活性污泥好氧异养菌群平板分离培养方法的改进_陈林海

应用与环境生物学报2006,12(3):424~426

Chi n J App lEnvi ron B i o l=ISSN1006-687X2006-06-25活性污泥好氧异养菌群平板分离培养方法的改进*

陈林海**李宗伟徐玉森1王雁萍李宗义秦广雍

(郑州大学离子束生物工程省重点实验室郑州450052;1郑州市污水处理厂郑州450000)

摘要自然温度(12~21e)、贫营养、活性污泥提取物等目前提高菌群可培养性的方法用于培养活性污泥好氧异养菌群的结果显示,这些方法均能显著提高平板培养基的分离培养能力.含活性污泥提取物的贫营养培养基A S EⅡ培养细菌的数量可占细菌总数的23.2%,在所有培养基中最高,而营养最丰富的培养基M R S培养细菌的数量只占细菌总数的8.82%,在所有培养基中最低.图1表4参14

关键词活性污泥;好氧异养菌群;平板分离培养;活性污泥提取物

CLC X703

I mprove m ent of P l ate Isolation M ethod for

A erobic H eterotrophic

B acteri cal Population i n A ctivated Sl udge*

C H EN L i n hai**,LI Zong w e,i XU Yusheng1,WANG Yanp i n g,LI Zongy i&Q I N Guangyong

(P rovi n ci a lK ey Labora t ory o f Ion Beam&B ioeng ineeri ng,Zh e ngzh ou Un iversit y,Zhengzhou450052,Ch i na)

(1Zheng zhou M unic i pa lW a ste wa ter Tre a t m ent P lan t,Zhengzhou450000,Ch i na)

Abstract N at ura l te m pera t ure(12~21e),poo r nu trien t,ex tract of activated sludge,etc.,wh i ch could e ffecti ve l y i m prove the cu lti vability of bacter i a communities,w ere appli ed i n the p l a te i so lati on of t he aerob ic heterotroph i c bac teria l populati on of acti va ted sludg e.T he resu lt show ed that these m ethods could sign ificantl y i m prove the cultivati on ab ilit y o f p l a te iso lati on.The cu lti vation ability o f poor nutr i ent ASEⅡ,w ith ex tract o f acti vated sl udge,cou l d cu lti vate23.2%of t he t o ta l bacter i a,and it w as the h i ghest a m ong all culture m ed i a.T heM R S,the richest nour i shment,only cu lti vati ng8.82%of t he tota l bacter i a,w as the lowest.F ig1,T ab4R e f14

K eyword s acti va ted sludg e;aerob ic heterotroph i c bacter i a l population;p late i solation;ex tract o f acti vated sl udge

CLC X703

自美国微生物学家Co l w ell等[1]1982年提出活的但不能培养(v i able but noncu lt urab le,VBNC)的微生物的概念后,大量研究证明了这种不能培养状态的普遍性.在活性污泥中,经典纯培养方法能够培养的细菌数量只占细菌总数的1%~ 15%[2,3].自上世纪80年代起,随着以16Sr RNA为主要基石的细菌分子分类学的发展,变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳、流式细胞术和荧光原位杂交等免培养技术(cu lti vation-i n-dependent technique)[4~7]成为研究活性污泥中菌群的主要手段,活性污泥中菌群的复杂性和多样性也因此很快被人类认识.免培养技术虽然是目前研究菌群多样性和菌群构成的最有效的手段之一,但在研究细菌的生理特性或揭示特定细菌在菌群中的功能时,该技术往往无能为力.因此,许多学者一直致力于拓宽菌群可培养性的研究,并找到了一些行之有效的方法,如降低温度、延长培养时间[8,9]、添加基质提取物[10]、使用贫营养培养基[11]等.

好氧异养细菌是污水处理厂曝气池内活性污泥中占绝对优势的菌群,该类菌群在污水有机污染物的生物降解中发挥着极其重要的作用.本文将自然温度(12~21e)、贫营养、活性

收稿日期:2005-08-08接受日期:2005-09-20

*国家"973"计划项目(2004CB719604)资助Supported by t he State "973"P roj ect of Ch i na

**通讯作者C orres pond i ng author(E-m ai:l chen li nah@i z https://www.360docs.net/doc/6c13581005.html,)污泥提取物等目前提高菌群可培养性的方法应用于活性污泥好氧异养菌群的分离培养,并对其培养效果进行初步评估,以期能为活性污泥好氧异养菌群的分离培养提供参考.

1材料和方法

1.1活性污泥和污水

活性污泥和污水取自郑州市王辛庄污水处理厂二号初沉池出口、二号曝气池中段或出口.该污水处理厂以处理生活污水为主,处理能力为日处理40@104t.

1.2COD测定

HAC H仪器法,使用仪器配套试剂.

