高效液相色谱柱前自动衍生法测定氨基酸含量

高效液相色谱柱前自动衍生法测定氨基酸含量
高效液相色谱柱前自动衍生法测定氨基酸含量

河 北 医 科 大 学 学 报

JO U RN A L OF HEBEI M ED ICA L U NI VER SI T Y

V o 1.17 No .3 1996

高效液相色谱柱前自动衍生法测定氨基酸含量

许彦芳 许新民

 王永利

药理教研室(050017)

摘 要 本文利用高效液相色谱(HP L C )柱前邻苯二甲酝酿(OP A )自动衍生、自动进样程序测定脑组织中谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、牛磺酸和r -氨基丁酸含量。该法的最低检出限为10nmol /ml ,5种氨基酸峰面积测定值的变异系数平均为2.0±1.3%,线性相关系数平均为0.97±0.03。

关键词 HPL C;氨基酸;OP A ;自动衍生;自动进样

HPLC -PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHIC DETERMINATION OF

AMINO ACIDS BY AUTOMATIC PRECOLUMN DERIVATIZATION

Xu Yan fang Xu Xinmin Wang Yongli

Dep artment of Ph armacology

ABSTRACT Glutamate,asparate,glycine,taurine and GABA in brain w ere seperated and determined by HPLC system of the autom atic processes of precolum n o -phthaldialdehyde

der iv atization and injection .Average co efficient o f variatio n for peak areas of 5amino acids w as 2.0±1.3%w ith the detectio n lim it o f 50ng.Av erag e line co orelatio n coefficient w as 0.97±0.03.

KEY WORDS HPLC ;o -phthaldialdehyde ;amino acids ;automatic derivatizatio n ;au-tom atic injection

生物样品中的微量氨基酸测定在医学领域中占重要地位。尽管国外早已将氨基酸自动分析仪专用于氨基酸的分析测定[1],但其分析时间长、仪器专一性强、成本高,使氨基酸的快速、简便分析受到了限制。采用一般高效液相色谱仪快速测定生物样品中的氨基酸是近几年研究的热门课题[2,3]。本文对脑组织中的谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、牛磺酸和r -氨基丁酸等5种氨基酸研究,建立了一种OPA 柱前自动衍生、自动进样的HPLC 快速测定法。1 材料与方法

1.1 仪器:美国惠普公司生产HP -1050型高

效液相色谱系统:HP-79852型带有柱加温脱气装置的四元泵;HP -79852型自动进样品;

H P-1040M 型DAD 紫外检测器;HP-300型化学工作站;HP-9153C 型打印机。

1.2 试剂:醋酸钠、氢氧化钠、四氢呋喃(T HF )、三乙胺(TEA )、巯基乙醇均为分析纯;甲醇、乙氰为色谱纯;OPA 为瑞士进口;实验用水均为双蒸水。1.3 色谱条件

1.3.1 色谱柱:HP-HPLC 卡套柱,Hypsil ODS 125×4m m,5um;ODS 保护柱,4×4mm ,5 m 。

1.3.2 流动相:A 液:20m mol NaAC +0.6%

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132? 病理生理教研室

本院青年科研基金资助课题

TH F+0.02%TEA(pH7.2)B液: 10m molNaAC(pH7.2)∶乙氰∶甲醇=100∶175∶225

1.3.3 柱温:40℃。

1.3.4 流速:1ml/m in。

1.3.5 洗脱梯度:见表1。

表1 5种氨基酸分离洗脱梯度

时间(分)流动相A(%)流动相B(%)

01000

86040

101000

1.3.6 紫外检测波长:信号波长33810nm:参考波长39020nm。

1.4 柱前自动衍生及进样程序

1.4.1 氨基酸衍生试剂:OPA试制(10m g/ ml);硼酸缓冲液0.4mo l,pH10。

1.4.2 样品位置:Vial1:OPA试剂;Vial2:双蒸水;Vial3:硼酸缓冲液;Vial4:氨基酸标品或待测样品。

1.4.3 进样程序:10draw0.0 l fr om vial2; 20draw 6.0 l from vial3;30draw0.0 l fr om vial2;40draw

2.0 l fro m v ial1;50 dr aw0.0 l fro m v ial2;60draw5.0 l from vial4;70draw0.0 l fro m vial2;80mix 1

3.0 l in seat rept20tim es in200 l/min;90 inject。

1.5 样品制备

1.5.1 标准品:准确称量谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、牛磺酸(T au)和r-氨基丁酸(GABA),用双蒸水分别配制2 mol/ ml标准品储备液,4℃保存,实验前用流动相稀释成相应浓度,经自动衍生进样。

1.5.2 组织样品:取大鼠脑组织150mg,分次加入HCLO41ml,在冰浴中匀浆,4℃离心10000g×20min。取上清液加入Vial4,自动衍生进样。

1.6 精密度试验:取上述5种氨基酸标准品储备液,配成各种氨基酸含量为1m mol/L混合液,再稀释成330、100、33 m ol/L的工作液,按拉丁方顺序进样,重复3次,计算不同浓度各种氨基酸峰面积测定值的变异系数。1.7 回收率测定:取上述三种浓度氨基酸标品混合液加入脑组织中,按脑组织样品处理法测定,以拉丁方顺序进样,用测得的峰面积值减去相应的未加标品脑组织的峰面积值,计算回收率。

2 结 果

2.1 色谱行为:5种氨基酸在本实验条件下能在10分钟内得以较好分离。混合标品的色谱图见图1。大鼠脑组织中5种氨基酸分离色谱图见图2,组织中的干扰峰与氨基酸可完全

分离。

图2 脑组织样品氨基酸色谱图

1 Asp 2 Glu 3 Gly 4 T au 5 GABA

2.2 精密度:不同浓度氨基酸峰面积变异系数见表2。

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133

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表2 不同浓度氨基酸峰面积变异系数(%)

氨基酸浓度

(u mol/ml)Asp Glu Gly T au GABA

33 1.1 2.4 3.7 3.0 1.3

100 1.50.70.7 6.30.5

330 1.3 1.3 1.4 3.4 1.5

x-±s13±0.2 1.5±0.9 1.9±1.6 4.2±1.8 1.1±0.5 2.0±1.3* *为总平均数

2.3 线性关系和最低检出限:以不同浓度氨基酸标品加入脑组织,测得其浓度与峰面积的回归方程为:

