农杆菌介导的植物基因转化研究进展
#综述进展#农杆菌介导的植物基因转化研究进展
Progress of Plants Genetic Transformation by Agrobacteriu m
王景雪孙毅
Wang Jingxue Sun Yi
山西省农业生物技术研究中心,太原030031
T he Ggr o-Biotechnology Center of Shanxi P rovince,T aiyuan030031
摘要:农杆菌介导的植物基因转化是当今植物基因转化的主要方法之一,因而深受关注。本文从农杆菌介导的基因转化机理,植物对农杆菌侵染的反应,转基因植物的遗传表达,以及农杆菌对单子叶植物的转化等方面论述了该领域的最新研究进展,并提出了进一步研究的方向。
关键词:土壤农杆菌;基因转化;遗传表达
Abstract:T he transformation mediated by A grobacter ium is an important approach in plant improvement,and the field is concerned by many scientists.T his paper discussed r ecent prog resses in A gr obacter ium transfo rmat ion mechanism,plant response to the infect ion of A grobacter ium,the ex pression of foreign genes in tr ansgenic plants and monocotyledonous species transformation by Ag robacter ium.T he problem which need further inv est igation w as also di scussed.
Key words:Agrobacterium;gene transformation;gene expression
植物基因转化是利用分子生物学和基因工程技术将外源基因插入到受体植物的基因组,并使其在后代植株中得以表达的过程。本世纪70年代初分子生物学研究领域取得的一系列重大进展,为植物基因转化奠定了基础。1974年,人们发现根癌农杆菌在感染植物时,可将其中环状的Ti质粒上的一段DNA插入植物基因组中,引起植物遗传特性的变化。从此,人们开始尝试利用这种天然的载体系统,将外源基因导入植物细胞,并利用植物细胞的全能性,借助于细胞培养或组织培养技术,使转化细胞垌生成完整的转基因植株,从而实现外源基因对植物的遗传转化。1983年获得了第一例转基因植物。1985年,Horsh等人首创叶盘转化法,使得转化过程大为简化。此后,植物基因转化的研究得到了迅速发展[1]。目前,已有百余种转基因植物问世。在众多的转基因植物中80%是由农杆菌介导转化的[1]。目前农杆菌已成为植物基因转化的首选方法。过去人们一直认为农杆菌介导的基因转化受农杆菌宿主范围的限制,仅仅局限于大多数双子叶植物。然而,近年来,由于在载体系统和转化方法研究上的进展,农杆菌已在转化水稻、玉米、小麦、石刁柏等单子叶植物上取得了成功[2~6]。本文旨在介绍这些研究的最新进展,并从农杆菌和受体植物以及它们之间的相互作用等方面讨论转化过程中的一些问题,以期为建立最佳的植物基因转化系统提供依据。
1农杆菌介导的基因转化机理
农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌。现已发现,与植物基因转化有关的有两种类型:一为根癌农杆菌(Agrobacter ium tumef aciens),它含有Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤;二为发根农杆菌(agr obacter ium rhizogenes),它含有Ri质粒,能够诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根。
Ti质粒(包括Ri质粒)上有一段转移DNA (transfer DNA,又称T-DNA),在农杆菌侵染植物时,这段DNA可以插入到植物基因组中,使其携
)
7
)
带的基因在植物中得以表达。由于T-DNA能够进行高频率的转移,而且Ti质粒和Ri质粒上可插入大到50kb的外源基因。因此,T i质粒和Ri质粒就成为植物基因转化的理想载体系统。
1.1T-DNA转移机理
T-DNA转移是指T i(或Ri)质粒上的转移DNA被加工、切割、复制、越过细菌膜以及进入植物细胞并整合到植物基因组的全过程。
植物基因转化必须有Ti质粒上T-DNA和vir 基因即毒性区两部分的参与。
1)T-DNA
T-DNA可以将其携带的外源基因整合到植物基因组中。但T-DNA上的基因与T-DNA的转移与整合无关。T-DNA上较重要的是T-区两端左右边界各为25bp的重复序列。其中14bp是中心,分10bp和4bp两组,是完全保守的。这两个边界是T-DNA转移所必需的。其中尤以右边界最为重要。胭脂碱(Nopaline)型农杆菌菌系的Ti质粒上为单一的T-DNA。只有左、右各一个边界序列。在章鱼碱(Octopine)型菌系的T-DNA上则有四个边界序列,将T-DNA右边界的右侧约17bp以外有一个24bp的超驱动序列,为有效转移T-DNA 所必需,起增强子作用。将其置于25bp边界序列的上游或下游,直到离边界6kb仍有促进T-DNA转移的作用。
2)vir基因
与转化有关的基因包括农杆菌染色体基因和T i质粒上的v ir基因[1,7~9]。染色体基因包括Ch-vA和ChvB,att,pscA,ChvD以及ChvB。它们大多编码一些膜相关蛋白,负责使细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。ChvD可能在低pH和磷酸饥饿情况下提高VirG蛋白的合成水平。ChvE与VirA蛋白共同对VirG起激活作用。Ti质粒的vir区大小为30kb,分Vir A、B、C、D、E、G、H等7个操纵子,一共有24个基因共同控制着T-DNA的加工和转移,它们总称调控子。
vir基因的活化转录是在接受了植物细胞产生的创伤信号分子后开始的。首先是VirA基因的活化。V irA是一种结合在膜上的化学受体蛋白,可直接对植物产生的酚类化合物感应,其感应部位可能位于胞质域。VirA蛋白的胞质域有自激酶的功能,可在保守的组氨酸残基上,从而使VirG蛋白活化。VirG蛋白是DNA结合活化蛋白,可以二体或多体形式结合到vir启动子的特定区域,从而成为其它vir基因转录的激活因子,打开VirB、C、D、E、H等几个基因。
3)T-DNA复合物的跨膜转移
激活了的VirG蛋白与各v ir基因5.端非转录区的/毒性盒0序列相结合,启动各毒性区的转录, vir区组成T-DNA复合物向植物细胞转移的膜通道。V irD1作为拓扑异构酶与VirD2协同在T-DNA两未端序列处通过缺口剪切,将T-DNA从Ti质粒上剪切下。在章鱼碱型菌系中这一过程需要VirD2右端序列外侧的增强驱动序列结合,帮助缺口的生成。然后,VirD2与T-DNA链结合。新的T-DNA底链以上链为模板,从右端产生的DNA缺口处由5.)3.方向进行合成。被取代的旧链游离出来,与许多E2蛋白分子结合组成T复合物。合成的T复合物经过VirB区蛋白组成的膜通道,以类似于细菌转导过程的方式注射到植物细胞内,并在VirD2和VirE2的亲核序列引导下,以VirD2为先导向植物细胞核运动。Vir基因和T-DNA可以位于同一个质粒上,也可以位于不同的质粒上。
1.2农杆菌T i质粒载体系统
目前,人们已经构建成了若干种能应用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统。所有这些系统都包括了两个基本要素。第一,组成一个重组的质粒载体。它含有T-DNA的边界序列,而且这个质粒还能够在大肠杆菌和农杆菌之间进行穿梭。这是由于Ti质粒是一个大质粒,很难在其上进行普通的基因克隆操作,必须使用一种中间载体质粒,在大肠杆菌上进行普通的基因操作,连接上外源基因,然后转移到土壤农杆菌中,与相应的Disarmed Ti质粒共同作用组成一个完整的Ti质粒载体系统。第二,作为载体系统的质粒及农杆菌株必须含有完整的vir基因[10]。
