叶绿体的荧光染色与观察
姓名班级 13级生命基地班学号同组者：
科目细胞生物学实验实验题目叶绿体的分离与荧光观察
【实验题目】
叶绿体的分离与荧光观察
【实验目的】
1、通过对植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光
3、熟悉荧光显微镜的使用方法。
【实验材料与用品】
1. 器材：离心机、组织捣碎机、天平、荧光显微镜、烧杯、量筒、胶头滴管、刻度离心管
六层纱布，载玻片、盖玻片等
2. 材料：新鲜菠菜
3. 试剂：0.35 mol/L氯化钠溶液，0.01％吖啶橙(acridine orange)
【实验原理】
I.叶绿体分离的原理
匀浆破碎细胞：利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。
差速离心:颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速度也不同。依次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液中进行（0.35mol/L氯化钠溶液或0.4mol/L蔗糖溶液），以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。分离过程最好在0-5℃条件下进行：如果在室温下，要
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科目细胞生物学实验实验题目叶绿体的分离与荧光观察
迅速分离和观察。
II.差速离心
特点：介质密度均一，速度由高到低，逐级离心；
用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器；
沉降顺序：核---线粒体---溶酶体和过氧化物酶体---内质网与高尔基体---核蛋白体，可将细胞器初步分离，常需要进一步通过密度梯度离心再进行分离纯化。
III.①荧光的概念
光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态回到基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称为“光致发光”。紫外辐射、可见光以及红外辐射均可引起光致发光，如磷光和荧光。
荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并且立即退激发在极短的时间内能发射出比照射光波更长的光（如可见光），这种光就称为荧光，一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。荧光分为自发荧光或诱发荧光（次生荧光、续发荧光、间接荧光）。某些物质受激发光照射后可直接发出荧光，如叶绿素、血红素的火红色荧光或木质素的黄色荧光等，称为自发荧光（直接荧光)，某些物质本身不发荧光，但它经荧光染料染色后，再通过紫外线照射同样也能发出荧光，这样的荧光称为诱发荧光，如叶绿体被吖啶橙染色后可发出桔红色荧光。
②荧光的性质
1）吸收光，必须有激发光源
2）荧光波长＞激发波长（损失热能）
3）荧光强度极小于激发光的强度
4）有不同程度的衰减（影响因素：如温度、光、淬灭剂等；先拍照后观察）
5）荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率（在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和无荧光油）
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吖啶橙（AO）
1）探针特性：吖啶橙是三环杂芳香类荧光探针，既可以标记DNA，又可以标记RNA，用蓝光激发后能够发出绿、红两种荧光。
2）AO与核酸的结合分为强结合方式和弱结合方式两种：一种是嵌入核酸双链的碱基对之间，另一种是与单链核酸的磷酸发生静电间相互作用。
3）强结合方式：又称插入性方式，AO分子插入在核酸双链的碱基对之间，它们的结合能量为6-10kcal/mol探针，插入后的探针分子与核酸结合的更加稳定。每插入一个AO分子，双链结构就发生26度旋转，这样在一个位点上就限制了AO分子的插入数目，每隔三个碱基插入一个AO分子。这种方式的结合，主要是AO分子与DNA的结合，其荧光发射峰为530nm,呈绿色荧光。
4）弱结合方式：即静电吸引结合方式，带正电荷的AO分子与带负电荷的磷酸根结合，每个磷酸根的位点上均可结合一个AO分子，最大结合率为1:1.这种结合方式主要是AO分子与RNA的结合，其发射波长为640nm,呈红色荧光。
5）AO与核酸的结合方式在低浓度下最佳，此时插入性强结合方式占优势。
④ AO的主要作用
1）对细胞内单链或双链RNA或DNA定性和定量
2）分析核酸内部结构及含核酸的细胞成分构象
3）观察DNA凝胶电泳情况
4）作为胞内PH梯度显示剂，用来监测钠离子交换、钙离子诱导的质子梯度变化等。
IV. 荧光显微镜的操作及注意事项
1) 接通电源，打开启动装置开关；
2) 按starter按钮3-5秒以启动激发光源。注意starter键不能超过5秒。启动2-3分钟后方可稳定，启动15分钟内不得关闭电源，一旦关闭汞灯，3分钟内不得重启，用完后关闭main switch；
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3) 光路对中（换灯泡时进行）；
4）选择相对应的激发虑片、阻断虑片和双色镜。
5）放置样品，先在普通光镜下选择好要观察的视野；
6) 关闭普通光源后，撤开UV挡板，即可观察到样品的萤光情况
7）需要照相时，要及时拍照，否则可能拍不到萤光照片；
8) 观察结束后，关闭main switch，切断电源。
【实验步骤】
一、具体操作
1.选取新鲜嫩绿的菠菜叶，去叶梗及其粗脉，洗净擦干，称取30g放于150ml0.35M.的NaCl 溶液中；
2.将叶和液体同时装入组织捣碎机中（豆浆机中），匀浆3-5min，转速5000r/min；
3.将匀浆用纱布（6层）过滤于500ml烧杯中；
4.将滤液4ml在1000r/min下离心2min；
5.取上清液在3000r/min下离心5min（沉淀为叶绿体和细胞核混合物）；
6.将沉淀用2-3ml0.35M.的NaCl液悬浮；
7.取一滴悬液滴片，加盖玻片后显微镜下观察；
8.另外取一滴悬液滴片，再加一滴0.01%的吖啶橙染料混匀，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察。
9.取干净的菠菜叶子的下表皮的薄薄的一层几乎透明的一层做成装片进行观察，在普通显微镜以及荧光显微镜下分别观察气孔、保卫细胞等；
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【实验结果与分析】
I .实验结果
图1：普通光学显微镜下观察到的叶绿体（10*40）
图
2：局部放大图 图3：荧光显微镜下的未染色叶绿体 图
4：荧光显微镜下染色的叶绿体
图中圆形或椭圆形绿色颗粒状物质即为
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图5:荧光显微镜下的保卫细胞