Asp Y=2.88X-76.32 r=0.9277

Glu Y=2.57X-85.04 r=0.9463

Gly Y=3.12X-56.23 r=0.9910

Tau Y=3.50X-41.64 r=0.9936

GABA Y=2.60X-44.78 r=0.9927

平均相关系数为0.97±0.03。本方法的最低检出限为10nmo l/ml。

2.4 回收率:各氨基酸的平均回收率为: Asp98.1±

3.7%;Glu97.4±3.9%;Gly96.8±2.7%;Tau97.7±3.0%;GABA96.5±3.3%。

3 讨 论

近几年发展起来的氨基酸HPLC测定通常用衍生法,分柱前和柱后衍生两类。柱后衍生需要添专用的反应器,这将会引起分离度和灵敏度的损失。柱前衍生中最常用的衍生试剂是邻苯二甲醛[3,4],邻苯二甲醛在室温下与伯氨基酸反应生成强荧光化合物[4]。影响该步反应的因素较多,除温度、各试剂加入量外,反应时间是需要严格控制的关键因素[3~5]。目前国内大多采用试管内手动操作进行衍生反应,而本实验利用自动进样品,使衍生反应自动进行,影响反应的诸因素都能准确控制,使生物样品中微量氨基酸分析更为简便、精确,且可以大大节省试剂和样品用量。

谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、牛磺酸和r-氨基丁酸是机体内,特别是脑组织中的重要氨基酸,利用梯度洗脱使5种氨基酸在很短时间内分离,尽管限于条件,本实验用紫外检测使最低检出限偏高,但仍能满足实际测定的需要。故本实验建立的5种氨基酸测定法不失为一种简便、快速、精确的方法。

参 考 文 献

1.Spack man DH,M oore S.Autom atic recording apparatu s

for us e in th e chromatograph y of am ino acids.Anal Chem, 1958;30(7)∶1190

2.Fur st P,Pollack L,Graser T A,et al.Appraisal of four

p re-column derivatization methods for th e high liquid chro-matograp hic determination of free amino acids in biological m aterials.J Chromatogr,1990;499(19)∶557

3.Liu HJ.Deter mination of amin o acids b y precolumn der iva-

tization w ith6-am inoquinolyl-N-hydroxysu ccin iomidyl car-bamate and h igh-per formance liquid chromatograph y w ith ultroviolet detection.J Ch rom atogr,1994;670(1)∶59 4.Roth M.Fluores cence reaction for amino acids.Anal

Ch em,1971;43(7)∶880

5.Lindroth P,M opper K.Hig h-performance liquid chro-

matography determination of s ubpicom ole amounts of am ino acids by fluores cen ce der ivatization w ith o-phthaldialdedyde.Anal Chem,1979;51(10-11)∶1667

(1995-05-11 收稿)

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134?

高效液相色谱法测定氨基酸

脑蛋白水解物溶液氨基酸含量分析方法研究方案 1、仪器与试药 1.1 仪器 1525型高效液相色谱仪(美国Waters公司);Waters1525型泵,Waters2487型检测器,Waters5CH 型柱温箱,WatersBREEZE数据处理软件,水浴恒温器(精度±0.1℃),旋涡器,微量移液器,衍生专用管;CP225D型分析天平(德国);4umNora-Pak TM C18(3.9mm×150mm,5μm)色谱柱(美国) 1.2 药品与试剂 16种氨基酸(门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)由中国药品生物制品检定所提供。 脑蛋白水解物注射液,云南盟生药业有限公司生产,规格10ml/支。批号:2013、2013、2013. 乙腈(HPLC级);EDTA(分析纯);磷酸(分析纯);二乙胺(分析纯);三水合乙酸钠(分析纯)。2、方法与结果 2.1色谱条件流动相A为AccQTag醋酸—磷酸盐缓冲液;由AccQTagEluent A浓缩制备AccQTag洗脱液,用前稀释10倍(或按以下方法配制:称19.04g三水合乙酸钠,加1000ml纯化水,搅拌,溶解,用50%H3PO4将pH调至5.2,加入1ml 1mg/ml的EDTA溶液,加入2.37ml二乙胺,用50%H3PO4滴定至pH4.95,用水溶性过滤器过滤,超声,脱气,备用。);流动相B为60% HPLC级乙腈,按梯度表梯度洗脱;流速1.0ml/min;检测波长为254nm;进样量5μl;柱温38℃。

时间 (min) 流速 (ml/min) % A % B 曲线 起始 1.0 100 0 * 0.5 1.0 98 2 6 15.0 1.0 93 7 6 19.0 1.0 90 10 6 32.0 1.0 65 35 6 33.0 1.0 65 35 6 34.0 1.0 0 100 6 37.0 1.0 0 100 6 38.0 1.0 100 0 6 42.0 1.0 100 0 6 2.2对照品溶液、供试品溶液的制备分别精密称取16种氨基酸标准品,用纯化水配制成浓度如下表 所示的混合溶液。 名称浓度(mg/ml)名称浓度(mg/ml)名称浓度(mg/ml)门冬氨酸 4.80 苏氨酸 1.20 异亮氨酸 1.10 丝氨酸 2.60 丙氨酸 2.50 亮氨酸 2.70 谷氨酸 6.20 脯氨酸 2.00 苯丙氨酸 1.20 甘氨酸 2.40 缬氨酸 1.60 色氨酸0.40 组氨酸0.90 甲硫氨酸 1.00 精氨酸 1.20 赖氨酸 3.45 取上述溶液0.1ml,加纯化水0.9ml,旋涡器混匀,作为对照品溶液;取脑蛋白水解物注射液,加水稀释成含总氮为1mg/ml的溶液,取0.1ml,加纯化水0.9ml,旋涡器混匀,作为供试品溶液。 衍生剂配制将水浴锅设置55℃,加热,待温度稳定, 取AccQFluor衍生剂2A,轻轻弹击,确保AccQFluor 衍生剂2A粉末全落在瓶底,吸取AccQFluor衍生稀释剂2B 1ml并放掉,清洗移液器管,再吸取AccQFluor 衍生稀释剂2B 1ml,加入AccQFluor衍生剂2A的瓶中,振荡10秒钟,在恒温水浴锅中溶解,保持10分钟。于干燥器中室温保存一周,于干燥器中4℃保存二周。 2.3测定方法分别取20ul对照品溶液和供试品溶液加入衍生专用管底部,加入60uLAccQFluor硼酸