目前,在植物基因转化中应用最多的Ti质粒载体系统有共整合载体系统和双元载体系统。共整合
)
8 )
载体是指T i质粒上编码致瘤基因的序列被一段pBR322DNA所取代,带外源基因的pBR322衍生中间载体由大肠杆菌转入农杆菌后,二者相同的pBR322序列发生同源重组,外源基因就此整合到disarmed Ti质粒上。双元载体系统是指在一个农杆菌株系中含有两个彼此分离的质粒。一个质粒含有T-DNA和外源基因重组的多功能克隆载体质粒。它既能够在大肠杆菌中复制,又能在农杆菌中进行复制,并能够从大肠杆菌迁移到土壤农杆菌中。另一个质粒是含有vir基因的T i衍生质粒,如pGV2260。近年来,科学家又构建出了一种超级双元载体(Superbinary vector),主要用于农杆菌对单子叶植物的转化。
2植物对农杆菌侵染的反应
植物在受到带有外源基因的农杆菌侵染后,能否实现外源基因的转化,还要取决于植物受体系统的反应,这种反应主要表现在两方面:创伤反应及v ir基因活化;及细胞的感受态。
2.1创伤反应及vir基因活化
T-DNA的转化是随着细菌进入植物伤口开始的;创伤反应对于转化是必要的。大多数双子叶植物组织在受到创伤后,诱导植物细胞分泌某些酚类物质,这些酚类物质即成为创伤信号分子或创伤诱导分子。农杆菌对这些酚类化合物具有趋化性,而且这些酚类化合物还作为创伤诱导分子诱导农杆菌vir基因活化及表达。据报道,它们是一类分子量低于1000的小分子酚类化合物,对冷、热处理稳定,部分疏水,虽然能耐极度的pH,但对诱导vir基因活化而言,则需pH低于6.0[10]。1985年Stachel 等人从代谢活跃的烟草根、叶及愈伤组织的提取物中分离得到乙酰丁香酮(acetosyringone,简称AS),羟基乙酰丁香酮(ahy drox yacetosy ringone,简称OH -AS),并证明它是vir基因的天然诱导剂[11]。
农杆菌vir区基因在接受植物细胞产生的创伤信号分子后转录活化,首先激活VirA基因。AS是亲脂化合物,很易在细菌的内膜中积累。酚类化合物对vir基因的诱导反应主要部位是在VirA蛋白中靠近第二跨膜区的第283~323氨基酸区段。另外,植物酚类化合物,包括儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、对羟苯甲酸、3,4-二羟苯甲酸、香草醛等都能刺激vir基因的活性[1,12]。Zerback等(1989)在矮牵牛的花粉提取物中发现黄酮类化合物-堪非醇3-葡糖基半乳糖苷及栎皮酮3-葡糖基半乳糖苷,对vir基因具有弱诱导作用[13]。M orris(1990)发现在桉树中,木质素的前体松柏苷可被农杆菌的葡糖苷酶水解成为松柏醇,成为vir基因的诱导剂。试验证明,芥子酸也具有对vir基因的激活作用[14]。
某些转录抑制剂如放线菌酮(戊二酰)、亚胺环酮(Cyclohex iuinde)能抑制vir基因的活化。有试验表明,如果植物细胞首先与放线菌酮共培养,则后来v ir基因活化被明显抑制。农杆菌v ir基因的诱导要求植物细胞具有活跃的新陈代谢,坏死的植物细胞则不能诱导vir基因活化。用vir基因活化诱导物或双子叶植物如马铃薯的伤流液处理,已使许多植物如金鱼草、拟南芥、白菜型油菜、大豆、烟草、番茄、水稻、玉米、小麦、甜菜、白三叶草、猕猴桃等的转化频率提高[15~25]。Veluthambi等(1989)报告,在农杆菌侵染时用AS或AS+nopaline处理棉花受伤的顶端分生组织提高了转化效率[26]。James等(1993)在苹果叶片转化中同时加AS及渗透稳定剂甜菜碱或脯氨酸,促进了GU S基因的表达21]。除了vir基因的活化物以外,低pH值的培养基,低磷酸盐和合适的碳源将有利于T-DNA的转移[1,17]。
2.2植物细胞对农杆菌侵染的感受态
自1985年H orsch等人首创叶盘法转化成功后,应用于基因转化的外植物体种类迅速增加。综合文献资料表明:叶片(叶柄)、茎(花茎、匍状茎)、子叶(子叶柄)、下胚轴(上胚轴)是目前应用最成功的外植物体材料,分别占文献报道的35%、17%、9%和10%[27]。
不同植物种所要求的外植物体种类不同。同一物种中,不同的外植体会有不同的转化效果。在苜蓿属的M.var ia中,试管苗叶片的转化频率比叶柄高出4倍[28]。在拟南芥中,不同的生态型和外植体以及菌株之间都表现出转化频率上的差异。Schlappi和Hohn(1992)用农杆菌感染三个玉米品系不同发育时期的幼胚时发现,幼胚中分生组织尚未分化时,农杆菌不能侵染;当幼胚开始分化第1~ 2小叶时,侵染率为7%~32%;授粉后14~16天的幼胚,侵染率为32%~73%[29]。所有这些差异都
)
9
)
表明:植物细胞对农杆菌的侵染存在一个感受态。
植物细胞的感受态是指植物细胞转化时易于接受外来遗传住处的一种状态。毫无疑问,植物细胞的感受态与转化频率直接相关。一个成功的转化是植物与农杆菌共同作用的结果,植物细胞处于对农杆菌良好的感受态时,才能有效地接受外源DNA 并使其得以整合和表达。Potry kus认为,只有在对农杆菌具感受态细胞中才能得到转化植株,而创伤反应是感受态细胞存在的前提条件。植物细胞的感受态还与植物激素以及Ca2+有关。植物激素是信息传递的第一信使,其功能的发挥还有赖于第二信使Ca2+的参与。张根义等(1997)的研究表明,在植物转化时,适当的生长素和细胞分裂素处理将使植物细胞的感受态增强;而高浓度的Ca2+则大大提高了转化率[30]。
M ukhopadhy ay A.等(1992)年发现,在用农杆菌侵染Brassica camp estris时发现下胚轴作外植物体时得到7%~13%的转化率,而子叶作外植体时却未得到真正的转化幼苗[31]。我们用农杆菌转化芥菜型油菜Brassica j uncea时发现子叶和下胚轴虽然都能得到转化的幼苗,但由下胚轴得到的幼苗却比由子叶得到的幼苗较难生根。
3转基因的遗传表达
3.1外源基因在植物体内的整合
分子杂交结果表明,T-DNA在植物染色体中的整合是随机发生的,既可以单拷贝方式整合,也可以多拷贝方式整合。T-DNA的整合虽然是随机发生的,但有许多研究表明,T-DNA优先整合到转录活跃区,这可能是由于这些区域易解开并易被切割,因而与处于紧密螺旋状态的转录不活跃区相比之下更有利于T-DNA整合。而且T-DNA整合到转录活跃区后,有利于T-DNA上基因的表达,在选择上占优势[32,33]。
T-DNA的整合模型:Gheysen等(1991)提出的T-DNA整合模型,主要以T-DNA与植物靶DNA联合复合体上少量碱基配对,并在连接处以DNA修复为基础。其过程为,1植物细胞通过各种途径在靶DNA处形成缺口。oT-DNA接近靶DNA的缺口,其两端通过少数几个同源碱基同缺口处的单链靶DNA配对,形成一异源双链区,两个配对区彼此靠得很近,位于配对区中间的T-DNA突出成环状结构;?T-DNA配对区外两个突出的单链尾巴被切去。T-DNA右边界5.端与v irD蛋白相连,整合时,碱基不被切去或切去很少,直接与植物DNA相连。而T-DNA左边界则有较大变化,T -DNA左边界切去片段的长短取决于同靶DNA配对的左侧同源区的位置,如接近左边界的碱基同靶DNA配对,切去就少。若远离左边界的碱基同靶DNA配对,切去就多;?T-DNA同靶DNA未端连接;?在靶DNA的另一条链上切割,产生一游离3.末端,以此3.端为引物,T-DNA链为模板,在DNA聚合酶的催化下合成T-DNA第二链[32]。而M ayerhofer等(1991)认为:T-DNA整合时,可在植物靶DNA处造成29-73bp的碱基缺失[33]。T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA 位点的识别具有重要作用[33]。
3.2转基因植株的遗传行为