II. 实验分析
普通光学显微镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。另外还有一些其他组织碎片，可能是在离心时，和叶绿体差不多大小的细胞核破碎物一同被离心下来；
荧光显微镜下未经吖啶橙染色的叶绿体，自发出火红色荧光，呈斑状点状分布在视野中，背景为黑色；叶绿体经激发光波照射后，自发荧光呈现火红色，悬液其他组分无自发荧光反应，且叶绿体在其悬液中呈现点状均匀分布，故观察到斑状分布的火红色荧光效果。
经吖啶橙染色后在荧光显微镜下观察，叶绿体呈橙黄色，叶绿体悬液中混有的细胞核碎片中的核酸经丫啶橙染色荧光反应呈现绿色；因载玻片材质问题，在荧光显微镜下也发出荧
光，在一定程度上影响了实验观察，因此在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片和无荧光盖玻片，这样背景呈黑色，叶绿体为橙黄色，细胞核碎片为绿色，效果会更加明显。
气孔两旁为保卫细胞，在荧光
显微镜下，可看到气孔的保卫
细胞呈肾形（含有叶绿体，自
发荧光），保卫细胞周围的表
皮细胞则不含叶绿体
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【注意事项】
1. 应选取新鲜嫩绿的菠菜叶，去叶梗及其粗脉，用组织捣碎机进行破碎；
2. 差速离心时要控制好离心的速度和时间，否则会影响叶绿体的分离，可能最终会无法观察到叶绿体；
3. 差速离心只能得到80%纯度的叶绿体，要想获得更纯的叶绿体，可以用密度梯度离心法；
4. 差速离心分离出的叶绿体中含有部分细胞核碎片，在荧光显微镜下观察时注意区分；5．注意荧光显微镜的操作方法和注意事项，切勿损坏仪器。
6. 离心结束后，用0.35%的氯化钠溶液悬浮，要保证充分混匀，避免沉淀堆积，影响对单个叶绿体的形态观察；
7. 制片时，注意所取的悬液应适量，保证视野的叶绿体的数量适宜；
8. 要得到完整的、有活性的叶绿体，须在低温下迅速提取，涂片后立即观察；
9. 利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察，会受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等，因此在进行荧光观察时应抓紧时间，必要时应先拍照，后观察；
10. 在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、无荧光盖玻片，以避免载玻片等发出的荧光影响观察；
实验五荧光显微镜的使用和细胞的荧光染色
实验五荧光显微镜的使用和细胞的荧光染色 【实验目的】 掌握荧光显微镜的原理和使用； 掌握生物材料荧光染色的原理和应用。 【实验原理】 吖啶橙（acridine orange，AO）是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为492nm，荧光发射峰为530nm（DNA）、640（RNA），它与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上。 在蓝光（502nm）激发下，细胞核发亮绿色荧光（约530nm），核仁和胞质RNA发橘红色荧光（>580nm）。吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示DNA、RNA两种核酸。 【实验用品】 1、器材 荧光显微镜、牙签、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸。 2、试剂 （1）0.1mol/l pH7.0 PBS液 A液：NaH2PO4·H2O 2.76g，加蒸馏水至100ml； B液：Na2HPO4·7H2O 5.36g，加蒸馏水至100ml；
取A液16.5ml＋B液33.5ml＋NaCl 8.5g，用蒸馏水稀释至100ml。（2）1%吖啶橙原液 取0.1g吖啶橙加蒸馏水稀释至100ml（临用时配制0.01%吖啶橙染液：将1%吖啶橙原液用pH7.0 PBS溶液稀释10倍）。 3、材料 口腔黏膜上皮细胞临时制片或人肝癌BEL-7402细胞爬片。 【方法与步骤】 （1）取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上。 （2）95%乙醇溶液固定5min。 （3）滴加0.01%吖啶橙染液5min。 （4）盖上盖玻片，吸水纸吸去盖玻片周围多余液体，镜下观察。 【结果与观察】 荧光显微镜下（选用蓝色激发滤片），可见含DNA的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA的细胞质及核仁显示橘红色荧光 体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色
实验五 叶绿体的分离与荧光观察
实验五叶绿体的分离与荧光观察 叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。 实验目的 一、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 二、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。 实验原理 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35 mol／L氯化钠或0.4 mol／L蔗糖溶液)中进行．以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000 r／min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3000 r／min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程最好在0～5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光．这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。 利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间．有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。 实验用品 一、器材 1．主要设备：普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。 2．小型器材：500ml烧杯2个，250ml量筒1个，滴管10支，10ml刻度离心管20支，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。 二、材料 新鲜菠菜。 三、试剂 0.35 mol／L氯化钠溶液，．0.01％吖啶橙(acridine orange)。 实验方法 一、叶绿体的分离与观察 1. 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于150ml 0.35 mol／L NaCI 溶液中，装入组织捣碎机。 2. 利用组织捣碎机低速(5 000 r／min)匀浆3~5min。 3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。