第31章 氨基酸及其重要衍生物的转化

第31章氨基酸及其重要衍生物的转化 一、判断题 ()1. 芳香族氨基酸都是通过莽草酸途径合成的。 ()2.丝氨酸能用乙醛酸为原料来合成。 ()3.限制性内切酶的催化活性比非限制性内切酶的催化活性低。 ()4.莽草酸途径是所有生物所共有的氨基酸代谢方式。 ()5.肝细胞浆中的氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ是合成尿素的关键酶。 ()6.嘧啶核苷酸的合成伴随着脱氢和脱羧反应。 ()7.脱氧核糖核苷酸的合成是在核糖核苷三磷酸水平上完成的。 ()8. 合成芳香氨基酸的前体物质是糖酵解和三羧酸循环的中间产物。 ()9. Ser和Thr的分解代谢有相似的地方,他们脱氨后都产生酮酸,都是生糖氨基酸。 ()10. 微生物对Phe和Tyr的分解代谢作用,与动物对这两种氨基酸的分解作用完全相同。 二、选择题 1.转氨酶的辅酶是: A.NAD+ B.NADP+ C.FAD D.磷酸吡哆醛 2.下列哪种酶对有多肽链中赖氨酸和精氨酸的羧基参与形成的肽键有专一性:A.羧肽酶B.胰蛋白酶 C.胃蛋白酶D.胰凝乳蛋白酶 3.参与尿素循环的氨基酸是: A.组氨酸B.鸟氨酸C.蛋氨酸D.赖氨酸 4.γ-氨基丁酸由哪种氨基酸脱羧而来: A.Gln B.His C.Glu D.Phe 5.经脱羧后能生成吲哚乙酸的氨基酸是: A.Glu B.His C.Tyr D.Trp 6.L-谷氨酸脱氢酶的辅酶含有哪种维生素: A.VB1 B.VB2 C.VB3 D.VB5 7.磷脂合成中甲基的直接供体是: A.半胱氨酸B.S-腺苷蛋氨酸C.蛋氨酸D.胆碱 8.在尿素循环中,尿素由下列哪种物质产生: A.鸟氨酸B.精氨酸C.瓜氨酸D.半胱氨酸 9.需要硫酸还原作用合成的氨基酸是: A.Cys B.Leu C.Pro D.Val 10.下列哪种氨基酸是其前体参入多肽后生成的: A.脯氨酸B.羟脯氨酸C.天冬氨酸D.异亮氨酸 11.组氨酸经过下列哪种作用生成组胺的: A.还原作用B.羟化作用 C.转氨基作用D.脱羧基作用 12.氨基酸脱下的氨基通常以哪种化合物的形式暂存和运输: A.尿素B.氨甲酰磷酸C.谷氨酰胺D.天冬酰胺 13.丙氨酸族氨基酸不包括下列哪种氨基酸: A.Ala B.Cys C.Val D.Leu

9种氨基酸UPLC分析方法(异硫氰酸苯酯柱前衍生法)

9种氨基酸UPLC分析方法(异硫氰酸苯酯柱前衍生 法) 2013-09-05 方法: HPLC 基质: 标准溶液 应用编号: 103087 化合物: Asp(天冬氨酸) Glu(谷氨酸) Ser(丝氨酸) Gly(甘 氨酸) His(组氨酸) Arg(精氨酸) Thr(苏氨酸) Ala(丙 氨酸) Pro(脯氨酸) Tyr(酪氨酸) Val(缬氨酸) Met(蛋 氨酸) Cys(胱氨酸) IIe(异亮氨酸) Leu(亮氨酸) Nle(正亮氨酸) Phe(苯丙氨酸) Trp(色氨酸) Lys(赖 氨酸) 固定相: Endeavorsil C18 色谱柱/前处理小柱: Endeavorsil C18 1.8μm 100 x 2.1mm 样品前处理: 1 溶液配制:氨基酸储备液:称取一定量氨基酸标准 品,用0.1 mol/l HCl水溶液溶解,配成氨基酸单标 浓度为0.05 mol/l 氨基酸使用液:将储备液用0.1 mol/l HCl水溶液稀释,得到浓度为0.002 mol/l的氨 基酸单标和混标,待衍生 0.1 mol/l HCl水溶液:量 取8.3 ml浓盐酸,然后用纯水定容至1000 ml 异硫氰 酸苯酯(PITC)溶液:将250 μl异硫氰酸苯酯用乙 腈定容至10 ml,得到0.2 mol/L异硫氰酸苯酯溶液三 乙胺溶液:将1.4 ml三乙胺用乙腈定容至10 ml,得 到1.0 mol/L三乙胺溶液 0.1 mol/l HCl水溶液:量 取8.3 ml浓盐酸,然后用纯水定容至1000 ml 2 标准 溶液衍生化:量取200 μl氨基酸混合使用液,置于 1.5 ml塑料离心管中,准确加100 μl 1 mol/l三乙 胺乙腈溶液和100 μl 0.2 mol/l异硫氰酸苯酯乙腈 溶液,混匀,室温反应1小时,然后加入正己烷400 μ l,旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s,静置分层,取200 μ

高效液相色谱法测定甲硝唑的含量

实验二高效液相色谱法测定甲硝唑的含 量 一、实验目的 1.熟悉高效液相色谱仪主要结构组成及功能。 2.了解反相色谱法的原理、优点和应用。 3.了解流动相的选择依据及配制方法。 4.掌握高效液相色谱法进行定性和定量分析的基本方法。 二、实验原理 高效液相色谱法是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品,由流动相带入柱内,各成分在柱内被分离,并依次进入检测器,由数据处理系统记录色谱信号。本实验以甲硝唑为测定对象,以反相HPLC来分离检测未知样中甲硝唑的含量。以甲硝唑标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度进行线性回归,再根据样品中甲硝唑的峰面积,由线性方程计算其浓度。 三、实验内容 (一)实验仪器与材料 1.实验仪器:高效液相色谱仪、精密天平、50mL烧杯、玻璃棒、称量纸、10mL容量瓶、50mL 容量瓶、注射器、洗瓶。 2.实验材料:甲硝唑原料、蒸馏水、HCl(0.1mol/L)、乙腈、三氟乙酸、超纯水。 (二)实验内容 1、色谱操作条件的制定: 色谱柱:C18柱(250×4.6mm,5μm); 流动相:乙腈:0.02%三氟乙酸水溶液(20:80) 流速:1mL/min 检测波长:277nm 柱温:35℃ 进样量:20μL 2、标准溶液配制 精密称取在105℃条件下干燥至恒重的甲硝唑对照品10mg,置于50mL容量瓶中,用0.1mol/L的HCl溶液溶解并定容至刻度,即得浓度为0.2mg/mL的甲硝唑标准储备液,备用。 3、标准曲线的建立 (1)精密量取甲硝唑标准储备液分别为0.3mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL、1.1 mL置于10 mL的容量瓶中,然后用0.1mol/L的HCl溶液定容至刻度,得到浓度梯度为6μg/mL、10μg/mL、14μg/mL、18μg/mL和22μg/mL的标准溶液,分别过0.22μm的微孔滤膜过滤,滤