分子杂交结果证明,在农杆菌介导的转基因植株中,外源基因的拷贝数大多为1~5个左右,但也有高达几十个的报道。一般在同一个转化事件中,单拷贝的转基因植株约占总转基因植株的一半以下。小麦中大约有35%的转基因植株是单株贝[4]。与基因枪法介导的植物遗传转化相比,农杆菌法可获得较多的单拷贝转基因植株。转基因植株的遗传传递行为符合孟德尔的遗传规律,单拷贝转基因植株后代的遗传分离比一般为3B1,而多拷贝转基因植株的遗传行为有时表现为多基因的分离比,有时由于多拷贝造成转基因失活而表现为不规则的分离。
3.3影响转基因表达的主要因素
1)表达载体的表达效率
转基因植物外源基因的表达直接受表达载体的表达效率影响。为了提高表达载体的表达效率,人们对基因调控序列的研究不断深入。目前,对表达载体的研究主要集中于以下几个方面:
1选择强启动子和非组成型启动子。在不同转基因植物中,来源不同的启动子表达效率有明显差异,通常来自于单子叶植物的启动子,在单子叶植物中的表达效率比在双子叶植物中高得多,反之亦然。Actin、U bi和Emu启动子在单子叶植物中的表达效
)
10 )
率远高于双子叶植物;而35S启动子在双子叶植物中的表达效率远高于单子叶植物。这可能是由于单、双子叶植物基因表达的分子机制有所不同,也可能是两者在转录因子和启动子序列识别方面有差异。非组成型启动子在特定条件诱导下,或在某些器官组织中特异性地启动目的基因的表达。这类启动子避免了外源基因持续表达所造成的细胞能量的浪费和由此造成的对细胞正常生理活动的干扰。
o利用内含子增加启动子的表达效率
有研究证明,在启动子和报告基因之间插入单子叶植物基因的内含子可提高基因在单子叶植物中的表达效率[34]。如Cheng等(1997)利用35S启动子和H SP70内含子构建的农杆菌表达载体在小麦上得到了高达4.3%的转化频率[4]。另外,在启动子附近插入增强子也能提高表达效率[35]。
2)拷贝数
大多数转基因失活都涉及多拷贝的转基因。这可能是由于重复顺序之间通过异位配对造成染色体构型的变化。这种变化的结果之一是重复顺序位置染色质发生收缩,从空间上阻碍了转录因子与转基因的接触,使基因处于关闭状态[36]。
3)DNA甲基化修饰
多拷贝的转化易发生DNA的甲基化修饰,甲基化修饰的位置仅限于转基因本身,并不扩散到转基因两侧低位甲基化顺序。在细胞中可能存在某种识别外源DNA插入顺序,并对其加以修饰的机制。
植物体内通常有20%~30%胞嘧啶是甲基化的,农杆菌内T-DNA的胞嘧啶也有0.5%是甲基化的。外源基因可以在体外甲基化,因而在转入植物体后表达力降低;其转入植物后也可能被甲基化,从而影响表达。甲基化程度与基因有关。在用gus 和np tò基因转化马铃薯时发现,gusA基因的启动子和结构基因都有甲基化,GU S活性在不同转基因植株中差别很大;而np tò基因则无甲基化,不管是否加kan进行选择,产生的转基因植株都抗kan,说明gus比nptò更易被甲基化[37]。
4)转基因对非转基因性状的影响
转基因往往具有多效性,对转基因植物中的非编码性状有影响,patatin启动子驱动的GUS基因可使转基因马铃薯的薯块重量增加。转基因植物存在体细胞变异,组培引起体细胞变异是常见现象。所转基因也能与其它基因发生相互作用,从而引起性状变异。
4农杆菌与单子叶植物转化
农杆菌对植物的有效转化取决于两个条件:第一,农杆菌能否将T-DNA转入植物细胞;第二,植物感受态细胞的存在。大多数双子叶植物具有明显的创伤反应,能够满足以上两个条件,从而使转化易成功。大多数单子叶植物和极少数的双子叶植物不具有明显的创伤反应,农杆菌对这类植物转化的可能性一直是一个探讨的热点[6]。1农杆菌转化单子叶植物的一个障碍可能来自于vir基因的诱导,主要是由于缺乏创伤反应,细胞伤流液中不含有vir 基因诱导物。虽然Usam i等(1988)发现,在小麦和燕麦的细胞伤流液中含有多酚类物质,但是这些物质由于具有相对比较高的分子量和亲水性而不同于先前发现的vir基因的诱导物[10]。Sahi等(1990)发现,玉米幼苗合成的一种叫DIM BOA(2,4-dihy-droxy-7-methoxy-2H-1,4-benZOxazin-3 (4H)-one)的物质能够抑制农杆菌生长和抑制由AS诱导的v ir基因活化[10]。o影响农杆菌转化单子叶植物的另一个因素是能否富集感受态细胞。这主要靠对农杆菌菌株和植物基因型进行大量筛选,也许可以找到适合某种菌株的基因型并由此产生一些感受态细胞或者是通过寻找某一特定器官在发育过程中某一特定时期所产生的感受态细胞。所幸的是,近年来,农杆菌对单子叶植物的转化已取得了可喜的进展,现已在水稻、玉米、小麦等植物上获得了转基因植株。这引起成功的转化可主要归结为:1在用农杆菌进行共培养时加入vir基因活化剂,如AS,OH-AS,双子叶植物伤流液等[25,12];o筛选例行的农杆菌载体,特别是采用超级双元载体系统。共培养时对菌的浓度有较为严格的限制,过高、过低都不能进行有效转化;?对外植体进行选择,大都采用某一个发育阶段的未成熟胚进行转化,而且胚的大小有较严格的限制。如玉米胚的大小为2.0~ 2. 5mm,菌浓度为1.0@108cfu/mL,大于5.0@ 109cfu/mL和小于1.0@107cfu/mL,均不能得到转化植株,?选择合适的基因型和培养基。
5结论
)
11
)
农杆菌介导的植物遗传转化虽然已成为当今植物遗传转化的主流,但仍需对一些问题做进一步研究。
1)基因型的依赖性
转化频率与植物的基因型具有很大的关系,即使在转化频率比较高的植物中(如马铃薯、烟草、拟南芥等)也有很大的基因型依赖性。
2)宿主范围的限制
对单子叶植物尤其是禾谷类作物的转化仍受到限制。
3)农杆菌与受感染植物之间的相互作用
农杆菌与受感染植物之间相互作用产生的过敏反应导致感染部位褐化或坏死,从而影响转化效率,如芸苔属作物。
4)可再生细胞部位与转化感受态细胞部位不一致,导致假转化体的出现和转化效率降低。植物外源基因导入对于研究植物的发育调控及农作物的遗传改良具有重要的意义,因而在短短的十余年间取得了重大的进展。转基因植物的数量与日俱增,农杆菌介导的植物基因转化方法也已有很大发展。许多转基因植物都已经或正在进入田间试验阶段,转基因抗虫棉、抗虫玉米、抗病小麦等已经在商业化生产。利用基因工程解决农业生产的难题已为时不远。相信随着我们的不断努力,基因工程将会为农业生产作出应有的贡献。
参考文献
1傅荣昭,孙勇如,贾士荣主编.植物遗传转化技术手册.北京:中国科学技术出版社.1994
2Chen M,cheng H,Ho S,et al.Pl ant M ol Biol.1993,22:491~ 506
3Ishicla Y,Saito H,Ohta S,et al.High effi ciency transformation of maize(Zea mays L.)medi ated by Agrobacterium tum efaciens.Na-ture Biotechnology,1996,14:745~750
4Cheng M,Fry J,Pany S,et al.Genetic Transformation of w heat M edi ated by Agrobacterium tumefaciens.Plant Physiol,1997, 115:971~980
5M ahalakshmi A,Khurana P.Agrobacterium-mediated gene deliv-ery in varions ti ssues and genotypes of w heat(Triticum aesti vum L.).Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology,1995,4
(2):55~59
6陶余敏,唐锡华.农杆菌转化单子叶植物的可能性及问题.植物生
理学通讯,1992,28(6):402~406
7顾红雅,瞿礼嘉,明小天等编著.北京:植物基因与分子操作.北京大学出版社.1995
8夏英武,吴殿星,舒庆尧.农杆菌T-DNT介导的植物转基因的分子机制.生物学杂志,1994,(5):7~12
9李宝健,曾庆平.植物生物技术原理与方法.湖南科学技术出版社.1990
10Kung,Shain-dow n,Wu Ray.T ransgenic plants.Academic Press,In c.1996.
