大鼠Sirt1基因原核表达质粒的构建及融合蛋白表达
万方数据
重组质粒转化的Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１宿主菌在５ｍｌＬＢ（含０．１ｇ／Ｌ卡那霉素）培养基中培养过夜。取２００山过夜菌液转接至１００ｍｌ含卡那霉素的ＬＢ中，待ＯＤＡ６００值达０．４—０．６时加入ＩＦｒＧ（Ｐｒｏｍｅｇａ公司），至终浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ，３７℃诱导表达５ｈ。收集诱导后的菌液，将其悬浮于８ｍｏｌ／Ｌ尿素裂解液中，超声破碎细菌，离心取上清加入Ｎｉ?ＮＴＡ亲和层析柱（Ｑｉａｇｅｎ公司）内，收集洗脱液，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳鉴定表达产物的分子量及纯化效果。
２结果
２．１ＲＴ－ＰＣＲ扩增结果将设计合成的引物，以逆转录合成的大鼠ｃＤＮＡ为模板，经ＰＣＲ扩增后显示在５００ｂｐ左右的扩增产物，与预期大小５０６ｂｐ相符。
２．２ｐＧＥＭ—Ｔ－Ｓｉｒｔｌ载体构建及鉴定重组的ｐＧＥＭ－Ｔ－Ｓｉｒｔｌ载体用ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ双酶切，琼脂糖凝胶电泳分析显示酶切产物大小约５００ｂｐ，说明已成功将目的片段连接于Ｔ载体（图１）。
Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１．ＲＴ－ＰＣＲ产物；２．ｐＧＥＭＴ－Ｓｉｒｔｌ酶切结果；
３．ｐＥＴ４１－Ｓｉｒｔｌ质粒；４．ｐＥＴ４１一Ｓｉｒｔｌ的酶切结果
图１大鼠Ｓｉｒｔｌ的ＲＴ－ＰＣＲ产物和重组质粒的
琼脂糖凝胶电泳分析
Ｍ蛋白Ｍａｒｋｅｒ；ｌ未经ＩＰＴＧ诱导的转化细菌蛋白；
２ｔＦｒＧ诱导后的转化细菌蛋白；３纯化后的重组蛋白
图２Ｓｉｒｔｌ重组蛋白表达及纯化的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ的分析结果
２．３表达载体的构建及鉴定连接了目的片段的ｐＥＴ４１－ｃ载体经双酶切，琼脂糖凝胶电泳分析显示在５００ｂｐ处有一条带，如图１。表明连接重组质粒的目的片段是正确的。经测序验证。目的基因插入片段序列正确。２．４蛋白表达及纯化结果根据目的片段的氨基酸序列计算，表达的蛋白应为１８．１ｋＤ，加上ｐＥＴ４１载体上的ＧｓＴ融合标签２９ｋＤ，实际表达蛋白分子量应约４７ｋＤ。经Ｎｉ．ＮＴＡ亲和纯化后，蛋白分子量与预测相符（图２）。
３讨论
Ｓｉｒ２属去乙酰化酶家族，其家族的共同特点是具有去乙酰化酶活性。去乙酰化在蛋白质翻译后调节中具有举足轻重的作用，与其他去乙酰化酶不同的是，Ｓｉｒ２只有在ＮＡＤ＋的参与下，才具有能够调节组蛋白的乙酰化状态¨Ｊ，维持染色体结构稳定，从而抑制靶基因转录，引起基因沉默，延长细胞寿命。尤其在低等生物中Ｓｉｒ２的高表达可以不同程度地延长寿命，由于Ｓｉｒ２基因从原核生物、酵母、线虫、果蝇、小鼠到人类有广泛分布且具高保守性Ｈｊｌ。因此，哺乳动物的同源基因Ｓｉｒｔｌ，可能参与调节哺乳动物细胞的生理代谢和细胞周期等过程。Ｓｉｆｔ家族有７个成员，其共同特征是拥有一个保守的由２００个左右的氨基酸残基构成的去乙酰化酶结构域。哺乳类Ｓｉｒｔｌ与酵母Ｓｉｒ２同源性最高。Ｓｉｒｔｌ蛋白定位于细胞核内，不仅能够使组蛋白去乙酰化，并且能够使ｐ５３，ｐ３００，ＦｏｘＯ，ＮＦ—ＫＢ等转录因子去乙酰化∞“’。其中抑癌基因ｐ５３的去乙酰化，能够抑制细胞的凋亡；ｐ３００去乙酰化后能减少对ｐ５３的活化，从而减少对其下游凋亡分子的激活，使细胞周期停滞，延长细胞存活时间。但在ＤＮＡ受损情况下，Ｓｉｒｔｌ引起ｐ５３去乙酰化，却不能提高细胞的生存率ｐ’，可能足细胞在不同应激状态下，启动的修复机制不同。研究还发现ｕ…，Ｓｉｒｔｌ敲除的小鼠表现出严重的胚胎发育异常，ｐ５３高乙酰化。适当限制热量摄入（Ｃａｌｏｒｉｅｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ，ＣＲ）能够有效延长细胞和生物寿命，延缓衰老及衰老相关的病理生理改变，其作用机制非常复杂。在ＣＲ的信号刺激下，Ｓｉｒｔｌ的含量和去乙酰化活性上调…’’”，而在Ｓｉｒｔｌ被敲除或被抑铆的情况下，降低了延缓衰老的效应。因此，Ｓｉｒｔｌ是ＣＲ引起下游信号作用中一个关键因子。在ＣＲ过程中，产生ＮＡＤ＋的含量或ＮＡＤ／ＮＡＤＨ比率升高，激活了Ｓｉａｌ的活性。在培养的神经细胞中，增加Ｓｉｒｔｌ和ＮＡＤ＋含量能够保护轴突不受损提高细胞存活率¨３１。Ｓｉａｌ加强了脂肪动员和有氧代谢ｎ４’１＂，能量产生增加；同时，Ｓｉａｌ增强对抗氧化酶活性的调节，增加了对氧化应激的抵抗力。然而最近也有研究提出置疑，他们发现ＣＲ的酵母同样也存在衰老的征象如ｒＤＮＡ的聚集，而降低ｒＤＮＡ的含量是不受Ｓｉｒ２影响的¨６１。因此，有人提出在ＣＲ延缓细胞衰老的过程中，Ｓｉｒ２并非唯一的介导因子。尤其在哺乳类细胞。仅靠Ｓｉｒｔｌ单个基因的调控还不足以调节其寿命长短，可能还需要Ｓｉｒｔ家族的其他成员参与。鉴于目前对Ｓｉａｌ在细胞调节的过程还远未了解清楚，本实验通过对Ｓｉｒｔｌ的核苷酸序列进行分析，选取其保守序列区的一段进行克隆和表达，期望获得有活性的Ｓｉｒｔｌ蛋白，为进一步研究其功能奠定了基础。
４参考文献
１ＫａｅｂｅｄｅｉｎＭ，ＭｃＶｅｙＭ，ＧｕａｒｏｎｔｅＬＴｈｅＳＩＲ２／３／４
ｃｏｍｐｌｅｘ
ａｎｄＳＩＩｉ２
ａｌｏｎｅ