免疫荧光双染
免疫荧光双染 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法（double immu nofluoresce nee labeli ng method）也分为直接法和间接法。 冰冻切片荧光tunel +免疫荧光双标实验步骤 1、？冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固 定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 2、?修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走）， 在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织， 37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 3、？破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育 20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 4、？加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1? （TdT）? 和试剂2（dUTP）按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37 C恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。 5、?BSA封闭:将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次， 每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。 6、？加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗， 切片平放于湿盒内4 °孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、？加二
抗：玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min 。 8、？DAPI复染细胞核：切片用PBS( PH7.4)洗涤3次，每次5min。去除PBS 后在圈内滴加DAPI 染液，避光室温孵育10min。 9、封片：玻片置于PBS (PH7.4) 中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次 5min 。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。 10、?镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。 (紫 外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm， 发射波长515-555?nm；CY3 红光激发波长510-560，发射波长590nm) 石蜡切片荧光tunel +免疫荧光双标实验步骤 1、?石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I 15- 20min-二甲苯 n 15- 20min-无水乙醇I 10min-无水乙醇n 10min-95%酒精5min-90%酒精 5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗(冬天脱蜡时间稍微延长) 。 2、?修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止液体流走)， 在圈内滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释)覆盖组织， 37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次5min 。 3、?破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育 20min，将玻片置于PBS( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 4、？加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1?(TdT)? 和试剂2(dUTP)按2:29混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内， 37C恒温箱孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。 5、？BSA封闭:将玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次， 每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温圭寸闭30min。
实验三 叶绿体的分离与荧光观察
实验三叶绿体的分离与荧光观察 一、实验目的 1．了解差速离心法分离细胞成分的一般原理和方法。 2．掌握从植物叶组织中分离叶绿体的方法。 3．熟悉荧光显微镜的使用方法，并观察叶绿体的自发荧光和次生荧光。 4．熟悉利用叶绿体得率来测量叶绿素含量。 二、实验原理 叶绿体是是植物细胞中由双层膜围成，含有叶绿素能进行光合作用的能量转换细胞器。由于具有这一重要功能，所以它一直是植物学、细胞生物学和遗传学等的重要研究对象。 植物细胞被细胞壁所包围，因此实验中必须破碎细胞壁的同时保持叶绿体的完整。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器。将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离叶绿体等细胞器的常用方法。 差速离心就是根据一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，及离心力以及悬浮介质的粘度等因素进行的。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35 mol/L氯化钠或0.4 mol/L蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损坏。先将匀浆液在1 000 rpm的条件下离心2 min（以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞），然后在 3 000 rpm的条件下离心5 min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程最好在0～4℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 有些生物体内的物质受激光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光为次生荧光（或间接荧光）。叶绿体含有的叶绿素发出火红色荧光属于自发荧光，叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光属于次生荧光。 三、实验仪器、材料和试剂 1．设备与器材
