品应与未消毒物品分柜存放。 （2）配液室的设备 ①天平（扭力天平和电子天平）：称量用 ②pH计。 ③磁力搅拌器。 （3）细胞培养室的设备 ①超净工作台： 超净工作台的种类很多，有单面单人、单面双人、双面双人或双面四人等，其工作原理是利用鼓风机，使通过高效滤气的空气，徐徐通过台面，这样使工作环境中具无菌而均匀的空气。 根据层流方式的不同，超净工作台主要分为水平层流式和垂直层流式两种，基本原理大致相同，都是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器，由此送出的洁净气流从一定的均匀的断面风速通过无菌，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。但两种净化台的气流方向不同。 使用超净工作台应注意的几点问题： A．净化工作台最好安装在无尘的房间内，最好为隔离好的无菌间内，以免尘土过多易使滤器阻塞，降低净化效果，缩短使用寿命。 B．新安装的或长期未使用的工用台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作，再采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。 C．每次使用工作台时，应先用75%酒精擦洗台面，并提前以30~50min紫外线灭菌灯处理净化工作区内积累的微生物。在关闭紫外灯后应启动送风机使之运转两分钟后再进行培养操作。
细胞工程实验报告
细胞工程实验报告 专业：生物技术班级：0801 姓名：励丹学号：30804305 一、实验目的 1、了解动物细胞培养的相关实验器材以及实验前器材的清洗与消毒、无菌室灭菌与消毒等基本方法，以建立起无菌操作的概念。 2、了解和掌握动物细胞原代培养的基本方法，熟悉组织块法和消化法培养的基本操作过程。初步掌握无菌操作技术。 3、学习与了解细胞超低温冻存于复苏的基本原理，初步掌握培养细胞常规超低温冻存于复苏以及玻璃化超低温冻存于复苏的方法。 4、掌握ELISA测定抗体效价的方法，细胞的超低温冻存和复苏，及MTT法测定细胞活性的方法。 5、学习和掌握制备饲养层细胞的方法，为杂交瘤细胞的制备做准备。 6、学习从脾脏组织制备免疫细胞的方法，从免疫脾脏中制备免疫细胞悬液，用于杂交瘤细胞的融合。 7、学习和掌握动物细胞融合的基本方法，通过免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，并进行选择。 8、学会细胞形态的观察和分析，细胞技术等细胞培养中常见的问题。 二、实验原理 1、原代培养 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后直到第一次传代为止。原代培养首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织或器官，切成一定大小的组织块，直接或经消化分散成单个游离的细胞，在人工培养条件下，使其不断地生长、繁殖。 2、细胞活性测定——MTT法 MTT法是利用细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶四氮唑蓝还原成难溶的蓝紫色结晶——甲瓒，经二甲基亚砜（DMSO）溶解后，在490nm处测吸收值，其吸收值可间接反映细胞的活性状态及活细胞数量。 3、培养细胞的超低温冻存于复苏 为了保持细胞株（系）遗传的稳定性以及非连续使用细胞的长期保存，建立了细胞
细胞培养的流程
细胞培养的流程，从购买试剂、分装，到无菌操作、实验、观察的过程？ 对于新手来说，细胞培养真是太难了，很多的细节你不可能一下子就考虑到、预见到，因此请教细胞培养的高手就显得非常重要且可贵了。 细胞培养包括仪器的清洗、消毒灭菌，试剂的购买、配制、分装，细胞的分离，无菌操作，培养细胞的观察，实验的设计，及结果的分析等等。但这每一个过程的含金量都很高，要求非常严格。 如果你正在培养细胞，或曾经培养过细胞，你一定有很多的经验值得大家分享，你一定有你自己的一套培养细胞的流程，从哪开始到哪结束你也一定有太多的想说。因此，你不妨说说你的细胞培养流程，以便我们广大的细胞培养新借以一鉴。 于此，我先代表广大细胞培养新手谢谢各位园丁里的奉献者！ 有空整理一下再写写。。呵呵谢了先版主建议不错，我刚开始养细胞时遇到的各种困难可以说是不计其数了，解决困难耗费了大量地时间，可惜呀！ 