ｐｒｏｍｏｔｅｌｏｎｇｅｖｉｔｙｉｎＳａｃｅｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｏｒｏｖｉｓｉａｅＩ，ｒｔｗｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍ∞ｈａｌＩｉ８ｍ（Ｊ】．ＧｅｎｅｓＤｅｖ，１９９９；１３（１９）：２５７０－８０．
２ＡｎｄｅｒｓｏｎＲＭ，Ｌａｔｏｒｍ－ＥｓｔｅｖｅｓＭ，ＮｅｖｅｓＡＲ，ｄ０２．Ｙｅａｓｔ
ｌｉｆｅ－ｓｌｍａ
ｅｘｔｅｌｌｏ 万方数据
万方数据
大鼠Sirt1基因原核表达质粒的构建及融合蛋白表达
作者：耿义群， 傅玉才， 徐小虎， 王伟， 许锦阶
作者单位：耿义群,徐小虎(汕头大学医学院法医学教研室,广东,汕头,515041)， 傅玉才,王伟,许锦阶(汕头大学医学院细胞衰老实验室)
刊名：
中国老年学杂志
英文刊名：CHINESE JOURNAL OF GERONTOLOGY
年，卷(期)：2007,27(5)
参考文献(16条)
1.Kaeberlein M;MeVey M;Guarente L The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms[外文期刊] 1999(19)
2.Anderson RM;Latorre-Esteves M;Neves AR Yeast life-span extension by calorie restriction is independent of NAD fluctuation[外文期刊] 2003(5653)
https://www.360docs.net/doc/6317570985.html,ndry J;Sutton A;Tafrov ST The silencing protein SIR2.and its homologs are NAD-dependent protein deacetylases 2000(11)
4.Imai S;Armstrong CM;Kaeberlein M Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase[外文期刊] 2000(6771)
5.Brachmann CB;Sherman JM;Devine SE The SIR2 gene family,conserved from bacteria to humans,functions in silencing,cell cycle progression,and chromosome stability 1995(23)
6.Daitoku H;Hatta M;Matsuzaki H Silent information regulator 2 potentiates Foxol-mediated transcription through its deacetylase activity 2004(27)
7.Bouras T;Fu M;Sauve AA SIRT1 deacetylation and repression of p300 involves lysine residues
1020/1024 within the cell cycle regulatory domain 1[外文期刊] 2005(11)
8.Yeung F;Hoberg JE;Ramsey CS Modulation of NF-kappaB-dependent transcription and cell survival by the SIRT1 deacetylase[外文期刊] 2004(12)
9.Solomon JM;Pasupuleti R;Xu L Inhibition of SIRT1 catalytic activity increases p53 acetylation but does not alter cell survival following DNA damage[外文期刊] 2006(01)
10.Cheng HL;Mostoslavsky R;Saito S Developmental defects and p53 hyperacetylation in Sir2 homolog (SIFT1)-deficient mice[外文期刊] 2003(19)
11.Cohen HY;Miller C;Bitterman KJ Calorie restriction promotes mammalian cell survival by inducing the SIRT1 deacetylase[外文期刊] 2004(5682)
12.Chen D;Steele AD;Lindquist S Increase in activity during calorie restriction requires Sirt1[外文期刊] 2005(5754)
13.Picard F;Kurtev M;Chung N Sirt1 promotes fat mobilization in white adipocytes by repressing PPAR-g[外文期刊] 2004(17)
14.Nemoto S;Fergusson MM;Finkel T SIRT1 functionally interacts with the metabolic regulator and transcriptional conctivator PGC-1[外文期刊] 2005(16)