11Stachel S,M essens E,M ontagu M,et al.Identification of the sig-nal molecules-produced by wounded plat cells that activate T-DNA transfer i n Agrobacterium tumefaciens.Nature,1985,318: 624~629
12许耀,贾敬芬,郑国倡.酚类化合物促进根癌农杆菌对植物离体外植体的高效转化.科学通报,1988,(22):1745~1748
13Zerback k,et al.Plant Sci,1989,62:83~91
14M orris JW,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:3614~ 3618
15Sheikholes lam S,W eeks D.,Acetosyringone promotes high eff-i ciency transformation of Arabidopsi s thaliana explants by Agrobac-terium tumefaciens.Plant M ol Biol.1987,8:291~298
16M athew s H,Bharathan N,et al.J Plant Physi ol,1990,136:404 ~409
17Godw i n I,Todd G,Ford-Ll oyd B,et al.T he effects of acetosy-ri ngone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species.Plant Cell Reports,1991,9:671~675 18Holford D,Hernandez N,New bury H.Factors influencing the ef-ficiency of T-DNA transfer duri ng co-cultivati on of Antirrhinum majus w ith Agrobacterium tum efaciens.Plant Cell Rep,1992,11: 196~199
19Joao K,Brow n T.Enhanced transformaiton of tomato co-cult-i vated w ith Agrobacterium tumefaciens C58CIRif J pGS FR1161i n the presence of acetosyringone.Plant Cell Rep,1993,12:422~ 425
20Janssen B,Gardner R.The use of transient GUS expression to de-velop an Agrobacterium-medi ated gene trans fer system for k-i wifruit.Plant Cell Rep,1993,13:28~31
21Jam es D,Uratsu S,Ch eng J,et al.Acetosyruingone and osmopro-tectants like betaine or proline synergistically enhance Agrobacter-i um-mediated transformation of apple.Plant Cell Rep,1993,12: 559~563
22Jacq B,Lesobre U,Sangw an-Now eel B,Factors i n fluencing T-DNA transfer in Agrobacterium-mediated transformation of sug-arbeet.Plant Cell Rep,1993,12:621~624
23Sarmento G,Alpert K,T ang F,et al.Factors influencing A-grobacterium tumefaciens mediated transformation and expression of kanamycin resis tance in pickling cucumber.Pl ant Cell T i ssue
)
12 )
and Organ culture,1992,31:185~193
24Voisey C,W hite D,Dudas B,et al.Agrobacterium mediated transformation of w hite clover using direct shoot organogenesis.
Plant Cell Rep,1994,13:309~314
25Atkinson R,Gardner R.Regeneration of transgenic tamari llo plants.Plant C ell Rep,199312:347~351
26Veluthambi K,Krishnan M,Gould J,et al.Opi nes stimulate in-duction of the vir genes of the Agrobacterium tuinefaciens Ti plas-mid.J Bacteriol,1989,171(7):3696~3703
27贾士荣,曹冬孙.转基因植物,植物生理学通讯,1994,30(4):306 ~312
28Chabaud M,Passiatore J,Cannor F,et al,Parameters affecting the frequency of kanamycin resis tant alfalfa obtained by Agrobac-terium tumefaciens medi ated transformation.Plant Cell Rep, 1988.7:512~516
29Schlappi M,and H ohn https://www.360docs.net/doc/6f11388270.html,petence of immature maize embryos for Agrobacterium-mediccted gene transfer.The Plant Cell, 1992,4:7~16
30张根义,徐武,李鸣等.植物细胞感受态研究初探.农业生物技术
学报,1997,5(1):100~102
31M ukhopadhyay A,Arumugam N,Nandekumar P,et al.Agrobac-terium-mediated genetic transformation of oi laeed Brassica campestris:transformation freqnency is strongly influenced by the mode of shoot regeneration.Plant Cell Reports,1992,11:506~ 513
32徐明良,杨金水,葛扣麟.植物转基因的整合机制.植物生理学通讯,1996,32(3):234~240
33M ayerhofer R,Koncz-Kalman Z,Naw rath c,et al,T-DNA i n-tegrati on:a mode of i llegitimate recombination in plants.T he EM-BO Journal,1991,10(3):697~704
34Luehrsen KR,Walbot V.Intron enhancement of gen e expression and the splicing efficiency of introns in maize cells.M ol Gen Genet,1991,225:81~93
35李润植.应用于转基因作物的启动子元件.山西农业大学学报, 1996,16(3):15~18
36杨金水,王光清.植物转基因的失活与沉默.生物工程进展, 1995,15(3):41~45
37Ottaviani M,Smits T,et al.Plant Science,1993,88:73~81
)
13
)
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化 一、目的要求 通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。 二、基本原理 农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。 三、材料及方法 1.含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。 2.植物幼苗。 （一）细菌培养液直接浸染法 操作︰ （1）无菌受体材料的准备︰叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。取自无菌试管苗。 取自田间或温室栽培植株︰叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。 （2）受体材料预培养︰将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、睫切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下︰预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。 （3）农杆菌培养︰从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD600 为0.6～0.8。 取OD600 为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD600 为0.2～0.5 时即可用于转化；或同时加入100～500μmol/的AS； （4）侵染︰于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）。取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。 （5）共培养︰将侵染过的外植体接种在愈伤组织诱导或分化培养基上（烟草为MS 十 IAA0.5mg/L + BA2.0mg/L) ，在28℃暗培养条件下共培养2～4 天（光对某些植物的转化有抑制作用，故需暗培养，共培养时间因不同植物而异）。
植物基因转化常用方法