吖啶橙荧光染色法
吖啶橙荧光染色法 【实验原理】 吖啶橙(acridine orange, A0)是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染 色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为492nm，荧光发射峰为530nm (DNA )、640 ( RNA )，它与双链DNA 的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光( 502nm) 激发下，细胞核发亮绿色荧光(约530nm)，核仁和胞质RNA发橘红色荧光(>580nm)。吖啶橙的阳离子 也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示DNA、RNA两 种核酸。 【实验用品】 1、器材 荧光显微镜、牙签、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸。 2、试剂 (1)0.1mol/l pH7.0 PBS 液 A 液：NaH2PO4?H2O 2.76g，加蒸馏水至100ml; B 液：Na2HPO4 ? 7H2O 5.36g，加蒸馏水至100ml; 取A 液16.5ml + B 液33.5ml + NaCl 8.5g，用蒸馏水稀释至100ml。 (2)1%吖啶橙原液 取0.1g吖啶橙加蒸馏水稀释至100ml (临用时配制0.01%吖啶橙染液：将1%吖啶橙原液用pH7.0 PBS溶液稀释10倍)。 3、材料 口腔黏膜上皮细胞临时制片或人肝癌BEL-7402细胞爬片。 (1 )取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上。 (2)95%乙醇溶液固定5min。 (3)滴加0.01%吖啶橙染液5min。 (4)盖上盖玻片，吸水纸吸去盖玻片周围多余液体，镜下观察。 【结果与观察】 荧光显微镜下(选用蓝色激发滤片)，可见含DNA的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA的细胞质及核仁显 示橘红色荧光 【注意事项】 (1 )制片后一定要晾干玻片，在进行后续步骤，否则会导致细胞脱落。 (2)每种荧光染料，均有自己的最适pH,此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长 将有所改变，因此荧光检测时要在一定的pH缓冲液中进行。
双标记免疫荧光染色
双标记免疫荧光染色 一、实验目的： 1.检测MT, IGF-1/FGF5与两个目的基因所表达的蛋白的共表达。 2.检测目的基因所表达的蛋白定位。 3.检测褪黑激素或细胞因子对目的基因高表达的影响以及表达规律。 二、实验材料： 1.试剂：多聚甲醛，目的基因一抗，自带荧光的二抗（地高辛－地高辛抗体，生物素－链霉亲和素）细胞核染料DAPI 2. 器材：激光共聚焦显微镜显微镜专用玻片，共聚焦专用培养皿。 三、实验步骤： 1.细胞培养： 取对数期细胞于6孔板培养24小时，放入共聚焦专用玻片，贴壁细胞爬片需要24小时，细胞数目达到4×104个细胞，设置两个以上六孔板分别为对照组和实验组； 2.实验组加药处理： 加入MT或IGF-1或FGF5处理24小时或48小时，72小时。 3.上镜前处理： 将玻片取出，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15min；PBS洗多次，加0.1%Triton-X100透化10min；PBS洗3次，5%FBS室温封闭一到数小时；PBS洗3次，将MT、FGF-5、IGF-1抗体(1：200)和目的基因(工作液)两两组合，共六组，按体积比1：1混匀，一起加到切片上，4℃过夜； 第二天，PBS洗3次，加入荧光二抗[加入TRITC(罗丹明)标记羊抗兔IgG(1：100)；37℃孵育30 min；加人FITC标记山羊抗鼠IgG(1：100)]，室温避光45min；（之后均为避光操作）PBS洗3次，加入核染料，n分钟；PBS洗3次，灭菌水洗2次； 取处理好的载玻片，写好组别，在正中央滴约30ul防猝灭剂，小心将盖玻片夹起，缓慢放下，不要产生气泡，避光晾干。 以PBs代替一抗作为阴性对照，省略一抗作空白对照。 4.镜检 四、结果预测： 1.共表达： 两个基因分别为阳性红色，绿色。共表达出现红绿重叠而呈现黄色荧光，显示蛋白定位。 2.正负表达：看荧光强弱。
实验一 叶绿体的分离与荧光观察
实验一叶绿体的分离与荧光观察 一、实验目的： （1）通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 （2）观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。 二、实验原理： 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。一次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体的分离应在等身溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体损伤。将匀浆液在1000r/min的条件下离心2 分钟，以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5分钟，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程最好在0℃~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和无荧光油。 三、实验用品： 1、材料：新鲜菠菜 2、试剂： （1）0.35mol/L氯化钠溶液 （2）0.01%吖啶橙（acridine orange） 3、器材： （1）主要设备：普通离心机，组织捣碎机，粗天平，荧光显微镜。 （2）小型器材：500ml烧杯2个，250ml量筒1个，滴管20支，10ml刻度离心管20支，试管架5个，纱布若干，无荧光载玻片和盖玻片各4片等。 四、实验方法： 1、叶绿体的分离与观察： （1）选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。 （2）利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆2~3分钟。 （3）将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。 （4）取滤液4ml在1000r/min下离心2min。弃去沉淀。 （5）将上清液在3000r/min下离心5分钟。弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混