15.Araki T;Sasaki Y;Milbrandt J Increased nuclear NAD biosynthesis and SIRT1 activation prevent axonal degeneration[外文期刊] 2004(5686)
16.Kaeberlein M;Kirkland KT;Fields S Sir2-independent life span extension by calorie restriction in
yeast[外文期刊] 2004(09)
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GST融合蛋白构建、表达与纯化
GST 表达融合蛋白 载体 pGEX-KG 大小：5006bp ，氨苄青霉素抗性（Amp r ），IPTG 诱导表达 酶切位点：BamHI 930、SmaI 937、EcoRI 962、XbaI 966、NcoI 974、SalI 980、XhoI 985、SacI 992、 HindIII 994 GST 分子量： 构建pGEX-KG-YFG 重组质粒 1、分析所感兴趣的基因（your favorite gene, YFG ） Primer Premier 5.0软件，分析YFG 含有哪些酶切位点，注意是否与pGEX-KG 载体的多克隆位点有重合 2、确定合适的双酶切位点
3、设计PCR上、下游引物 Primer Premier 5.0软件，设计PCR上、下游引物 酶切位点外最多含6个碱基 3’端不是A，最好是G或C，但是不推荐使用GC或CG结尾 3’端至少保证有10个碱基完全配对 得分（Rating）大于70 [注意] 上游引物：是否添加适当碱基，确保不打乱开放阅读框 下游引物：添加终止密码子（UAA、UAG、UGA） 4、引物合成及保存 合成：上海生工生物工程技术服务有限公司（Email：beijing@https://www.360docs.net/doc/6317570985.html,，Tel：81767586）；纯化方法：柱层析or聚丙烯酰胺凝胶电泳？；价格1.30/碱基保存：贮存浓度：100pmol/μl（100μM），工作浓度：10pmol/μl（10μM），-20°C保存 5、PCR扩增YFG
模板：质粒10ng/μl稀释少量-20°C保存 引物：10pmol/μl（10μM）-20°C保存 Taq酶：NEB Quick-Load Taq 2×Master Mix 扩增片段小于2.0kb 反应条件 （1）预变性94°C 5 min （2）变性94°C 30 s （3）退火待定30 s （4）延伸72°C 待定 （5）重复2-5 25-30个循环 （6）补平缺口72°C 10 min （7）暂存10°C [注意] 退火温度：参考4（G+C）+2（A+T）－4（互补碱基），参考Ta Opt（Primer Premier 5.0）延伸时间：Taq酶：1kb/min 循环数小于30，减少错配 琼脂糖电泳检测PCR产物 0.8%有效分离范围：10~0.8kb；1.0%有效分离浓度7~0.5kb 50ml TAE加入5μl EB母液（5mg/ml） 100V，30-45min 拍照或者紫外灯下切胶回收 6、构建pGEX-KG-YFG 酶切：双酶切PCR产物、pGEX-KG 回收：PCR产物直接回收、pGEX-KG电泳之后切胶回收 连接：pGEX-KG 50ng、插入片段150ng 转化铺平板：Amp r 挑单克隆：Amp r（四个菌落足够了） 鉴定：小提质粒酶切or菌体PCR 7、转化BL21（DE3）pLysS菌株检测GST融合蛋白的表达 （1）冰上融化BL21（DE3）pLysS感受态细胞（天根） （2）2 ml离心管中，加入25μl BL21+ 3μl质粒（300-500ng），混匀（质粒≤感受态1/10）（3）冰上放置30min （4）42°C，90s
His_FemA融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达
【收稿日期】2012-04-27【基金项目】湖南省自然科学基金资助课题(10JJ5027);中南大 学自由探索研究创新基金(2010112001166)【作者简介】(1971-)，男，副主任技师，医学博士，硕士生导师， 从事细菌耐药性及耐药机制研究，Email :zoumingx-iang@126．com ;范学工，通讯作者，教授，博士生导 师， Email :xgfan@hotmail．com 文章编号:1005- 376X (2012)10-0878-05【论著】 His-FemA 融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达 邹明祥1，李军1，邬国军2，武文君3，张宁洁1，刘文恩1，范学工4 (1．中南大学湘雅医院检验科，湖南长沙410008;2．中南大学基础医学院微生物学系，湖南长沙410078;3．河南中医学院第一附属医院检验科，河南郑州450000;4．中南大学湘雅医院感染病科，湖南长沙 410008) 【摘要】目的构建His 标签的金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药相关蛋白FemA 的融合蛋白表达载体，并在大肠 埃希菌中表达， 为进一步研究femA 基因的生物学功能和临床应用奠定基础。方法根据GenBank 中金黄色葡萄球菌femA 基因序列，利用Primer Premier 5．