1.3培养基

1.3.1LB培养基酵母提取物5.0g,蛋白胨10.0g,N aC l 10.0g,琼脂15.0g,自来水1.0L,p H=7.0,121e灭菌30 m i n.

1.3.2M R S培养基酪蛋白胨10.0g,牛肉提取物10.0g,酵母提取物5.0g,葡萄糖5.0g,乙酸钠5.0g,柠檬酸二胺

2.0 g,Tween801.0g,KH

2

PO

4

2.0g,M gS O

4

0.2g,M nSO

4

#H

2

O

0.2g,C aCO

3

20.0g,琼脂15.0g,自来水1.0L,p H=6.8, 115e灭菌30m i n.

1.3.3WW培养基初沉池出口处的污水(COD=193m g/

L)1.0L,琼脂15.0g,121e灭菌30m in.

1.3.4A SEⅠ培养基取曝气池出口处泥水混合液(M LSS =1500mg/L,污水COD=55mg/L)1.0L,121e灭菌30 m i n,中速定性滤纸过滤,用自来水补足滤液体积至1.0L,加入15.0g琼脂,121e灭菌30m i n.

1.3.5A SEⅡ培养基取曝气池中段泥水混合液(M LSS= 1500m g/L,污水COD=141m g/L)1.0L,制作方法同A SEⅠ.

1.3.6ASELB培养基和ASE M R S培养基A SEⅡ替代LB 和M RS配制过程中的自来水,121e灭菌30m i n.

1.4平板培养

取曝气池中段上层泥样活性污泥5mL置于具塞试管中,加入十余粒已灭菌玻璃珠,混匀器上震荡5~6m i n,制成活性污泥菌悬液,用相应平板培养基培养、计数.培养温度为37e 或自然温度(12~21e),24h后,每天进行菌落计数,直到平板培养基上的菌落相互重叠为止,各平板的最大计数作为各平板的最终计数.

1.5显微计数

采用显微镜直接计数法[12]对菌悬液中的细菌进行计数.血球计数板规格为每大格(0.1mm3)分25个中方格,每个中方格又分16个小方格.细菌数的计算公式为:1mL活性污泥中的总菌数=50000@A@B,其中A为5个中方格中的细菌总数,B为菌悬液稀释倍数.

1.6统计分析

由于细菌的平板计数数据服从泊松分布,先将计数数据进行平方根转化,便于用正态分布的统计方法对数据进行处理,方差分析使用SPSS13.0完成.

2结果与分析

2.1培养温度对菌群可培养性的影响

为了探索培养温度对菌群可培养性的影响,论文比较了LB培养基于37e和自然温度(12~21e)下培养好氧异养菌群的状况.在37e时,48h LB的培养能力达到最大(9.21%);而自然温度条件下,相同时间尚不见菌落,264h LB 的培养能力才达到最大(12.94%).LB在两种温度下的培养能力如表1所示.从表1可以看出,LB在自然温度下的分离培养能力明显高于在37e下的.独立样本均值相同性检验结果, t=4.25,P=0.011<0.05,说明二者之间的差异具有统计学意义.

表1不同温度下LB培养能力

T ab l e1Culti v ati on ab ilit y of LB at different te m pe ra t ures

培养温度

Cu lti vati on t e m perat u re(H/e)t/h

平板计数结果Plate coun t(n/106mL-1)

123平均M ean

可培养比例

Cu lti vab l e bact eri a(P/%)

3748504249479.21 12~21(自然温度N atural te m perat ure)2646859726612.94多数培养菌的适宜生长温度为37e.在37e下,菌群培

养过程中容易出现部分快速生长菌抑制其它细菌生长的情况.

自然温度(12~21e)条件下多数细菌生长很慢,这在一定程

度上能够克服菌群培养中部分细菌抑制其它细菌生长的缺点,

这正是很多研究采用降温法分离培养菌群的原因[9].本文以

下部分的分离培养均在自然温度(12~21e)条件下进行.

2.2营养状况对菌群可培养性的影响

LB、M R S和WW三种培养基的分离培养能力见表2.从表

2可知,在3种培养基中,尽管M R S培养基的营养最丰富,能

够培养的细菌数量却最少(8.88%);WW的营养状况最差,能

够培养的细菌数目却最高(17.84%),且随培养基营养程度下

降,分离培养能力呈现梯度上升趋势,即M RS

法均值多重比较结果表明,LB和M RS均值相同性检验结果P

=0.011<0.05,WW和M RS均值相同性检验结果P=0.005

<0.01,LB和M R S均值相同性检验结果P=0.031<0.05.该

结果说明,WW、LB和M RS三者相互间分离培养能力的差异

均具有统计学意义.