免疫荧光双标操作方法及注意事项
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。 (1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。直接法简便可靠，但灵敏度较低。 (2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。 免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项 一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下： 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。 2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。 3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。 4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。 6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。 二、注意事项 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。 2、每次试验均需设置以下三种对照： (1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物; (3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。 三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。 2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey 血清。 5、其余事项同免疫荧光单标操作。 免疫组化双重染色方法和步骤 在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一
叶绿体的分离及荧光染色观察
叶绿体的分离及荧光染色观察 泮力菁 2011级生物基地 201100140091 同组者：商倩倩【实验目的】 1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离与纯化的原理和方法； 2、熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和间接荧光； 3、复习巩固制片及染色的基本技术。 【实验原理】 1、真核细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成。细胞质中含有若干细胞器和细胞骨架，这些结构被称为亚细胞组分。分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心两种。 2、差速离心和密度梯度离心： 差速离心法是在密度均一的介质中由低速到高速的逐级离心用于分离不同大小的物体。离心速度逐渐提高，样品会按先大后小的顺序沉淀。在差速离心中细胞器沉降的顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体和过氧化物酶体、内质网和高尔基体。最后为核糖核蛋白复合体。由于各种细胞器在大小和密度上可能相互重叠。一般差速离心2-3次，分离效果会好一些。差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞或细胞器，并且得到的产物纯度较低。若对产物纯度的要求较高，则需要密度梯度离心来分离纯化。 密度梯度离心法是利用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中。这种离心技术又可分为速度沉降和等密度沉降两种。速度沉降主要用于分离密度相近而大小不同的物体，而等密度沉降用于分离密度不同的物体。 叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器。它是一种比较大的细胞器，利用差速离心即可分离收集，然后用密度梯度离心纯化，便可用于各种研究。 3、荧光： 光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态进入基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称之为“光致发光”。紫外辐射，可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光。 荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并立即激发在极短的时间内能发射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。 荧光的性质：A、吸收光，必须有激发光源；B、荧光波长大于激发波长（损失热能）；C、荧光强度小于激发光的强度；D、有不同程度的衰减（影响因素：如温度、光。猝灭剂等，因此可以先拍照，后观察）；E、荧光强度取决于激发光强度，被检物浓度、荧光效率（在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和香柏油）。 荧光显微镜的光源有汞灯光源（提供激发光：U,V,B,G），疝灯光源：高峰值更宽，更稳定）。
免疫荧光染色