0设计PCR 引物，并在引物的5'加入BamH I 及Sal I 酶切位点;以金黄色葡萄球菌 基因组DNA 为模版，PCR 扩增出femA 基因片段。将目的DNA 片段及质粒pQE30分别进行双酶切、连接并转化大肠 埃希菌DH5α;阳性克隆以PCR 、双酶切及测序进行鉴定。将鉴定正确的pQE30-femA 重组质粒转化大肠埃希菌JM109，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG )诱导表达His-femA 融合蛋白;采用SDS-PAGE 及Western blot 分析对表达蛋白进行验证。结果经PCR 、双酶切鉴定及序列测定，证实重组质粒pQE30-femA 构建成功;重组质粒pQE30-femA 转化大肠埃希菌JM109经IPTG 诱导后， SDS-PAGE 和Western blot 分析显示表达出53kD 目的蛋白;经Bandscan 软件分析，目的蛋白质在4h 的表达量占细胞总蛋白的27．5%。结论成功构建了His-FemA 原核表达载体(pQE30-femA )，并在大肠埃希菌中高效表达。 【关键词】金黄色葡萄球菌;femA 基因;原核表达;融合蛋白 【中图分类号】R378．1+1 【文献标识码】A Construction of His-FemA fusion protein expression vectors and the expressions in pro-karyotic cells ZOU Ming-xiang 1， LI Jun 1，WU Guo-jun 2，WU Wen-jun 3，ZHANG Ning-jie 1，LIU Wen-en 1，FAN Xue-gong 4 (1．Department of Clinical Laboratory ，Xiangya Hospital of Central South University ，Changsha 410008，China ;2．Department of Microbiology ，School of Basic Medicine ，Central South University ，Changsha 410078，China ;3．Department of Clinical Laboratory ，the First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine ，Zhengzhou 450000，China ;4．Department of Infectious Diseases ，Xiangya Hospital of Central South University ，Changsha 410008，China ) 【Abstract 】Objective To construct His-tagged FemA fusion protein expression vectors ，and express it in E．coli and establish foundation for further studies．Methods PCR primers were designed using Primer Premier 5．0software according to the sequence of femA gene in GenBank．Two restriction endonuclease recognition sites BamH I and Sal I were added to the 5'end of the primer．Genomic DNA from S．aureus was used as the templete for PCR amplification of femA gene．The obtained femA gene and plasmid pQE30were double-enzyme digested respectively ，ligated and transferred into DH5α．The positive clones were selected and the recombinant plasmid pQE30-femA was identified by PCR ，restriction endonuclease analysis and DNA sequencing．Then the identified pQE30-femA was transformed into E．coli JM109and the target protein expression was in-duced by IPTG．The expressed product was identified by SDS-PAGE and Western blot．Results Verified by PCR ，double-en-zyme digested assessment and sequencing ，recombinant plamid pQE30-femA was successfully constructed．SDS-PAGE and Western blot analysis revealed that the recombinant plasmid pQE30-femA expressed a 53kD target protein in E．