养细胞是一项即有难度又很讲究技术的过程，作起来不易，要真正详细的写出来示人更难！书上的规范和标准很多，但作起来每人都有自己的方法，适宜就好。 我看还没有人跟帖，我就先说一点，从最初阶段开始：（自己的做法） （一）仪器的清洗 总的分为两大类：可泡酸的和不可泡酸消毒的。酸指消毒的清洁液（由浓硫酸、重铬酸钾和蒸馏水配置的次强酸液） 可泡酸的主要是玻璃仪器培养细胞的板子，离心管等塑料器皿。消毒过程：自来水冲洗3-5遍----→超声波清洗30′----→烘干----→濅入清洁液过夜（不少于6h）----→自来水冲洗15－20遍----→蒸馏水洗3-5遍，烘干备用。 不可泡酸的主要是胶塞和盖子，虑器等，先在清水中濅泡后冲洗烘干----→2%NaOH濅泡过夜，自来水冲洗，5%HCl濅泡三○min，流水冲洗----→蒸馏水漂洗----→烘干备用。 消毒好的器具一定找个干净的柜子保存，使用前高压消毒灭菌，我科室主要使用铝制饭盒分装器具，挺方便的，用前高压。 今天暂说一点，以后有机会再续，望给师弟妹们有所借鉴。斑竹不厚道，现在知道为什么没有别的战士跟贴了么？我怎么也耗了几十分钟打的字，你就这样打击别人的信心，还有可能往后面延续么！再说，经验何止这些这点...... 您的帖子我看见了，您的抱怨我也接受！并且跟您补上一分！ 每个斑竹给分的标准有一定的差别，但是可以肯定的是：我们有自己的加分原则，大原则是不变的！比如：版内讨论得很多的东西，重复发帖一般不予以加分！ 您的这个帖子属于改范畴！ 感谢您对细胞版的支持！如果有问题可以直接pm我们！ 再次感谢！再多说点啊！ 呵呵接着说呀，很好，很有帮助，我是新手，要多向你学习顶一下。我也说说我的一些体会吧。 1、首先说清洗： 对于玻璃器皿（如移液管、盖玻片之类）可先用酸液浸泡24h以上，再用清水浸泡24h。之后用清水将移液管冲洗10遍，除去残留酸液，再用双蒸水冲洗3-5遍，彻底洗净后放入不锈钢筒中，双层牛皮纸扎口，高压灭菌20min，烘干待用。我们实验室的酸液一般是次强酸液（重铬酸钾120g 浓硫酸200 mL 蒸馏水1 000 mL）配液时要小心烫伤。装培养基的瓶子则要在每次用完培养基以后就要立即洗净，临用时再次用清水冲洗3-5遍，再用双蒸水漂洗3次，洗净后瓶口盖上锡箔纸，外包双层牛皮纸扎口后高压灭菌20min，与其配套的瓶盖则洗净后另行包好同时灭菌、烘干。培养基过滤器灭菌同瓶子，也要在用完后及时洗净、
体外细胞培养
第一讲体外细胞培养的基本技术 ●体外细胞培养条件和基本技术 ●体外细胞培养 ●体外培养物的生长生物学 ●细胞系和细胞株 ●培养物的冷冻与复苏 ●培养物的污染、检测和排除 ●一、体外细胞培养条件和基本技术 体外细胞培养的优缺点 优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。 体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。 一、体外细胞培养条件 （一）、体外培养实验室 1. 准备室 2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。 3. 缓冲室 4. 其他实验室 （二）、体外培养的设备和器具 设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值 3. 倒置显微镜 4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器， 超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置 8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平 培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器， 针头式加压塑料小滤器 2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿 （4）多孔培养板（5）离心管 3. 移液器 4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网 （三）培养用液 ?水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS) 水：离子交换水，蒸馏水 平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖 常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks，Hanks ?培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液 2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等