表2不同营养状况培养基分离培养能力

T able2Culti va tion ability of the media under d ifferent

nutriti on cond iti ons

培养基M ed i a

平板计数结果

Plate count(n/106mL-1)

123平均M ean

可培养比例

Cu lti vable bacteri a

(P/%)

M RS454348458.88 LB6063867013.67

培养基营养越丰富,对所培养菌的选择性就越强[8].因此,许多学者利用高稀释度(贫营养)的培养基来改善菌群的可培养性,并在土壤和海水菌群的培养中取得了成功[13,14].从本实验的结果来看,贫营养培养条件同样能改善活性污泥好氧异养菌群的可培养性.

2.3活性污泥提取物对培养基培养能力的影响

A SEⅠ、A SEⅡ和WW三种培养基的分离培养能力见表3.从表3可以看出,含活性污泥提取物的ASEⅠ和A SEⅡ的分离培养能力(21.57%和22.35%)均大大超过不含活性污泥提取物WW(16.61%)的培养能力.LSD法均值多重比较结果表明,ASEⅠ和WW均值相同性检验结果P=0.013<0.05;A SE Ⅱ和WW均值相同性检验结果P=0.009<0.01;A SEⅠ和A SEⅡ均值相同性检验结果P=0.768>0.05.该结果说明, A SEⅠ和A SEⅡ同WW分离培养能力的差异均具有统计学意义,而A SEⅠ和A SEⅡ间差异不显著.

表3含污泥提取物与不含活性污泥提取物培养基培养能力T ab le3Cultivati on ability of the m ed i a w it h and

w it hout ex tract o f acti va ted sludg e

培养基

M ed i a

平板计数结果

Plate count(n/106mL-1)

123平均M ean

可培养比例

Cu lti vable bacteri a

(P/%) ASEⅠ12210210511021.57

ASEⅡ12011510111422.35

WW7890868516.61

活性污泥提取物能显著提高培养基培养能力的主要原因也在于它能为许多细菌提供必需生长因子,从而使部分原培养

425

3期陈林海等:活性污泥好氧异养菌群平板分离培养方法的改进

基不能培养的细菌能在含活性污泥提取物的培养基中培养. 2.4平板培养基分离培养能力的比较

7种培养基的分离培养能力如图1所示.从图1可以看出,A SEⅡ的培养能力最高(23.2%),M RS最低(8.82%), A SE M RS和A SELB的分离培养能力分别明显较M RS和LB为高.S.N.K.多重比较法得到的均衡性子集(表4)显示,7种培养基按分离培养能力可分为M R S、A SE M RS、LB、A SELB、WW、A SEⅠ和A SEⅡ六个子集,各个子集间的差异显著水平均具有统计学意义(A=0.05),A SEⅠ和A SEⅡ同处在分离培养能力最高的子集,但两者之间的差异不显著(A=0.106).

A SE M RS和ASELB的营养状况分别同M R S和LB相近,但M RS和LB的分离培养能力均分别低于A SE M RS和A SELB,这再次说明活性污泥提取物能显著提高培养基的分离培养能力.A SEⅠ和A SEⅡ同属于含活性污泥提取物的贫营养培养基,两者的分离培养能力在供试培养基中最高.因此,可以推断,活性污泥提取物和贫营养在提高活性污泥好氧异养菌群可培养性时具有累加效应

.

图1不同培养基培养能力比较

Fig.1C o m parison of cu ltivation ab ility of d ifferentm ed ia ab ilit y

A SEⅠ和A SEⅡ虽能显著提高活性污泥好氧异养菌群的

可培养性,但要进一步拓宽该类菌群的可培养性,仍需借鉴目

前在土壤和海水中循序渐进的培养经验[11,13],分别找出活性

污泥好氧异养菌群中各小类群的适宜培养基和培养条件.

表4S.N.K.法多重比较均衡性子集

T able4S.N.K.mu lti ple co m parisons of m eans for groups i n homogeneous subsets

培养基M ed i a

数量

Num ber

子集Sub set(A=0.05)

123456 MRS36731.3

ASE M RS37786

LB38560.6

S.N.K.ASELB39035.9

WW39657

ASEⅠ310502.5 ASEⅡ310874.3 S i g.1111110.106

3结论

自然温度条件(12~21e)有利于活性污泥好氧异养菌群的分离培养,LB培养基在自然温度条件下的分离培养能力明显高于在37e下.

贫营养培养条件能显著提高培养基培养活性污泥好氧异养菌群的培养能力.活性污泥提取物能够显著提高培养基培养活性污泥好氧异养菌群的培养能力.

在自然温度条件(12~21e)下,含活性污泥提取物的贫营养培养基ASEⅡ的分离培养能力最强,而不含活性污泥提取物的富营养培养基M RS的培养能力最弱.

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426应用与环境生物学报Chi n J App lEnvi ron B i o l12卷