coli JM109． Bandscan software analysis showed that the expressed target protein at 4h accounted for about 27．5%of the total bacterial pro-tein．Conclusion The His-tagged femA fusion protein expression vectors (pQE30-femA )was successfully constructed and high-effectively expressed in E．coli ． 【Key words 】Staphylococcus aureus ;FemA gene ;Prokaryotic expression ;Fusion protein 金黄色葡萄球菌是威胁人类健康的重要致病菌， 可引起化脓性感染、食物中毒、表皮剥脱综合征以及血流感染等多种疾病。随着抗菌药物的广泛使用， 金黄色葡萄球菌的耐药现象日趋严重［1，2］ 。其中，耐 甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA )不仅具有严重的多重耐药性，同时具有广泛的流行性，极大地增加了患者和社会的医疗负担，已成为全球严重的公共卫生
融合蛋白表达系统
研究者们在分离到某一基因后，要对其编码蛋白质进行研究最理所当然的工作就是表达，即：有目的性地合成外源基因产物。在重组 DNA技术的发展早期，人 们认为在基因的前面有一个强启动子和一个起始密码子就足以在大肠杆菌中获 得很好的表达。随后，认识到获得有效的翻译所需的条件要复杂得多，除了要有强启动子和起始密码子外，良好的表达尚需编码目的蛋白的mRNA中含有核糖体结合位点，表达水平受密码子喜好程度的影响，也受编码序列中其他目前尚未明了的因素影响。通过改变起始密码子前端的序列，或者在不改变蛋白质序列的条件下利用密码子的简并性改变5’末端编码序列往往有助于解决问题。 通常，两个基因之间的融合表达能更快地解决这些问题。在这种方式中，目的基因被引入某个高表达蛋白序列(fusion tag)的3’末端，比如大肠杆菌的一段 序列，或者任一可在大肠杆菌中高度表达的基因，它提供良好表达所必需的信号，而表达出的融合蛋白的N末端含有由fusion tag编码的片段。fusion tag所编码的可能是整个功能蛋白或是其中的部分。比如6x His Tag、β-半乳糖苷酶融合蛋白和trpE融合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白以及硫氧还蛋 白(Trx)融合蛋白等。 由于利用tag 选择融合表达是为了简化重组一是fusion tag位于目的蛋白的N端，这时tag 帮助提高目的蛋白的表达，缺点是纯化的表达产物中可能会有不完整的目的蛋白，原因是在翻译过程中意外中断的少量(C端)不完整的表达产物会一起被纯化。另一是fusion tag位于目的蛋白的C端，这可以保证只有完整的表达产物才会被纯化。当目的蛋白的功能区位于N端时，fusion tag位于C端可能减少对其功 能的影响，反之亦然。 进行融合蛋白的表达经常会遇到三个问题，它们是：表达蛋白的溶解性、稳定性和fusion tag的存在。前两个问题在融合蛋白表达系统和非融合蛋白表达系统都会遇到，而第三个问题是融合蛋白系统所独有的。 裂解融合蛋白以除去fusion tag 为了对目的蛋白进行生化及功能分析，通常要从目的蛋白上去除fusion tag部分。早期已建立了数种对融合蛋白进行位点特异性裂解的方法。化学裂解如溴化氰(Met↓)、BNPS-3-甲基吲哚(Trp↓)、羟胺(Asn↓Gly)等，不但便宜且有效，往往还可以在变性条件下进行反应。但由于裂解位点的特异性低和可能对目的蛋白产生的不必要修饰，使该法渐渐被酶解法取代。酶解的方法相对来说反应条件较温和，更重要的是，普遍用于此用途的蛋白酶都具有高度的特异性。其中有用的酶有：Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶、胶原酶。所有这些 酶都具有较长的底物识别序列(如在凝乳酶中为7个氨基酸)，从而降低了蛋白质中其他无关部位生断裂的可能性。而酶解法存在成本高(这些蛋白酶价格一般都相当昂贵)，反应时间长等问题，更重要的是蛋白酶本身不可避免地会混入目的蛋白中，造成新的污染，提高纯化的复杂性。
GST_talin1融合蛋白的原核表达及纯化
收稿日期:2007-12-22;修回日期:2008-01-11 作者简介:吴 爽(1979-),女,硕士,助教,教学和研究方向,细胞生物学,E 2mail:wushuang 21977@https://www.360docs.net/doc/6317570985.html,;通迅作者:耿建国(1955-),男,博士,研究员,研究方向,细胞粘连与迁移。 GST 2talin1融合蛋白的原核表达及纯化 吴 爽 1,2 ,耿建国 2 (1广东药学院基础学院组织胚胎教研室,广州 510006;2中科院生化细胞研究所分子细胞生物学实验室,上海 200031) 摘 要:应用PCR 方法扩增talin1的cDNA,并将其重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEX 24T 21中,获取人源的GST 2talin1融合蛋白,为下阶段深入的研究talin1的结构、功能、及其与之相互作用的蛋白打下基础。