一. 植物遗传转化的方法 植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。 二.农杆菌介导的基因转化方法 （一）农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制 几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香 酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti质粒上的一段T－DNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T－DNA结合，形成复合物，转化植物根部细胞。T－DNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生长必需的物质。 1. Ti质粒的结构 在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质是Ti质粒后，Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。 Ti质粒大约在160～240kB之间。其中T-DNA大约在15kb-30kb。Vir基因区在36kb 左右。除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。 T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。 tms由两个基因组成：tms1（iaaM）和tms2（iaaH） tmr由一个基因组成iptz： tmt由若干基因构成，合成稀有氨基酸衍生物，称为opines。它有三个成员： octopine＝精氨酸与丙酮酸的缩合物 Napaline＝精氨酸与－酮戊二酸的缩合物 Agropine＝谷氨酸与二环糖的缩合物 据此可将Ti质粒分为三大类，感染的植物诱导合成这些有机碱，但不能利用它们，其分解酶基因在Ti质粒上，分解产物为氨基酸和糖类，供根癌农杆菌使用作为氮源及碳源。
农杆菌介导转化法的概述
农杆菌介导转化法的概述 自从1983年转基因植物诞生以来，植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，通过各种方法转移到植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。[1] 目前，应用于植物转基因较多的方法有基因枪轰击法和农杆菌介导法。由于基因枪轰击的随机性，容易出现突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定表达的缺点，而农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统,外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定，是最常用的转基因技术[2]。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化法在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。本文对农杆菌介导转化法进行综述。 1 关于农杆菌 农杆菌[3-5]是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。与植物基因转化有关的有根瘤农杆菌和发根农杆菌这两种类型。 1.1根癌农杆菌 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含有Ti质粒，能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤，即诱发冠瘿瘤；Ti质粒是农杆菌染色体外的遗传物质，为双链共价闭合环状DNA分子，大小约200-250kb。 依据Ti质粒诱导的植物细胞产生的冠瘿碱的种类不同，根癌农杆菌可分为4种类型：章鱼碱型（Octopine）、胭脂碱型（Nopaline）、农杆碱型（Agropine）和琥珀碱型（Succinamopine）。 原始的Ti质粒根据其功能的不同可分为4个区： 1.1.1T-DNA区(Transfer—DNA region)：不同来源的菌株，T-DNA的长度在12~24 kb，它是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关．T-DNA上最重要的是T-DNA区两端的边界各为25 bp的重复序列．其中14 bp 是完全保守的，分10 bp(CAGGAATATAT)和4 bp(GTAA)不连续的2组．左右2个
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定 〖实验目的〗 1．了解创建烟草突变体库的方法； 2．理解每种方法的基本原理； 3．掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。 〖实验原理〗 随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成，在此基础上开展功能基因组的研究是目前的核心研究内容之一。植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容，在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。在创制突变体的策略上，传统方法是使用物理或化学诱变方法获得，其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。与传统的物理和化学诱变方法相比，生物诱变(T-DNA和转座子插人诱变)通常可标记突变基因，从而较为容易地分离鉴定靶基因。最近数年，通过农杆菌介导的T-DNA插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一。 烟草是植物基因组研究的一种模式植物，其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中的重要内容，其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能。突变体的创制是遗传学研究的基础，也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。通过诱导培养，使烟草产生愈伤组织，利用土壤农杆菌感染愈伤组织，实现T-DNA标签在烟草愈伤组织基因组中大量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株，获得各突变体的纯合材料，从而建立烟草突变体的数据库，然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析（图实验4-1）。 T-DNA 载体构建 转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子
农杆菌介导转化法的概述
农杆菌介导转化法的概 述 集团公司文件内部编码：（TTT-UUTT-MMYB-URTTY-ITTLTY-
学年第学期 2014级硕士生生物化学期末论文任课老师： 开课学院： 课程名称： 学院： 专业： 学号： 姓名： 2015年6月20日
农杆菌介导转化法的概述 摘要：自从1983年转基因植物诞生以来，植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，通过各种方法转移到植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。[1]? 目前，应用于植物转基因较多的方法有基因枪轰击法和农杆菌介导法。由于基因枪轰击的随机性，容易出现突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定表达的缺点，而农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统,外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定，是最常用的转基因技术[2]。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化法在一些单子 叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。本文对农杆菌介导转化法进行综述。 关键词：农杆菌转化方法转化效率 1?关于农杆菌 农杆菌[3-5]是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。与植物基因转化有关的有根瘤农杆菌和发根农杆菌这两种类型。 1.1??根癌农杆菌
依据Ti质粒诱导的植物细胞产生的冠瘿碱的种类不同，根癌农杆菌可分为4种类型：章鱼碱型（Octopine）、胭脂碱型（Nopaline）、农杆碱型（Agropine）和琥珀碱型（Succinamopine）。? 原始的Ti质粒根据其功能的不同可分为4个区： —DNA?region)：不同来源的菌株，T-DNA的长度在12~24?kb，它是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关．T-DNA上最重要的是T-DNA区两端的边界各为25?bp的重复序列．其中14?bp是完全保守的，分10?bp(CAGGAATATAT)和4?bp(GTAA)不连续的2组．左右2个边界(LB和RB)是T—DNA转移所必需的，只要其存在，T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中，转移的方向是从右向左，T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用?，因此，尤以右边界更为重要。 位于T-DNA以外的1个30-40kb的区域内，该区段编码的基因虽然并不整合进植物基因组中，但对T-DNA的转移和整合非常重要。这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。目前，对章鱼碱型农杆菌Ti质粒 pTi15955和胭脂碱型农杆菌Ti质粒pTiC58的vir区进行了全序列分析，在章鱼碱型Ti质粒的vir区发现了8个操纵子，分别为virA-vjrH，共包括23个基因(virA，virB1-virB11，virC1，virC2，virD1-virD4，virE1，virE2，virF，virG，virH)．而胭脂碱型Ti质粒的vir 区不含vjrF和virH操纵子，它含有另一个基因tzs?，也有学者认为有大约35个vir基因成簇排布于vir区。
农杆菌介导水稻遗传转化的相关讨论