荧光免疫染色和DAPI染色实验 1．实验原理 免疫染色的实验原理类似于Western Blotting，两者都是运用抗体的特异性识别作用来显示目的蛋白，但是由于免疫染色需要在原位进行，而且蛋白没有经过富集，因此其实验难度较高。 实验的基本原理是：利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强。利用正常羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异性的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性。二抗可以特异性识别一抗的Fc区域，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的表达情况。 另外，免疫荧光实验由于其较高的敏感性可以显示出基因表达的亚细胞情况(核内，核外，膜上以及一些较大的细胞器上)，所以通常被用来作为基因定位的方法。 DAPI的中文名称是4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种常用的荧光染料，其作用机理与溴化乙锭（EB）等染色剂的机理类似：它们与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA 的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV （紫外光）的激发波长是356nm，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。 Jagielski M. et. Al在1976年首次运用该技术检测细胞培养中的支原体感染。后来随着技术的进步，该技术被运用于各种微生物的检测、生长监测，胚胎发育过程的检测，细胞周期的检测和各种核定位的实验。 本实验就是利用DAPI染色标记细胞核的位置。 免疫染色实验方法和步骤 免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)、免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等，可以参考如下步骤进行操作。 1. 样品准备(Sample preparation) 对于贴壁细胞： 可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培养细胞，然后到预定时间时进行固定等后续操作。 也可以用洁净的盖玻片，70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到6孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。这时就可以种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，即可进行固定等后续操作。 对于悬浮细胞： 把细胞先在固定液中固定，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。然后就可以进行后续操作。如果细胞的粘附能力不佳，可以在载玻片上用PDL等物质进行处理，以增强载玻片的粘附能力。 对于冷冻切片： 切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。 对于石蜡切片：
叶绿体的分离和观察
生命科学学院 Life Scie nee College 细 胞 生 物 学 实验报告 姓名：柳伟雄班级：2013级生科一班
山东大学实验报告 2015年5月10日 学号：2同组者：曾玮璠 姓名：柳伟雄 系年级：生科一班2013级 科目：细胞生物学实验 题目：叶绿体的分离和观察 一、目的和要求 1. 通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法 2. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法 、原理 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心， 是分离细胞器的常用方法。 一个颗粒在离心场中的 沉降速率取决于颗粒的大小、 形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。 在一给定的离心场中， 同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。 一次增加离心力和离心时间， 就能够使非均一悬 浮液中的颗粒按其大小、 密度先后分批沉降在离心管底部， 分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体 的分离应在等身溶液（0.35mol/L 氯化钠或0.4mol/L 蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体 损伤。将匀浆液在1000r/min 的条件下离心2分钟，以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。 然 后，在3000r/min 的条件下离心5分钟，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核） 。分离过程最好在 0C — 5C 的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检 测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即 拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和无荧光油。 三、试剂和器材 1. 材料：新鲜菠菜 2. 试剂：（1） 0.35mol/L 氯化钠溶液（2） 0.01%吖啶橙（acridine orange ） 3、 器材：（1 ）主要设备：普通离心机，组织捣碎机，粗天平，荧光显微镜 （2）小型器材：500ml 烧杯2个，250ml 量筒1个，滴管20支，10ml 刻度离心管 纱布若干，无荧光载玻片和盖玻片各 4片等 四、实验步骤 1. 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称 30g 于150ml 0.35mol/LNaCI 溶液中，装入组织捣 碎机 2. 利用组织捣碎机低速（5000r/min ）匀浆2— 3分钟 3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml 烧杯中 4. 取滤液4ml 在1000r/min 下离心2min ,弃去沉淀 同组者：曾玮皤 20支，试管架5个,
石蜡切片免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫荧光染色方 法 Prepared on 22 November 2020
对于石蜡切片： 1、烤片：60℃ 60分钟 2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入l柠檬酸钠，(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏 水中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。（也可不用去除内源性酶）。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。PBS洗3次，每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
石蜡切片免疫荧光染色方法