分子克隆及细胞培养基本实验方法
分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）
①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应
《细胞生物学与细胞工程实验》
细胞生物学与细胞工程实验 课程编号：2511240 英文名称：Cell Biology and Cell Engineering 课程负责人：王昌留 师资队伍：王昌留、黄玲、李清、曲明娟、孙振兴 适用专业：生物科学 开课学期：秋季学期 课程类型：专业基础必修课 实验课性质：独立设课/非独立设课 先修课程：植物学实验/2511110、动物学实验/2580070、生物化学实验/2501040 总学时：理论学时实践学时 36 课外学时 总学分：1 采用教材及参考书： 1. 安利国主编：《细胞生物学实验教程》，科学出版社，2004 2. 杨汉民主编：《细胞生物学实验》第二版，高等教育出版社，1997 3. 李志勇：《细胞工程》第一版，科学出版社，2003 4. 徐承水，党本元主编：《现代细胞生物学技术》，青岛海洋大学出版社，1995 5. 王金发主编：《细胞生物学实验教程》，科学出版社，2003 内容简介： 本课程是一门理论性和技术性都很强的课程，是在学生已修完生物学、生物化学、细胞遗传学、细胞生物学与细胞工程、微生物学、免疫学基础上而设立的，是生物科学专业的必修课程。 本课程既包括细胞生物学基础实验又包括细胞工程综合实验，是一门对实验仪器要求较高的课程。开设本课程的目的是使学生掌握细胞生物学与细胞工程实验设备的操作方法，具备观察和研究细胞结构、功能与生命活动的基本方法，学会发现问题和解决问题的基本技能，为毕业后从事生物学相关的科研和教学工作奠定基础。 本课程考核成绩由平时成绩（占30%）、实验报告成绩（占30%）和终期考核成绩（占40%）三部分构成。 本实验包括的实验项目包括：
Seahorse-XF实验流程
Seahorse XF实验流程 （此为简略版实验流程，详细步骤参见培训手册） XF实验前一天 1.种细胞：将细胞接种到Seahorse XF细胞培养板中，在生长培养基中过夜培 养。注：细胞接种时间和培养时间可根据细胞处理要求进行选择。 2.预热仪器：打开Seahorse仪器和电脑，并打开软件，使仪器升温至37℃， 过夜预热。 3.> 4.水化探针：在Utility Plate中加入Seahorse XF校准液，将测试板放回 培养箱中过夜水化探针。 Utility Plate上，置于37℃无CO 2 XF实验当天 1.准备检测液：用Seahorse XF Base Medium配制检测液，加入所需要的底物， 将溶液加热至37℃，用NaOH调pH值至，过滤，置37℃水浴中备用。 注：检测液中所需要添加的底物及浓度取决于细胞类型和实验设计，或者与生长培养基保持一致。 2.】 3.观察细胞：将细胞板从CO2培养箱中取出，在显微镜下观察细胞状态。 培养箱4.细胞换液：将生长培养基换为检测液，然后将细胞放置在37℃无CO 2中1小时。 5.配药：根据试剂盒说明书，配制并稀释药物至所需浓度。 6.加药：将稀释好的药物分别加入测试板上的A，B，C，D 四个加药孔中。 注：根据实验设计选择所用加药孔数量。 7.\ 8.设计实验模板：用软件记录实验条件和设计实验程序。 9.上机：开始运行实验程序，将加过药的测试板和装有校准液的Utility Plate 一起放置到仪器托板上。 10.仪器自动校准探针。 11.换细胞板：当软件出现提示信息时，将Utility Plate换为细胞板。
12.实验完成时根据软件提示信息退出测试板和细胞板，并在显微镜下观察细胞 状态。 13.数据分析：采用wave软件和report generator对实验数据进行分析。