农杆菌介导水稻遗传转化相关的讨论 羧苄青霉素的作用 羧苄青霉素在农杆菌介导法对水稻进行遗传转化的过程中起到抑制农杆菌生长的作用。根据前人的研究经验，浓度为250mg/L时候抑制效果最好且不会影响愈伤组织的再生。本实验过程中我们发现，经过经验用量的羧苄青霉素抑制处理，转移至筛选培养基后一周左右即可见到少量愈伤农杆菌复发，有的甚至在第二次筛选时仍然生长出农杆菌，并未达到很好的抑制农杆菌生长的目的。这有可能是在长期的实验过程和进化过程中，农杆菌对苏氨苄青霉素产生了耐受性。因此，在遵循不影响愈伤组织生长的原则下，可以适当增加羧苄青霉素的用量，或者与头孢霉素配合使用，可以达到很好的抑制效果。 潮霉素作为筛选剂的最适宜浓度 本实验采用潮霉素基因作为筛选标记，经过长期经验积累，发现潮霉素浓度梯度25mg/L,35mg/L和45mg/L进行多轮筛选，假阳性最低，筛选效果最好，为最适筛选浓度。 各个阶段不同添加物的作用 水稻遗传转化过程中的碳源有多种选择，主要有葡糖糖，麦芽糖和蔗糖，糖类除作能源外,还可以作为渗透调节剂对愈伤组织的的质量起重要作用。根据转化受体的不同，碳源的种类和浓度也有区别。本实验室研究中发现，粳稻作为转化受体时，蔗糖为最佳的碳源，而在籼稻的遗传转化中，麦芽糖和蔗糖配合使用，效果最好。 植物激素是愈伤组织诱导和绿苗分化的关键性因素。2 ,4-D 的质量浓度至关重要,对于愈伤组织诱导来说,低浓度及高浓度的 2 ,4-D 都不适宜水稻成熟胚愈伤组织的诱导。在籼稻的遗传转化中，2 ,4 -D与6 -BA 配合使用更有利于愈伤组织的诱导及分化。 潮霉素和除草剂均可以作为筛选剂。适宜的筛选浓度有利有抗性愈伤组织的生长，潮霉素浓度过高，阳性愈伤组织也有可能被筛死，浓度过低，又会有较高的假阳性出现。实验证明，只用潮霉素筛选所得的抗性愈伤和先用潮霉素筛选后用除草剂筛选所得的抗性愈伤，在分化再生过程中有显著差异。前者分化出芽所
农杆菌介导转化和再生的杨树
农杆菌介导法转基因杨树 摘要： 杨树品种已发展为一种植物转化和再生系统。叶植，从稳定发芽培养的一个杨树杂交NC - 5339（银白杨标本），被共培养用于农杆菌遗传转化关于一个烟草的看护培养。致瘤的和无防备的农杆菌株隐藏包含一个双元载体，其中包含两个新霉素磷酸转移酶II(NPT II')和细菌5莽草酸3-磷酸合酶（EPSP）（AROA）嵌合基因融合。没有开发芽，叶外植体时，双元缴械拉力的根癌农杆菌菌株共培养。然而，转化的植物，没有野生型的T-DNA获得使用农杆菌株原癌基因的二进制。NPT II '酶的活性检测，Southern印迹法分析和免疫学检测证实了遗传转化成功细菌EPSP合酶Western印迹。这是首次报道成功收回转化植株森林树，也是第一个记录的插入和重要农艺性状的外源基因的表达成木本植物物种。 关键词：白杨；转化；农杆菌 前言 基因工程树种的能力将是特别有用的遗传改良，如大型成熟的植物并长期有性世代倍(Nelson and Haissig 1984; Sederoff and Ledig 1985)。森林树种的应用重组DNA技术的一个先决条件是发展的基因转移系统。方法，例如显微注射(Crossway et al.1986)和直接DNA摄入(Paszkowski et al. 1985; Fromm et al. 1986) 已被用于外源基因引入到草本作物物种，但是，最有效的基因转移的方法，利用自然感染冠瘿病的机制造成的有机体，农杆菌(Bevan et al. 1983 ; Fraley et al. 1983 ; Herrera-Estralla, 1983). 。根癌农杆菌的自然感染周期期间，细菌的T-DNA 整合到宿主植物的染色体，从而导致肿瘤对植物的生产（奇尔顿等人，1980）。可以删除和替换而不影响根癌农杆菌的T-DNA转移到植物（DeGreve等，1982）的能力，由异源基因的肿瘤诱导基因。这些修改后的根癌农杆菌菌株的原生质体，悬浮细胞，外植体组织的共培养，可导致转化植物缺乏致癌基因性状的隔离。因此，我们着手开发一个混合型杨树无性系，银白杨x grandidentata的（NC - 5339 ）作为载体的农杆菌转化体系。 有许多特征能使杨树NC-5339得到理想的转化研究首先，杨树是一个重要的全球森林树种。这是一个快速增长的落叶阔叶树，栽培主要用于纸浆生产。对
农杆菌转化法原理
农杆菌转化法原理 This manuscript was revised on November 28, 2020
农杆菌转化法原理： 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞)，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减速分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。 人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。 农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应，主要包括：①受伤的植物细胞为修复创伤部位，释放一些糖类、酚类等信号分子。②在信号分子的诱导下，农杆菌向受伤组织集中，并吸附在细胞表面。③转移DNA上的毒粒基因被激活并表达，同时形成转移DNA的中间体。④转移DNA进入植物细胞，并整合到植物细胞基因组中。 方法：（根据不同受体环境基因要求而不同） 1．农杆菌准备 2．外植体的准备（愈伤组织、悬浮细胞系、幼嫩茎段或叶片）; 3．用 MS-AS液体培养基稀释原菌液15倍（1.5ml / 20ml）或离心后稀释3倍; 4．外植体与菌液共培养20 分钟; 5．放置在带滤纸的培养皿上（注意充分吸干多余的菌液）; 6．将外植体接种到MS-AS固体诱导培养基，培养2－3天 ; 7．移至含卡那霉素（Kan）300mg/L和羧苄青霉素（Cb 300mg/L）的固体筛选培养基上进行Kan抗性愈伤组织的筛选; 8．隔20天，进行第二次筛选； 9．抗性愈伤组织在固体筛选培养基上分化成苗； 10 在生根培养基上生根，获得完整的再分化植株。
根癌农杆菌介导的植物遗传转化1
实验三根癌农杆菌介导的植物遗传转化 一实验目的 了解植物遗传转化的方法和理论 掌握根癌农杆菌介导的遗传转化技术 二原理 植物遗传转化技术是指通过物理的，化学的或生物学的方法，将外源的基因导入受体植物细胞中获得再生植株的转基因技术。自1983转基因植物问世以来，至今不到20年时间里，植物转基因技术发展迅速，除了占指导地位，运用最为广泛的农杆菌介导法，还发展了10多种转基因方法，如物理方面的基因枪法，电激法，显微注射法，超声波法，激光微束法，炭化硅纤维介导法，电泳法等；化学方面PEG介导转化，脂质体介导转化；生物学方面的种质系统法如花粉介导法，花粉管通道法等。 农杆菌介导法 土壤农杆菌（Agrobacterium）是一种革兰氏阳性菌，有两个种与植物转基因有关，即根癌农杆菌（Agrobacterium Tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium Rhizogenes）.它们在自然状态下具有趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠缨瘤或发状根，在离体条件下，可以在不加任何生长素的培养基中持续生长，研究表明根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti 和Ri质粒,上面有一段T-DNA区，可以通过一系列过程进入植物细胞并将这一段T-DN插入到植物基因组中，这是农杆菌侵染植物后产生冠缨瘤或发状根的根本原因，因此农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，人们可将所构建的目的基因插入到去除了致瘤基因的Ti(Ri)质粒的T-DNA区，借助农杆菌侵染受体植物细胞后T-DNA向植物基因组的高频转移和整合特性，实现目的基因对受体植物细胞的转化，然后通过植物细胞合和组织培养技术，利用植物细胞的全能性获得转基因再生植株。农杆菌介导法转基因技术的关键是T-DNA整合受体植物基因组的过程，这一过程依赖与Ti质粒上的T-DNA区，和Vir区各种基因的表达以及一系列蛋白质和核酸的相互作用。简略地说。其过程是：植物细胞在受伤后细胞壁破裂，分泌高浓度的创伤诱导分子，它们是一些酚类化合物，如乙酰丁香酮（acetosyringone,AS）和羟基乙酰丁香酮（hydroxy- acetosyringone,OH-As）农杆菌对这类物质具有趋化性，首先在植物细胞表面发生贴壁，继而植物创伤分子诱导农杆菌Vir区各种基因的激活和表达。首先是VirA和virG基因的活化，磷酸化的virG蛋白激活一系列vir基因的表达，导致T-DNA被剪切，加工，形成T-链蛋白复合体（T-复合体），通过农杆菌和植物细胞的细胞膜，细胞壁进入植胞内，T-复合体上的核靶向序列可引导T-DNA整合到植物基因组。 三实验材料 烟草KRK26叶片，农杆菌菌株EHA105，质粒的T-DNA含目的基因GFP，卡那霉素抗性基因为选择标记基因，结构如下图所示: LB Bt nos3 MCS nos3 nptII nos5 RB
农杆菌介导的植物遗传转化研究进展
生物技术进展 2011年第1卷第4期260 265 Current Biotechnology ISSN 2095-櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅殯 殯 殯 殯 2341 进展评述 Reviews 收稿日期：2011-08-30；接受日期：2011-10-11基金项目：国家自然科学基因项目（31070139）资助。 作者简介：姚冉，硕士研究生，研究方向为遗传学。*通讯作者：张志芳，研究员，博士，博士生导师，主要从事基因工程研究。E-mail ：zhangzf@mail．caas．net．cn 农杆菌介导的植物遗传转化研究进展 姚 冉1，2，石美丽1，潘沈元1，沈桂芳2，张志芳 2*1．徐州师范大学生命科学学院，江苏徐州2211162．中国农业科学院生物技术研究所，北京100081摘 要：农杆菌介导的转基因方法是目前植物遗传转化的重要方法之一。本文从农杆菌转化原理、菌株比较及载体发 展入手， 系统讨论了植物转化受体对转化效率的影响，同时分别综述了农杆菌介导转化技术在双子叶和单子叶植物转化应用中的最新进展。 关键词：农杆菌；遗传转化；进展 DOI ：10．3969/j．issn．2095-2341．2011．04．06 Progress on Agrobacterium tumefaciens -mediated Plant Transformation YAO Ran 1，2 ，SHI Mei-li 1，PAN Shen-yuan 1，SHEN Gui-fang 2，ZHANG Zhi-fang 2* 1．School of Life Science ，Xuzhou Normal University ，Jiangsu Xuzhou 221116，China 2．Biotechnology Research Institute ，Chinese Academy of Agricultural Sciences ，Beijing 100081，China Abstract ：In current ，Agrobacterium -mediated gene transferring is one of major methods used in genetic transformation of plants．