HPLC柱前衍生和柱后衍生

HPLC柱前衍生和柱后衍生 1、为什么要衍生? 衍生化最为主要的目的就是提高目的物的可检测性。对于GC来讲,多数是为了增强目的物挥发性或者改善目的物极性;对于HPLC来讲多数是为了提高检测器对目的物的相应。 2、衍生化分类:柱前衍生和柱后衍生。柱前衍生是在经过分析柱前使分析物与衍生剂反应,反应产物在分析柱上实现分离,实际分离的是衍生产物,检测的也是衍生产物;柱后衍生是分离物在分析柱中实现分离后,在衍生池内与衍生剂反应,在柱子中分离的是目的物,在检测器处检测的衍生产物。 3、适用的化合物:生物酸/碱、胺类、抗生素(聚醚类抗生素多见)和氨基酸类。 4、衍生化要求? 1)衍生剂必须过量且稳定;不过量反应不完全,检测不充分。不稳定,重现性差。 2)衍生物、衍生产物和衍生副产物至少是好分离的。当然如果只能检测到衍生产物最好。3)衍生反快速完全。反应慢,柱前衍生还可以,但柱后不行。因为流速固定,衍生池管路长度一定,留给衍生化的时间是一定的。柱前衍生可以在系统外等衍生完毕后进样,但也是影响效率的。 5、两种衍生比较 柱前衍生优点是,对设备要求不高,可以手工衍生,而且对衍生时间要求相对宽泛。缺点是,引入了过多的物质,如:衍生剂、衍生产物(当然这个是检测需要的)和衍生副产物,对柱子有潜在的负面影响,另如采用手工衍生也会引入过多的认为因素。 柱后衍生优点是,重现性好,认为因素少,引入物质比较少。缺点是,可能有扩散问题,在柱子中分离结束后,就存在扩散,如果衍生慢(必然流速低)、管路长扩散问题就会比较严重,再有就是要求有一套外源的泵系统和一个检测池,对于设备要求较高。 仪器管路的清洗 Agilent的液相,反相柱,想用异丙醇清洗下系统.用纯异丙醇,流速一般在0.2~0.4ml/min 先用甲醇-水,甲醇洗,再用异丙醇洗,流速低一点,根据你的压力决定,不要超过平时使用压力就可以了,洗完了,再用甲醇洗 把流通池拿掉,看基线,基本可以确定,问题在哪个方向,如果基线稳定,那就是流通池或者流动相或者泵什么的问题了.再有,检测器光路透镜老化什么的也会有这个情况,光电倍增管是否老化等 基线走不平一般是1.流动相脏,2.灯能量不够(流通池),3.系统有气泡,4.泵压力不稳。5.系统有杂质等。 10%异丙醇作用 冲洗泵头的,防止含盐流动相中的盐分结晶损毁宝石杆 开机就要用,控制一定的流速,不能太快也不能太慢 带缓冲盐的流动相一定要用,每分钟2-3滴的速度,虹吸,保持泵的宝石杆湿润,起保护作用的 安捷伦1200,灯使用时间大概半年,今晚把紫外灯关闭后冲洗柱子,两小时候开灯老显示紫外灯打开失败。怎么回事啊? 1.如果只是关2小时的话实际上就是浪费灯能量了 关一次一般就是8小时的能量损失

高效液相色谱法的标准操作规程

高效液相色谱法的标准操作规程 1 定义及概述: 1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法,其基本方法是将具不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相,用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱,注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后,各成分先后进入检测器,用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理,得到测定结果。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相,本法具有分离性能高、分析速度快的特点。 1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定,特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应,方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有:硅胶,用于正相色谱;化学键合固定相,根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱,其中最常用的是十八烷基硅烷(又称ODS)键合硅胶,可用于反相色谱或离子交换色谱;凝胶或玻璃微球等填充剂是有一定孔径的大孔填料,用于排阻色谱。 1.3 高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理组成。检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外—可见检测器。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱,可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求: 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程”的规定作定期检定,应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作,管路为无渗漏连结,流路中无堵塞或漏液,在设定的检测器灵敏度条件下,色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。

高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯

高效液相色谱(HPLC )法测定邻苯二甲酸酯 一、实验目的: 1. 了解高效液相色谱仪原理; 2. 学习高效液相色谱仪的基本操作方法; 3. 利用高效液相色谱仪测定邻苯二甲酸酯、邻苯二乙酸酯、邻苯二丁酸酯的峰图和含量。 二、实验原理: ① 高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography \ HPLC )是色谱法的一个重要分支,以液体为流动相,采用高压输液系统,将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,在柱内各成分被分离后,进入检测器进行检测,从而实现对试样的分析。高效液相色谱法有“四高一广”的特点:高压、高速、高效、高灵敏度和应用范围广。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。 在高效液相色谱中,若采用非极性固定相,如十八烷基键合相,极性流动相,即构成反相色谱分离系统。反之,则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低,应用也更为广泛。 定量分析时,为便于准确测量,要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度(R )的计算公式为: R = 2[t (R2)-t (R1)] /1.7*(W 1+W 2) //式中 t (R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间;t (R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间; W 1 及W 2为此相邻两峰的半峰宽。 除另外有规定外,分离度应大于1.5。 ② 本实验对象为邻苯二甲酸酯,又称酞酸酯,缩写PAE ,常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品,如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。 但研究表明,邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用,是一类内分泌干扰物。同时也有一定的致癌作用。 如果要检测不同条件对谱图分离的影响,可按表1配制几种物质的混合溶液,在不同条件下进行HPLC 分离检测。 三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪,50ul 微量注射器。 2、试剂 甲醇(色谱专用) ,高纯水,样品。 出峰次序 样品组成 1 邻苯二甲酸二甲酯(DMP ) 2 邻苯二甲酸二乙酯(DEP) 3 邻苯二甲酸二丁酯(DBP)