对于石蜡切片： 1、烤片：60℃ 60分钟 2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入0.01mol/l柠檬酸钠，pH6.0(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏水 中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。（也可不用去除内源性酶）。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。PBS洗3次，每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 PBS洗涤3次。每次5分钟。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项 来源：生物谷 2008-6-27 访问量：9826 评论（0）分享 一、免疫荧光的标本制作的基本程序同DAB显色的免疫组化，不同点如下： 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其它相同。 2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。 3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。 4、免疫荧光在封片使用专用封片剂或甘油：0.01MPBS （1：1）。 5、条件许可可以购买防淬灭的试剂加入封片剂中，标本可以保存更久。 6、荧光抗体的孵育以及后续处理需要闭光。 7、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要设定阳性和阴性对照。 二、注意事项 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。 2、每次试验时，需设置以下三种对照： （1）阳性对照：阳性血清+荧光标记物 （2）阴性对照：阴性血清+荧光标记物 （3）荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取primary antibodies时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，secondary antibodies则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。
2、我的做法是两种primary antibodies同时孵育，然后两种secondary antibodies同时孵育。抗体浓度、孵育时间要认真摸索，我感觉primary antibodies 4度孵育过夜比较好，背景比较干净。 3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是rabitt和rat的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 4、Block用的血清使secondary antibody来源动物的血清，我的是10%正常donkey血清。 5、其余同一般操作。 原代培养胚胎14天大鼠端脑细胞：在骨发生形态蛋白—{诱导下，乙酰胆碱转移酶(呈绿色荧光)和同源域蛋白Islet—1(呈红色荧光)共存于细胞质内(激光扫描共 聚焦显微镜观察) 1．一步双染色法先将两种荧光标{己抗体按适当比例混合(A+B)，按直接法进行染色。 2．二步双染色法先用TRITC标记的A抗体进行免疫荧光染色，再用FITC标记的B抗体染色，根据两种抗体的动物种属不同，可用直接法也可用间接法，结果A抗原呈现橘红色荧光，而B抗原呈现黄绿色荧光。在应用中，常用的方法是免疫荧光组织化学中间接法和SABC-Cy3法相结合。例如，在实验设计时，选择小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作为两种不同的特异性一抗，相匹配的二抗分别为FITC-抗小鼠IgG和生物素化—抗兔IgG。进行双重染色时，由于两种一抗种属来源不同，可把一抗混合使用。孵育结束后洗涤未结合的一抗，滴加二抗时，先加人生物素化—抗兔IgG(二抗)孵育，洗涤后，滴加SABC-Cy3复合物，经荧光显微镜下观察已出现特异性荧光，再进行FITC—抗小鼠IgG(二抗)的孵育，最后封片观察。其结果A抗原呈现绿色荧光，B抗原呈现红色荧光。此法应注意两种一抗在混合稀释时，抗体的终浓度应为每一种抗体的工作浓度。换言之，混合后的液体要同时满足两种一抗的工作浓度。若两种一抗种属来源相同，必须分两次进行双重染色，即先用第一种一抗和第一种荧光二抗对A抗原进行染色，洗涤后，用第二种一抗和第二种荧光二抗对B抗原进行染色，否则会出现交叉反应而使染色无特异性。 双重免疫荧光标记法 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
免疫荧光染色
免疫荧光一般步骤 固定液配制： 常用固定液为4%多聚甲醛，将40g多聚甲醛粉剂在三角烧瓶中溶于1000ml 0.1M PB溶液中,放入磁力转子置于加热磁力搅拌器中加热溶解，温度切忌超过70℃，温度过高会导致多聚甲醛解聚成为甲醛，遮蔽抗体影响抗原抗体结合，溶解后待其冷却，调节PH值至7.4，过滤后室温或4℃放置备用，配好后一个月内有效，最好现配现用。2.5％多聚甲醛(含苦味酸300ml／1000ml)亦是选择，由于渗透压的关系,缓中液改为NaH2PO4.２H2O 3.74g；Na2HPO4.12H2O45.11g（500ml:1.87g,22.55g） 灌注固定： 快速生理盐水冲净血液（约需要100ml即可），4%多聚甲醛灌注（快速充灌100ml 左右，再慢速滴150ml）。灌注用的针头前端要磨平，灌注小鼠可以用较粗的头皮针，仅留1cm，插入左心室即可，不必像大鼠那样插入主动脉根部。 取材 按要求不同取组织，取材部位一定要事先确定好，比如脊髓呈现节段性变化，只有取到正确的部位才能获得结果。坐骨神经对应的脊髓阶段（３，４，５）在第一腰椎下，第五腰椎下是第五神经节，对应髂前上棘（动物其实不叫这个名）前缘。 后固定及蔗糖脱水： 组织取材后切成小块放入4%多聚甲醛中，为后固定，建议4℃过夜，随后转入40%蔗糖溶液中脱水（不沉底），3天后即可用于冰冻切片。后固定时间亦不可过长。脱水不彻底表现为组织切片上空洞样组织破坏；固定不完全表现为微米染色集中在周边，组织内部不着色。蔗糖溶液亦用0.1M PB配制（见附录）。 冰冻切片： 漂染时，脊髓片厚可以25~30微米，神经节片厚要30微米 免疫荧光染色： 1.TBS溶液清洗组织片5分钟×2，有利于抗原抗体结合（可选） 2.封闭液（10％血清+1%BSA）＋0.3%triton-100*室温封闭2小时，亦可4℃过夜，除个别 膜抗原外，都需要加triton-100*;个人习惯的做法是把封闭液分装成1ml/管，保存在-20度，用前添加3微升triton-100 3.一抗孵育4℃过夜，一抗浓度需要通过预实验进行确定，比较常见的是１μｇ／ｍｌ。（一 抗稀释液见附录，建议用） 4.TBS溶液清洗组织片5分钟×3 5.二抗孵室温两小时或4℃过夜，感觉背景深的话,建议4℃过夜。 6.TBS溶液中置于摇床上清洗组织片5分钟×3 7.暗室内将组织片贴于载玻片上，室温晾干，载玻片最好经甲醛明胶处理过,防止粘不牢 脱片。微弱的光线对贴片造成相当的困难，特别是像神经节和小鼠脊髓这样的较小的切片，切片皱折，相互覆盖都会导致无法拍照，我的经验是可以用吸管将切片全部吸到载玻片上，然后尽量吸掉水，也可用毛笔等进一步去掉水份，然后室温晾干，大约一小时左右即可。光线方面也不是特别严格，可以用台灯的反射光进行照明，目前认为只要不是光线直射就可以。 8.90%甘油封片，注意汽泡。90%提前配好，用一个20ml玻璃小瓶或者试管，加入甘油和