This paper systematically reviewed the effect on plant transformation efficiency based on the introduction of the principle of this transformation ，comparison among different kinds of Agrobacterium strains and the development to transformation vectors．In addition ，the newly progresses on the Agrobacterium -mediated transformation of dicotyledonous and monocotyledons species transformation were also discussed ，respectively． Key words ：Agrobacterium tumefaciens ；genetic transformation ；progress 植物遗传转化（plant genetic transformation ）技术也称植物转基因技术，是应用DNA 重组技术将外源基因通过生物、物理或化学等手段导入植物基因组，以获得外源基因稳定遗传和表达的植物遗传改良的一门技术 ［1］ 。目前最常用的转基 因方法是基因枪法和农杆菌法。基因枪法的基本 原理是利用表面附着有外源DNA 的金属微粒在高压装置中加速后高速运动到受体细胞中，从而达到转化DNA 的目的。但是基因枪法与农杆菌介导法相比，存在着转化率低、外源DNA 整合机 理不清楚、 得到的转化体往往是嵌合体、遗传稳定性较差、转入外源基因的沉默现象突出等缺点。农杆菌属于革兰氏阴性土壤杆菌，分根癌农 杆菌（Agrobacterium tumefaciens ）和发根农杆菌 （Agrobacterium rhizogenes ）。根癌农杆菌中含有Ti 质粒，能诱发冠瘿瘤。发根农杆菌中含有Ri 质粒，可以导致受伤部位产生毛发状根。Ti 质粒（包括Ri 质粒）上有一段转移DNA （transfer DNA ，又称T-DNA ），受伤的植物细胞中产生的化 学复合物可使农杆菌吸附于植物上，使T-DNA 转移到植物细胞内并整合到染色体上。 目前大量研究工作的目标是明确农杆菌将外 源DNA 导入受体细胞的分子机制，从而改进农杆菌菌株、 质粒和转化技术，以进一步提高转化效率。由于植物受体在转化过程中的作用尚不十分明确，所以农杆菌在转化过程中如何进入植物细
(完整word版)农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素
二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素 转化机制： 与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。根癌农杆菌含有Ti 质粒。发根农杆菌含有Ri 质粒。根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌Ri 质粒都具有一段转移DNA (transfer DNA，又称T-DNA)，在农杆菌侵染植物时，T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。由于T-DNA 能够进行高频率的转移，而且Ti 质粒和Ri 质粒上可插入大到甚至150kb 的外源基因，因此，Ti 质粒和Ri 质粒成为植物基因转化中的理想载体系统。 1 与农杆菌转化相关的基因 与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和Ti 质粒上T-DNA 以外Vir 区的基因。染色体基因包括chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及chvB。它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。ChvD 蛋白可能在低pH 和磷酸饥饿情况下提高VirG 蛋白的合成水平。ChvE 与VirA 蛋白共同对virG 起激活作用。 原始的Ti质粒根据其功能的不同，可分为4个区： （1）T-DNA区：是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关。T-DNA 上最重要的是两端的2个边界(LB和RB)，它们是T-DNA转移所必需的。只要其存在，T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中， T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要． （2）毒性区：位于T-DNA以外的1个30~40 kb的区域内，该区段编码的基因但对T-DNA 的转移和整合非常重要．这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。 （3）接合转移区：该区段存在有与细菌间接合转移有关的基因(tra)，调控Ti质粒在农杆菌间转移。 （4）复制起始区：该区段调控Ti质粒的自我复制。在遗传转化过程中除了Ti质粒上的基因参与外，还有农杆菌染色体基因。染色体基因包chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及chvB。它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。延伸因子P对于农杆菌的生长非常重要，但非必需．高水平的糖结合蛋白一ChvE可以扩大VirA蛋白对酚类物质的识别范围。结合ATP盒式转运体类似物蛋白ChvD，参与Vir区基因的表达调控，chvD基因座中插入无启动子的lacZ，农杆菌侵染力以及Vir区基因表达量大大下降，ChvD突变体中virG组成型表达侵染力则得以恢复，这一现象说明ChvD通过影响virG表达控制毒性。 2 Vir 基因的诱导表达机制 在植物受到创伤后，创伤组织的细胞释放出创伤信号——酚类化合物，如乙酰丁香酮。
农杆菌介导转化法的概述
学年第学期 2014 级硕士生生物化学期末论文 任课老师：开课学院：课程名称：学院：专业：学号：姓名： 2015 年 6 月 20 日 农杆菌介导转化法的概述 摘要：自从1983年转基因植物诞生以来，植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，通过各种方法转移到植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。［1］
目前，应用于植物转基因较多的方法有基因枪轰击法和农杆菌介导法。由于基因枪轰击的随机性，容易出现突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定表达的缺点，而农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统, 外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定，是最常用的转基因技术［2］。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化法在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。本文对农杆菌介导转化法进行综述。关键词：农杆菌转化方法转化效率 1关于农杆菌 农杆菌［3-5］是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。与植物基因转化有关的有根瘤农杆菌和发根农杆菌这两种类型。 1.1根癌农杆菌 依据Ti质粒诱导的植物细胞产生的冠瘿碱的种类不同，根癌农杆菌可分为4 种类型：章鱼碱型（Octopine）、胭脂碱型（Nopaline）、农杆碱型（Agropine）和琥珀碱型（Succinamopine）。 原始的Ti质粒根据其功能的不同可分为4个区： 1.1.1T-DNA区（Transfer—DNA region）：不同来源的菌株，T-DNA的长度在12~24 kb，它是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关．T-DNA上最重要的是T-DNA区两端的边界各为25 bp的重复序列．其中14 bp是完全保守的，分10 bp（CAGGAATATAT）和4 bp（GTAA）不连续的2组．左右2 个边界（LB 和RB）是T —DNA 转移所必需的，只要其存在，T-DNA 可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中，转移的方向是从右向左，T-DNA 的右边界在T-DNA 的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要。 1.1.2 毒性区（vir 区）：位于T-DNA 以外的1 个30-40kb 的区域内，该区段编码的基因虽然并不整合进植物基因组中，但对T-DNA的转移和整合非常重要。这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因（vir）。目前，对章鱼碱型农杆菌Ti质粒pTi15955 和胭脂碱型农杆菌Ti质粒pTiC58的vir区进行了全序列分析，在章鱼
农杆菌介导的转化所用基本培养基配方
农杆菌介导的转化所用基本培养基配方 一、NB培养基配方（基本培养基） N6大量：（mg/l）母液：10X，1L（mg） 硝酸钾KNO3 硫酸氨（NH4）2SO4 磷酸二氢钾KH2PO4 硫酸镁MgSO4·7H2O 氯化钙CaCl2·2H2O 2830 463 400 185 166 28300 4630 4000 1850 1660 B5微量：（mg/l）母液：100X，1L（mg） 硼酸H3BO4 硫酸锰MnSO4·H2O 硫酸锌ZnSO4·7H2O 碘化钾KI 钼酸钠Na2MoO4·2H2O 硫酸铜CuSO4·5H2O 氯化钴CoCl2·6H2O 3 7.58 2 0.75 0.25 0.025 0.025 300 758 200 75 25 2.5 2.5 铁盐：（mg/l）母液：100X，1L（mg） 硫酸亚铁FeSO4·7H2O 乙二胺四乙酸二钠Na2EDTA 27.8 37.3 2780 3730 肌醇：（mg/l）母液：100X，1L（mg）肌醇Myo-inositol 100 10000 有机成分：（mg/l）母液：50X，1L（mg） 盐酸硫胺素ThiamineHCl 盐酸吡哆醇PyridoxineHCl 尼克酸Niacin 水解酪蛋白Casamino acids 谷氨酰胺Glutam 脯氨酸Proline ine 甘氨酸Glycine 10 1 1 300 250 500 2 500 50 50 15000 12500 25000 100