高效液相色谱法测定有机化合物的含量

实验四高效液相色谱法测定有机化合物的含量 [目的要求] 1、了解仪器各部分的构造及功能。 2、掌握样品、流动相的处理,仪器维护等基本知识。 3、学会简单样品的分析操作过程。 [基本原理] 高效液相色谱仪液体作为流动相,并采用颗粒极细的高效固定相的主色谱分离技术,在基本理论方面与气相色谱没有显著不同,它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。与气相色谱相比,高效液相色谱对样品的适用性强,不受分析对象挥发性和热稳定性的限制,可以弥补气相色谱法的不足。 液相色谱根据固定向的性质可分为吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱和大小排阻色谱。其中反相键合相色谱应用最广,键合相色谱法是将类似于气相色谱中固定液的液体通过化学反应键合到硅胶表面,从而形成固定相。若采用极性键合相、非极性流动相,则称为正相色谱;采用非极性键合相,极性流动相,则称为反相色谱。这种分离的保留值大小,主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。 反相键合相色谱采用醇-水或腈-水体系作为流动相,纯水廉价易得,紫外吸收小,在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用最广泛的反相键合相是十八烷基键合相,即让十八烷基(C18H37―)键合到硅胶表面,这也就是我们通常所说的碳十八柱。 [仪器试剂] 高效液相色谱仪(包括储液器、高压泵、自动进样器、色谱柱、柱温箱、检测器、工作站)、过滤装置 待测样品(浓度约100 ppm)、甲醇、二次水 [实验步骤] 1、仪器使用前的准备工作 (1)样品与流动相的处理 配好的溶液需要用0.45 μm的一次性过滤膜过滤。纯有机相或含一定比便例有机相的就要用有机系的滤膜,水相或缓冲盐的就要用水系滤膜。 水、甲醇等过滤后即可使用;水放置一天以上需重新过滤或换新鲜的水。含稳定剂的流动相需经过特殊处理,或使用色谱纯的流动相。 (2)更换泵头里清洗瓶中的清洗液 流动相不同,清洗液也不同,如果流动相为甲醇-水体系,可以用50%的甲醇;如果流动相含有电解质,通常用95%去离子水甚至高纯水。 如果仪器经常使用建议每周更换两次,如果仪器很少使用则每次使用前必须更换。(3)更换托盘里洗针瓶中的洗液 洗液一般为:50%的甲醇。

高效液相色谱法测定食物中氨基酸含量 北京液相色谱仪分析案例

食物中氨基酸含量的高效液相色谱法测定 一、简介 测定食物中氨基酸含量一般采用氨基酸分析仪,柱后衍生测定,但氨基酸分析仪价格昂贵,分析时间长,且只能用于分析氨基酸,限制了氨基酸分析技术的广泛应用。七十年代以来,柱前衍生高效液相色谱法开始应用于氨基酸的测定。液相色谱通用性强,检测灵敏度高,可用于多种物质的分析。 南京科捷应用研究所采用柱前衍生紫外检测的方法对几种食物中的16种氨基酸进行了测定。 二、LC-10Tvp梯度高效液相色谱仪配置 LC-10Tvp高压恒流泵:2台 SPD-10Tvp紫外检测器:1台 SCL-10Tvp 系统控制器:1台 7725i手动进样阀: 1套 色谱工作站:1套(VI2010、N2000、N3000选用) 液相色谱柱:1支(C18 4.6*250mn,5um) 微量进样器:1支(50ul/100ul) 进样支架:1只(进样阀用) 三、LC-10Tvp梯度高效液相色谱仪特点 LC-10Tvp梯度高效液相色谱仪是南京科捷分析仪器有限公司为了快速地满足多样化的客户需求,在原有的STI501液相色谱仪的基础上经过优化,利用美国先进技术开发设计,国内加工生产的的一款新型的液相色谱仪。LC-10Tvp等度高效液相色谱仪实现了人机对话,可实时对仪器的运行状态进行监控,并可对潜在和已出现的故障做出判断,同时提供在线解决方案。该仪器也全面实现了远程的准无人操作,大大提高了仪器的使用效率,同时通过高精度的AS1000自动进样系统,实现自动化进样,最大程度抑制了样品的交叉污染,提供样品分析精度。LC-10Tvp等度高效液相色谱仪可广泛应用于研究开发、医药检验、食品检测、化工分析、环境监测等众多分析领域。 主要特点 丰富的功能——符合客户对分析的不同需求 硬件具有VP功能,记录维护信息和操作记录,符合GLP/GMP要求;系统控制器增具有时钟、温度计、湿度计等人性化设计的功能。

高效液相色谱测定法标准操作规程

标准操作规程 STANDARD OPERATION PROCEDURE 1 目的:建立高效液相色谱测定法操作规程,以使检验操作规化。 2 适用围:适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。 3 责任:QC人员对本SOP实施负责。 4容 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱,对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品,由流动相带入色谱柱,各组分在柱被分离,并进入检测器检测,由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1. 对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据 处理系统组成。色谱柱径一般为3.9~4.6mm,填充剂粒径为3~10μ m。超高效液相色谱仪是适应小粒径(约2μm)填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 4.1.1. 色谱柱反相色谱柱:以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合 物复合硅胶和聚合物等;常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱:用硅胶填充剂,或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱:用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱:用手性填充剂填充而成的色谱柱。色谱柱的径与长度,填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量,填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能,应根据被分 离物质的性质来选择合适的色谱柱。温度会影响分离效果,品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温,应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度,但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱,流动相pH值一般应在2? 8 之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相,适合于pH 值小于2 或大于8 的流动相。