实验1叶绿体的分离与荧光分析
中国海洋大学实验报告姓名：系年级：**级专业：生物科学 科目：分子细胞生物学实验学号：** 一、实验目的： （1）、通过对植物叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法 （2）、观察叶绿体的间接荧光，并了解荧光显微镜的使用方法 二、实验原理 颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。在一定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同，一次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小。密度的先后分批沉降在离心管的底部分批收集，即可获得各个亚细胞的组分。 叶绿体的分离应该在等渗溶液中进行，以免渗透压影响叶绿体，对其造成损伤。 在荧光显微镜下可以观察叶绿体的自发荧光和间接荧光。 三、实验材料 新鲜菠菜。 等渗溶液：0.35mol/L氯化钠溶液， 试剂：0.01%吖啶橙(acridine orange)
四、实验方法 １、叶绿体的分离 2、菠菜叶手撕片的制备 ①、下表皮因海绵组织较疏松，可以直接手撕下表皮的薄膜在显微镜下观察。
②、上表皮因栅栏组织较致密，可以用刀片将下表皮刮掉，在显 微镜下观察上表皮的细胞和气孔。 3、菠菜的叶绿体的观察 在普通光学显微镜下，将制得的手撕片放在载玻片的等渗溶液中，游离的叶绿体悬浊液点在在载玻片上，轻轻地盖上盖玻片（防止气泡 产生），即可观察。 在荧光显微镜下，将游离叶绿体悬浊液的的标本放在荧光显微镜下，先后用绿光、蓝光对其进行照射，在电脑上观察其产生的自发荧 光。 向手撕片的标本、游离叶绿体悬浊液的的标本中加入1-2滴 0.01% 吖啶橙染液，先后用绿光、蓝光对其进行照射，在电脑上观察 其产生的间接荧光。 五、实验结果 气孔保卫细胞 叶绿体 图1菠菜手撕片的标本中，上表皮及其气孔
高中生物实验 叶绿体的分离和荧光观察 实验报告
实验十一叶绿体的分离和荧光观察 一．实验目的 了解细胞匀浆和差速离心分级分离细胞组分的原理。了解提取叶绿体的基本原理及其过程，通过光学显微镜的观察了解体外分离的叶绿体的一般 形态，增加对叶绿体的感性认识。 掌握吖啶橙染色叶绿体的方法。 掌握显微数码拍照的方法。 二．实验内容 提取叶绿体，吖啶橙染色，观察染色结果。 显微数码拍照。 三．实验原理 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。 在一定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部。叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/LNacl或0.4mol/L 蔗糖溶液）中进行。离心后可得沉淀的叶绿体。 四．实验方法与步骤 1．取嫩叶3g，洗净去柄去叶脉，剪碎放入研钵中。 2．加4ml0.35mol/LNacl，研磨匀浆，尼龙布过滤于离心管中1ml。 3．1000rpm离心2分钟弃去沉淀。 4．3000rpm离心15分钟，弃去上清液，将沉淀用少量0.35mNacl悬浮。 5．提取叶绿体观察：①普通光镜②荧光光镜③加吖啶橙。 6．撕取叶表皮观察：①普通光镜②荧光光镜③加吖啶橙。 a．在普通光镜下，可看到叶绿体为绿色椒榄形，在高倍镜下看到叶绿体内部含有较深的绿色的绿色小颗粒即基粒。 b．在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光。 c．加入吖啶橙染后，叶绿体可发也桔红色荧光。而其中混有的细胞核发
出绿色荧光菠菜叶手切片观察。 d．在普通光镜下可以看到三种细胞：表皮细胞：为边缘吐锯齿表的鳞片状细胞。保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。叶肉细胞：为排成栅状的长形和椭圆形细胞。 5．显微数码拍照。 五．实验结果
叶绿体分离与荧光染色观察
叶绿体分离与荧光染色观察
日 姓名系年级组别同组者 科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号 叶绿体分离与荧光染色观察 一．实验目的 1．通过植物细胞叶绿体的分离与纯化，了解细胞器分离与纯化的原理和方法。 2．熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和次生荧光。 二．实验原理 1．叶绿体分离的原理 匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。 差速离心：颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一
日 姓名系年级组别同组者 科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号 时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速率不同。 依次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L的氯化钠或0.4mol/L的蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。分离过程最好在0-5℃的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。 2．差速离心 特点：介质密度均一，速度由高到低，逐级离心；
日 姓名系年级组别同组者 科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器； 沉降顺序：核----线粒体----溶酶体与过氧化物酶体----内质网与高尔基体---核蛋白体，可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。 3．荧光的概念 光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态回到基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称为“光致发光”。紫外辐射、可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光。 荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并且立即退激发在极短的时间