蔗糖Sucrose 30000mg/l 琼脂Phytagel 2400mg/l pH 5.8-5.9 注意：有机成分不能高压灭菌，须用滤器抽滤，分装后-20℃保存 二、AAM培养基配方 大量：（mg/l）母液：10X，1L（mg） 磷酸二氢钾KH2PO4 硫酸镁MgSO4·7H2O 氯化钾KCl 氯化钙CaCl2·2H2O 170 370 2940 440 1700 3700 29400 4400 微量：（mg/l）母液：100X，100ml（mg） 硫酸锰MnSO4·H2O 钼酸钠Na2MoO4·2H2O 硼酸H3BO4 硫酸锌ZnSO4·7H2O 碘化钾KI 硫酸铜CuSO4·5H2O 氯化钴CoCl2·6H2O 7.58 0.25 3 2 0.75 0.0387 0.025 758 25 300 200 75 3.87 2.5 铁盐：（mg/l）母液：100X，1L（mg） 硫酸亚铁FeSO4·7H2O 乙二胺四乙酸二钠Na2EDTA 27.8 37.3 2780 3730 肌醇：（mg/l）母液：100X，1L（mg）肌醇Myo-inositol 100 10000 维生素：（mg/l）母液：100X，1L（mg） 盐酸硫胺素ThiamineHCl 盐酸吡哆醇PyridoxineHCl 尼克酸Niacin 0.5 0.5 0.5 50 50 50 氨基酸：（mg/l） 甘氨酸Glycine 精氨酸Arginine 谷氨酰胺Glutamine 7.5 174 876
农杆菌介导法
实验九植物遗传转化——农杆菌介导法 一、目的 了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化水稻的技术 二、原理 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能力。下列因子与转化过程有关： 1. Ti 质粒(tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA) T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列。T-DNA含有RB和LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作用元件。不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。置于该边界内的任何外源基因均可被转化。LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能力丧失，这时几乎完全没有T-DNA的转移。 LB（－链）5’GT TTACACCACAA TA TATCCTG CCA 3’ RB（＋链）5’TGA CAGGA TA TA TTGGCGGGTAA AC 3’ 2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵子 转化所必需的基因有vir A、B、C、D、E、G。其中蛋白VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强子；VirD2在T-DNA底链起内切酶作用造成切刻，并与T－链5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA 结合蛋白，有2个NLS。该操纵子的表达顺序如下： vir A和vir G组成型表达形成VirA和VirG蛋白→VirA被植物创伤信号分子激活→激活的VirA使VirG激活→激活的VirG 诱导vir C、D、E、B、F、H表达。 3. 农杆菌染色体基因组相关基因：chv A、chv B（农杆菌运动、附着）、chv D、chv E（编码单糖结合蛋白、趋化性）、psc A、att、cel（合成纤维素丝，附着）。它们与农杆菌的趋化性和识别附着植物细胞有关。 4. 寄主细胞表面受体 5.诱导条件: 小分子酚类化合物：如乙酰丁香酮（AS，acetosyringone）、羟基乙酰丁香酮（OH-AS，hydroxyacetosyringone）；它们是植物细胞创伤反应的一部分，或创伤细胞合成木质素的一部分，是莽草酸合成途径的产物。植物细胞必须在创伤和活跃的代谢状态下才能产生AS及OH-AS。农杆菌对一系列植物酚类化合物具有趋化性，同时高浓度的AS又可使农杆菌的vir 基因活化表达。这些化合物是双子叶植物细胞壁合成的前体，通常不存在于单子叶植物中，这正说明了为什么根癌农杆菌不易感染单子叶植物。若要实现农杆菌对水稻的转化，必须添加这类诱导物。 糖类：如D-葡萄糖、D-木糖等。它们在Vir区基因诱导和农杆菌毒力上起一定作用。 高浓度的肌醇可促进vir基因的表达。 低pH：pH 5.1－5.8 时Vir区基因的诱导达到最高水平。
农杆菌如何介导植物遗传转化
农杆菌如何介导植物遗传转化？ 植物遗传转化技术 植物遗传转化技术也称植物转基因技术，是应用DNA重组技术将外源基因通过生物、物理或化学等手段导入植物基因组，以获得外源基因稳定遗传和表达的植物遗传改良的一门技术。目前最常用的转基因方法是基因枪法和农杆菌法。基因枪法的基本原理是利用表面附着有外源DNA的金属微粒在高压装置中加速后高速运动到受体细胞中，从而达到转化DNA的目的。但是基因枪法与农杆菌介导法相比，存在着转化率低、遗传稳定性较差、外源DNA整合机理不清楚、得到的转化体往往是嵌合体、转入外源基因的沉默现象突出等缺点。 接下来，这篇文章着重介绍农杆菌介导的植物遗传转化。 优点 农杆菌作为一种天然的植物基因转化系统，其介导的转化属于纯生物学的过程，与其它转化方法相比具有明显的优点，主要包括：(1)转化频率高；(2)可导入大片段的DNA，且导入植物细胞的片段确切；(3)导入基因拷贝数低，大多只有1-3个，表达效果好，能稳定遗传，多数符合盂德尔遗传规律。而且，从大量的报道可以发现，农杆菌的寄主范围有很大的扩展，已经延伸到了原核生物、真菌甚至人类细胞等非植物领域。 原理 农杆菌是一种革兰氏阴性细菌，它对寄主细胞的转化是借助诱导瘤细胞(tumor-inducing, Ti)质粒将其中一段特定的DNA片断转入寄主细胞基因组的过程。在自然环境中，被转移的
DNA (T-DNA)携带了一套致瘤基因和冠瘿碱代谢基因，它们在植物中的表达可引起被侵染组织产生肿瘤并合成冠瘿碱作为细菌的氮源。利用分子克隆技术可以将T-DNA替换为目标基因，使农杆菌成为一个能有效将外源基因导入植物的天然工具。 图1 农杆菌介导的基因转化。 此外，有多种植物蛋白质也参与了农杆菌介导的基因转化过程，主要作用于T-DNA胞内运输、进入细胞核以及整合阶段。因为农杆菌主要利用植物细胞内的生物过程(例如DNA和蛋白质运输、靶蛋白水解和DNA修复)来转化其受体，研究这些基本的植物细胞生物学机制有助于扩大农杆菌的受体范围，同样也可促进转化过程和转基因植物的产物控制。改善植物受体以提高较难转化的植物物种的转化效率是目前研究的主要方向之一。 生物学过程 农杆菌介导的植物遗传转化是个复杂的生物学过程，主要包括以下l0个步骤：
五种常用的植物转基因技术
五种常用的植物转基因技术 杂粮作物2010 . 30(3):186～189RainFedCrops''…… 文章编号:1003—4803(2010)03—0186—04 五种常用的植物转基因技术 汪由,吴禹,王岩,李兆渡,王光霞 (1.辽宁省农业科学院创新中心,辽宁沈阳110161;2.沈阳市东陵区白塔街道办事处,辽宁沈阳110167) 摘要:从原理,基本步骤和优缺点等几个方面对农杆茵介导法,基因枪法,超声波介导法,子房注射法和花粉管 通道法等5种常用的植物转基因技术进行了简要介绍. 关键词:农杆菌介导法;基因枪法;超声波介导法;子房注射法;花粉管通道法;原理;基本步骤;优缺点 中图分类号:$336文献标识码:B 植物转基因技术是通过各种物理的,化学的和生物的 方法将从动物,植物及微生物中分离的目的基因整合到植 物基因组中,使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物 预期性状的一种生物技术方法.1983年,首例抗病毒转 基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技 术改良农作物.目前,植物转基因技术已在作物改良和育 种领域发挥了重要作用.通过植物转基因技术,一些来自 于动物,植物及微生物的有益基因如抗病/虫基因,抗非生 物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以 改良现有的农作物和培育新的农作物品种.以DNA重组 技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的 来源,打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障.植
物转基因技术已应用到玉米,水稻,小麦,大豆和棉花等许多农作物.同时,该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等其它的作物中"J.目前,根据转基因植物的受体类型, 植物转基因方法可以分为3大类:以外植体为受体的基因转化方法,如农杆菌介导法,基因枪法和超声波介导法;以原生质体为受体的基因转化方法,如聚乙二醇法,电击法, 脂质体法及磷酸钙?DNA共沉淀法;以种质系统为受体的基因转化方法,如子房注射法和花粉管通道法j.由于以 原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大, 培养过程繁杂,培养工作量大且培养技术不易掌握;原生质体再生植株的遗传稳定性差,再生频率低并且再生周期长;相关的转化方法的转化率低,效果不理想等缺点,所以该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用.本文将对农杆菌介导法,基因枪法,超声波介导 法,子房注射法和花粉管通道法的原理,基本步骤和优缺点作以简要介绍. 1以外植体为受体的基因转化方法 1.1农杆菌介导法 农杆菌介导法是最早应用,最实用有效并且具有最多 成功实例的一种植物转基因方法J.农杆菌是一类普遍 存在于土壤中的革兰氏阴性细菌.目前,用于植物转基 因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌.某些根癌 农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200—800bp的结构和功能相似的质粒和Ri质粒J.Ti质粒和Ri质粒含 有3个功能区:参与农杆菌侵染植物过程的vir区,参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区,在农杆菌中启动质粒复制的orj区.在vir区上的vir操纵子群作用下,rrj质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞内,而后将T—DNA整合到植物基因组中J.T-