柱前和柱后衍生高效液相色谱分析氨基酸方法进展与评述

柱前衍生和柱后衍生高效液相色谱分析氨基酸方法的进展与评述 美瑞泰克有限公司中国代表处整理 柱前和柱后衍生高效液相色谱分析氨基酸方法进展与评述 以下主要对两种类型的七种应用广泛的氨基酸分析方法进行介绍,讨论和研究。 1、柱前衍生技术和反向色谱分离 氨基酸à衍生物à色谱分离 1.1 AQC(6-氨基喹啉基-N-羟基-琥珀酰亚氨基甲酸酯)法 优点:能同时检测一级二级氨基酸,检出现1pmole 缺点:pH值和洗脱温度要求控制准确。 1.2 PITC(异硫氰酸苯酯)法 缺点:PITC试剂进入柱子使柱填料过早的老化,柱子寿命降低,因此过量的衍生剂需要真空干燥除掉,为此,仪器要附设衍生及真空干燥装置。(主要用在生物饲料及食品分析中应用) 1.3 OPA (邻苯二甲醛-巯基乙醇) 缺点:OPA只能与伯氨反应,使二级氨不能同时被检测。由于反向柱分离过程中会有部分衍生物发生裂解,致使OPA-氨基酸的稳定性很差,尤其是胱氨酸和赖氨酸衍生物信号衰减较快,灵敏度低。 1.4 DANSYL-Cl(丹磺酰氯)法 优点:同时可以检测1,2级氨基酸同时能够准确的测定样品中的胱氨酸。 缺点:衍生物在紫外光下不稳定,特别是蛋氨酸对紫外光十分敏感,收率很低,因此衍生反应必须避光进行,而且反应最好要在室温下进行40min左右,如果温度高于45度降低衍生物的产率。 1.5 FMOC-Cl(芴甲氧羟基氯)法 2 柱后衍生技术和阳离子交换色谱分离 2.1 OPA(邻苯二甲醛-巯基乙醇)法 优点:程序化柱后衍生,OPA以极快的速度于氨基酸反应成发荧光团物质,又在很短的时间内进入灵敏度很高的荧光检测器检测,消除了柱前手动衍生是衍生物不稳定的因素,该方法具有较高的分辨率和灵敏度。 2.2 Nin-hydrin(茚三酮)法 优点:程序化衍生,衍生反应速度快(60S),衍生物稳定性好,衍生试剂能同时与一级和二级氨基酸反应并同步检测。 缺点:衍生物只能用紫外检测器检测,使灵敏度较低而不适合微量氨基酸测定;衍生反应条件要求较高,需要附设加温衍生装置,仪器造价高;流动相与衍生液同时泵入体系,体系平和时间较长长。 综上所述:经过改进和完善的柱后衍生,离子交换色谱法,仪器已具备很高的自动化水平,被分离出来的氨基酸在特有的诸侯氧化剂衍生设备中按固定程序与衍生剂迅速反应并被检测,消除了个样品由于衍生时间,衍生温度等因素的差异带来的测试误差,实践证明该方法是继稳定性分辨率,分离度具佳的可靠的氨基酸分析方法,而衍生试剂不直接计入色谱柱,使柱寿命延长时柱后衍生法的一明显优势。 柱前——柱后衍生对照表 自动化程度衍生物的稳 定性柱子的损害前处理氨基 酸 分析的种类一次性设备 投入 柱前衍生法低低大繁琐18-26种小柱后衍生法高高小简单22-45种大

高效液相色谱测定法标准操作规程

标准操作规程 1目的:建立高效液相色谱测定法操作规程,以使检验操作规化。 2适用围:适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。 3责任:QC人员对本SOP实施负责。 4容 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱,对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品,由流动相带入色谱柱,各组分在柱被分离,并进入检测器检测,由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱径一般为3.9~4.6mm,填充剂粒径为3~10μm。超高效液相色谱仪是适应小粒径(约2μm)填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 4.1.1.色谱柱 反相色谱柱:以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等;常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱:用硅胶填充剂,或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱:用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱:用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的径与长度,填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量,填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能,应根据被分

离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果,品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温,应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度,但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱,流动相pH值一般应在 2?8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相,适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。 4.1.2.检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器,包括二极管阵列检测器,其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器,其响应值不仅与被测物质的量有关,还与其结构有关;蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器,对所有物质均有响应。结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定围呈线性关系,但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系,一般需经对数转换。 不同的检测器,对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法(通则0401)项下对溶剂的要求;采用低波长检测时,还应考虑有机溶剂的截止使用波长,并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 4.1.3.流动相 反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统,用紫外末端波长检测时,宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐,如需用时,应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时,流动相中有机溶剂一般不低于5%,否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。 正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂,如二氯甲烷和正己烷等。 品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外,其余如色谱柱径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等,均可适当改变,以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时,当小比例组分的百分比例X小于等于33%时,允许改变围为0.7X?1.3X;当X大于33%时,允许改变围为X—10%?X+10% 。

最新高效液相色谱法测定维生素C

高效液相色谱法测定维生素C的含量 【摘要】高效液相色谱法已经成为解决生命科学、医药学发展中各种难题的重要手段,在实验室中也广泛应用于物质的定性定量分析。本实验中利用高效液相色谱法对维生素C进行定量分析,所采用的定量分析方法为外标法,通过做出标准溶液浓度与峰面积的标准曲线进而对样品中的维生素C进行定量检测。 【关键词】高效液相色谱法、维生素C、含量 1、引言 维生素 C(Vitamin C, Vc)又叫抗坏血酸,是一种水溶性维生素。Vc 在体内参与多种反应,如氧化还原过程,在生物氧化和还原作用以及细胞呼吸中起重要作用。人体内缺乏 Vc 时容易导致坏血病。同时,由于 Vc 是一种水溶性的强有力抗氧化剂并参与胶原蛋白的合成,它同时还具有防癌、预防动脉硬化、治疗贫血、抗氧化和提高人体免疫力等功效。Vc 在蔬果中普遍存在,尤其是柑桔类水果中含量较高。樱桃、番石榴、辣椒、猕猴桃等水果中 Vc 含量在 50-300 mg/100 g。 溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时,由于与固定相(stationary phase)发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同,在固定相中滞留时间不同,从而先后从固定相中流出。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography,HPLC)是在经典液相色谱法的基础上,于 60 年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀,小颗粒具有高柱效,但会引起高阻力,需用高压输送流动相,故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography,HPLC)。HPLC 系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等,现代 HPLC 仪还有微机控制系统,进行自动化仪器控制和数据处理。制备型 HPLC 仪还备有自动馏分收集装置。 2、HPLC测定维生素C的含量 2.1、仪器试剂 2.1.1、仪器 高效液相色谱仪(Agilent1260),色谱柱:C18 柱 (250 mm×4.6 mm, I.D.5 μm);平头进样器。 2.1.2、试剂 乙腈(色谱纯),冰乙酸,维生素 C,磷酸二氢钾等均为分析纯,实验用水为超纯水。

氨基酸分类

氨基酸分类一、总表

20种氨基酸密码子表 二、分类 1. 根据氨基酸分子中所含氨基和羧基数目的不同,将氨基酸分为中性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸: 2. 根据氨基酸的极性分类:

其中,属于芳香族氨基酸的是:色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸 属于亚氨基酸的是:脯氨酸 含硫氨基酸包括:半胱氨酸、蛋氨酸 3. 按其亲水性、疏水性可分为: 4. 其它的分类方法 天然的氨基酸现已经发现的有300多种,其中人体所需的氨基酸约有22种,分非必需氨基酸和必需氨基酸(人体无法自身合成)。另有酸性、碱性、中性、杂环分类,是根据其化学性质分类的。 1、必需氨基酸(essential amino acid):指人体(或其它脊椎动物)不能合成或合成速度远不适应机体的需要,必需由食物蛋白供给,这些氨基酸称为必需氨基酸。共有8种其作用分别是: ①赖氨酸(Lysine ):促进大脑发育,是肝及胆的组成成分,能促进脂肪代谢,调节松果腺、乳腺、黄体及卵巢,防止细胞退化; ②色氨酸(Tryptophane):促进胃液及胰液的产生; ③苯丙氨酸(Phenylalanine):参与消除肾及膀胱功能的损耗; ④蛋氨酸(又叫甲硫氨酸)(Methionine);参与组成血红蛋白、组织与血清,有促进脾脏、胰脏及淋巴的功能; ⑤苏氨酸(Threonine):有转变某些氨基酸达到平衡的功能; ⑥异亮氨酸(Isoleucine ):参与胸腺、脾脏及脑下腺的调节以及代谢;脑下腺属总司令部作用于甲状腺、性腺; ⑦亮氨酸(Leucine ):作用平衡异亮氨酸; ⑧缬氨酸(Viline):作用于黄体、乳腺及卵巢。 其理化特性大致有: 1)都是无色结晶。熔点约在230°C以上,大多没有确切的熔点,熔融时分解并放出CO2;都能溶于强酸和强碱溶液中,除胱氨酸、酪氨酸、二碘甲状腺素外,均溶于水;除脯氨酸和羟脯氨酸外,均难溶于乙醇和乙醚。 2)有碱性[二元氨基一元羧酸,例如赖氨酸(lysine)];酸性[一元氨基二元羧酸,例如谷氨酸(Glutamic acid)];中性[一元氨基一元羧酸,例如丙氨酸(Alanine)]三种类型。大多数氨基酸都呈显不同程度的酸性或碱性,呈显中性的较少。所以既能与酸结合成盐,也能与碱结合成盐。

测定氨基酸的方法以及试剂

一采用氨基酸自动分析仪测定氨基酸 1.氨基酸测定原理: 食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸,经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后,与茚三酮溶液产生颜色反应,再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。 2.测定氨基酸所用仪器: 真空泵;恒温干燥箱;水解管:耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管,体积20~30mL。用去离子水冲洗干净并烘干;真空干燥器(温度可调节);氨基酸自动分析仪。 3.测定氨基酸所用试剂及其配制方法: 3.1试剂:全部试剂除注明外均为分析纯,实验用水为去离子水。 浓盐酸(优级纯);苯酚(须重蒸馏); 混合氨基酸标准液(仪器制造公司出售):0.00250mol/L; 不同pH值柠檬酸钠缓冲液;氢氧化锂(LiOH·H2O);冰乙酸(优级纯);二甲基亚砜(C2H6OS);水合茚三酮(C9H4O3·H2O);还原茚三酮(C18H10O6·2H2O);NaOH;高纯氮气(纯度99.99%);冷冻剂:市售食盐与冰按1∶3混合。 3.2试剂配制方法: 3.2.1. 6mol/L盐酸∶浓盐酸(3.1)与水1∶1混合而成。 3.2.2. pH2.2的柠檬酸钠缓冲液:称取19.6g柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)和16.5mL浓盐酸加水稀释到1000mL,用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.2。 pH3.3的柠檬酸钠缓冲液:称取19.6g柠檬酸钠和12mL浓盐酸加水稀释到1000mL,用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至3.3。 pH4.0的柠檬酸钠缓冲液:称取19.6g柠檬酸钠和9mL浓盐酸加水稀释到1000mL,用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。 pH6.4的柠檬酸钠缓冲液:称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠(优级纯)加水稀释到1000mL,用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。 3.2.3. 茚三酮溶液 pH5.2的乙酸锂溶液:称取氢氧化锂(LiOH·H2O)168g,加入冰乙酸(优级纯)279mL,加水稀释到1000mL,用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至5.2。 茚三酮溶液:取150mL二甲基亚砜(C2H6OS)和乙酸锂溶液(3.6.1)50mL加入4g水合茚三酮(C9H4O3·H2O)和0.12g还原茚三酮(C18H10O6·2H2O)搅拌至完全溶解。 二.液相法测定氨基酸 柱前衍生法:参见文献(高效液相色谱柱-前衍生化法测定饲料中的含硫氨基酸 柱前衍生化反相高效液相色谱法测定板蓝根中的氨基酸 高效液相色谱法测定酶促反应液中的L-半胱氨酸含量) 1.仪器:Waters2695 HPLC; Waters2998 PDA检测器;电热恒温鼓风干燥箱 色谱柱:Phenomenex Luna C18 (250mm×4.6mm,5μm) 试剂:流动相A:0.1mol/L醋酸钠缓冲液(以醋酸调pH6.5)-乙腈(93:7) 流动相B:乙腈-水(4:1) 梯度洗脱 检测波长:254nm 2.试剂:衍生试剂:PITC(异硫氰酸苯酯);浓盐酸;三乙胺;正己烷;苯酚;氨基酸标准品衍生化试剂的配制方法:1mol/L三乙胺-乙腈溶液:取三乙胺7mL加乙腈稀释至50Ml 0.01mol/L PITC-乙腈溶液:取PITC 60μL加乙腈稀释至50mL

高效液相色谱(HPLC)柱效测定

实验六高效液相色谱(HPLC)柱效测定 093858 张亚辉 一. 实验目的 1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。 2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。 3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。 二. 实验原理 高效液相色谱法是以液体作为流动相,借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。 在高效液相色谱中,若采用非极性固定相,如十八烷基键合相,极性流动相,即构成反相色谱分离系统。反之,则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低,应用也更为广泛。 定量分析时,为便于准确测量,要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度(R)的计算公式为: R= 2[t(R2)-t(R1)] /1.7*(W1+W2) 式中 t(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间; t(R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间; W1及W2为此相邻两峰的半峰宽。除另外有规定外,分离度应大于1.5。 本实验对象为邻苯二甲酸酯,又称酞酸酯,缩写PAE,常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品,如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。但研究表明,邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用,是一类内分泌干扰物。待测物性质见表1。 表1色谱柱测试条件

如果要检测不同条件对谱图分离的影响,可按表1配制几种物质的混合溶液,在不同条件下进行HPLC分离检测。 三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪,50ul微量注射器。 2、试剂 甲醇(色谱专用),高纯水 四. 实验步骤 1、色谱条件 色谱柱:辛烷基硅烷键合硅胶(C8) 柱温:室温 流动相:初始为高纯水:20%,甲醇:80% 检测器:DAD检测器; 检测波长:220nm; 进样体积:20μl定量环,实际注射每次可控制在40μl。 2、待测溶液的配制 首先用甲醇做溶剂配制储备液:邻苯二甲酸二甲酯(0.3880g/L),邻苯二甲酸二乙酯(0.2770g/L),邻苯二甲酸二丁酯(0.3776g/L)。然后各取1mL储备液用水和甲醇(20:80)稀释至10mL,作为待测溶液。 3、色谱测定 (1) 按操作规程开启电脑,开启脱气机、泵、检测器等的电源,启动Agilent 1100在线工作软件,设定操作条件。流量为1.000ml/min。 (2) 待仪器稳定后,开始进样。将进样阀柄置于“LOAD”位置,用微量注射器吸取混合物溶液40ul,注入仪器进样口,顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置,此时显示屏显示进样标志。 (3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。 (4) 实验完毕,清洗系统及色谱柱。依次用甲醇-水(60:40)、甲醇-水(70:30)……直到纯甲醇作流动相清洗,每次清洗至基线走稳,至少清洗15min。 五.实验结果

高效液相色谱法测定水样中的苯酚

实验三高效液相色谱法测定水样中的苯酚 一、实验目的 1.1熟悉HPLC仪器的各个部件及熟悉操作方法; 1.2掌握应用高效液相色谱法对苯酚的定性、定量分析; 1.3掌握水样中苯酚的测定。 二、实验原理 HPLC原理 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上,引用了气相色谱的理论,在技术上,流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.9′107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成,从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的检测器,可对流出物进行连续检测。特点 1.高压:液相色谱法以液体为流动相(称为载液),液体流经色谱柱,受到阻力较大,为了迅速地通过色谱柱,必须对载液施加高压。一般可达150~ 350×105Pa。 2. 高速:流动相在柱内的流速较经典色谱快得多,一般可达1~10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多,一般少于1h 。 3. 高效:近来研究出许多新型固定相,使分离效率大大提高。 4.高灵敏度:高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器,进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外,用样量小,一般几个微升。 5.适应范围宽:气相色谱法与高效液相色谱法的比较:气相色谱法虽具有分离能力好,灵敏度高,分析速度快,操作方便等优点,但是受技术条件的限制,沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法,只要求试样能制成溶液,而不需要气化,因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大(大于400 以上)的有机物(这些物质几乎占有机物总数的75% ~80% )原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计,在已知化合物中,能用气相色谱分析的约占20%,而能用液相色谱分析的约占70~80%。 高效液相色谱仪一般分为四个部分:高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。此外还可以根据一些特殊的要求配备一些附属装置,如梯度洗脱、自动进样及数据处理装置等,如图1所示。

PITC柱前衍生HPLC氨基酸比值测定

PITC柱前衍生高效液相法测定缩宫素氨基酸比值 一.前言 目前,氨基酸检测主要应用氨基酸自动分析仪和HPLC。随着HPLC的发展,使用HPLC技术分析氨基酸获得迅速发展。HPLC已成为一种较为理想的检测氨基酸的方法。HPLC检测氨基酸时,使用不同衍生剂反应后产生不同的衍生物,不同的衍生物所需色谱条件也有差别。查阅相关的研究报告,所使用的衍生剂及色谱条件也不尽相同。每种方法各有自己的优缺点,应根据所测样品的特性和仪器、试剂条件作出选择,最后选择异硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生法测定缩宫素氨基酸比值。 二.准备工作 主要设备和试剂 1.氨基酸分析专用柱(4.6×250,5um)1支 Agela公司 2.高效液相检测仪 1台安捷伦 3.十八种氨基酸 1套中检所 4.异硫氰酸苯酯 10瓶 Agela公司 5.三乙胺 2瓶 Agela公司 试剂配制 1.三乙胺乙腈溶液:取三乙胺1瓶,加乙腈8.6ml,混匀。 2.异硫氰酸苯酯乙腈溶液:取异硫氰酸苯酯1瓶,加乙腈2ml,混匀。 4℃ 3天 3.流动相A:称取三水醋酸钠25.3g(或无水醋酸钠15.2g),加水1400ml,用冰醋酸调节 pH6.5,用水使成1860ml,再加乙腈140ml,使成2000ml,0.45um醋酸纤维膜过滤。 4.流动相B:80%乙腈,0.45um有机膜过滤。 5.氨基酸标准贮备液 中检所十八种氨基酸,105℃3小时。使用十万分子一天平。 半胱氨酸是以胱氨酸折算成两份半胱氨酸进行计算。用0.1mol/L盐酸溶解至250ml。

衍生方法 取标准品(样品)0.2ml,加100mmol/L异硫氰酸苯酯乙睛溶液0.1ml,加1mol/L三乙胺乙睛溶液0.1ml,混匀,室温放置1小时,加入0.4ml正己烷,振摇,放置10分钟,取下层清液过滤后进样。 三.实验部分 1.色谱条件选择 1.1精密量取2ml氨基酸标准储备液,至20ml容量瓶,加0.1mol/L盐酸溶液至刻度。用以下3个方法进行检测。从而确定最佳洗脱条件。 方法1 流速:1ml/min 检测波长:254nm 柱温:40℃ 进样体积:2ul 洗脱梯度: 方法2 流速:1ml/min 检测波长:254nm 柱温:40℃ 进样体积:2ul 洗脱梯度:

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