经酶 切、序列鉴定,选择正确重组子,将其质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),I PTG 诱导表达,用Glutathi one Sephar ose 4B 柱纯化,western bl ot 鉴定。克隆得到了一个2400bp 的talin1的c DNA 片断,重组质粒目的DNA 测序正确,纯化出分子量约为12116k D 的融合蛋白。用基因工程方法使GST 2talin1重组质粒在原核细胞表达并成功纯化出GST 2talin1融合蛋白。 关键词:talin;P 2选凝素;GST 2融合蛋白;亲和层析中图分类号:Q51 文献标识码:A 文章编号:1008-9632(2008)03-0033-03 P -选凝素(P -selectin )是一种由细胞产生的粘附分子(adhesion molecules ),存在于细胞表面,能够介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合。其在炎症反应、凝血机制、甚至在某些肿瘤转移等方面发 挥重要作用[1] 。一直以来P 2selectin 受到许多研究者的青睐。P 2selectin 分子的特性到目前为止,人们已有较丰富的研究。本实验室以P 2selectin 的cyt op las m ic domain 为饵从人白细胞cDNA 文库中筛选到几个基因,经测序可知其中之一为talin1(从第1672个氨基酸残基到蛋白末端)。因此本试验利用重组DNA 技术,获得talin1的cDNA,构建了GST 2talin1融合蛋白表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白,为进一研究talin1与P 2selectin 是否存在相互作用及相互作用机制,奠定了基础。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 菌株、质粒 人源talin1的cDNA 及融合表达 载体pGEX 24T 21为实验室保存。DH5 α及BL21大肠杆菌感受态购自上海申能博采生物公司。1.1.2 生化试剂和分子生物学试剂 引物由上海生工生物有限公司合成,限制性内切酶、T 4DNA 连接酶购自Pr omega 公司,1kb DNA Marker 、DNA 片断快速纯化及回收试剂盒购自北京鼎国生物技术公司,PCR 试剂购自日本T AK ARA 公司,氨苄青霉素为上海华舜生 物公司产品。1.2 方法1.2.1 目的基因的扩增及纯化 根据已公布的人源talin1的cDNA 序列设计talin1的引物,上游引物T1的序列为5′23′at cag tag gaa ttc atg cg gga cct aga cca gg;下游引物T2的序列为5′23′ga agt cat ctc gag gtg ctc atc tcg aag ctc tg,在上下游引物中分别加入EcoR I 和XhoI 酶切位点。PCR 反应总体积为50 μL,包括ddH 2O 4015μL 、10×buffer 5μL 、4dNTP 1μL 、上下游引物各1μL 、模板1μL 、La Taq 酶015μL 。反应条件为:94℃2m in,94℃50s 、56℃50s,72℃2m in,72℃5m in,共35个循环。所获得的PCR 产物以1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将目的条带切下,用DNA 片断快速纯化回收试剂盒回收。1.2.2 pGEX 24T 212talin1重组质粒的构建 将纯化的PCR 产物和pGEX 24T 21载体用EcoR I 和XhoI 双酶切后,分别回收酶切产物。取回收后的talin1片断815 μL,载体片断015μL,10×T 4DNA 连接酶buffer 1μL,T 4DNA 连接酶013μL,16℃连接过夜。1.2.3 重组质粒的筛选和鉴定 将连接产物全量转 化入DH5 α感受态细菌,在含有氨苄青霉素(Amp )的LB 上37℃筛选培养过夜。次日挑取单个菌落,培养12h 后小量抽取质粒,用EcoR I 和XhoI 双酶切,筛选阳性重组质粒并送上海英骏生物技术有限公司测序。 3 3
绿色荧光蛋白GF基因的克隆表达和粗提取
绿色荧光蛋白G F基因 的克隆表达和粗提取 SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#
绿色荧光蛋白(G F P)基因的克隆、表达和粗提取 南方医科大学 2011预防医学（卫生检验检疫） 摘要 目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。方法：从 DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞 BL-21中，用LB培养基对转化后的进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。 关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取 目录
1 前言 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿
色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。1962 年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现一种绿色的荧光蛋白。1974 年，他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白(GFP)[1] GFP 作为一种新的报告基因，其优点在于①荧光强度高，稳定性高；②GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安全可靠；③不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光，尤其适用于体内的即时检测； ④GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；⑤通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域[ 2～3]。采用GFP 作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段[ 4、5 ]。采用基因工程手段生产GFP标记的方法，可建立一种简便、快速的免疫诊断技术[6]。 质粒转化进入大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞是分子克隆的关键步骤[7]，是基因克隆以及DNA文库构建等研究中一项重要的常规操作。目前，感受态 法，该方法操作简单、容易掌握、重复性好、转化率 细胞的制备主要采用CaCl 2 高，可广泛应用于一般的实验室。其原理是Ca2+ 破坏细胞膜上的脂质阵列，并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA的渗入[8]。 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产
融合蛋白定义
融合蛋白 科技名词定义 中文名称：融合蛋白 英文名称：fusion protein 定义1：融合基因的表达产物，或通过生物学和化学方法融合的两个或两个以上蛋白质。 所属学科：免疫学（一级学科）；应用免疫（二级学科）；免疫学检测和诊断（三级学科） 定义2：通过基因工程方法将编码不同蛋白质的基因片段按照正确的读框进行重组，将其表达后获得的新蛋白质。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科） 定义3：由两段或多段基因序列串联形成的融合基因表达所产生的蛋白质。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 目录
融合蛋白 - 技术概况融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进 行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。 技术特点 融合蛋白 融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌) 也可在真核细胞中进行表达。 原核表达系统的特点是时程短，费用低，是科研中的主要工具。其缺点是真核蛋白表达没有得到确切修饰；大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物，需要复杂的变性和复性过程；大量蛋白的分泌较困难。真核表达系统的特点是蛋白翻译后加工机会多，甚至可被改造成人源型；真核细胞易被转染，具有遗传稳定性和可重复性；产物可被分泌，提纯简单，成本低。 技术内容 构建融合蛋白的基本原则是，将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的共同表达。具体步骤有： 1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则，设计合适的引物序列，以cDNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。 2.在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。 3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序。 4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化。 技术关键 在构建融合蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的接头序列( Linker )，即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。 一般来说， 3-5 个氨基酸的Linker 可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。有人尝试在融合蛋白间加入一段有疏水性和一定伸展性的较长肽链，如(Gly4Ser1)，目的是将两者分开，以缓解相互干扰作用，并获得了满意的结果。但具体涉及到每种蛋白时，需具体分析。当我们构建融合蛋
红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 开题报告 于凯
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
原核表达融合蛋白
原核表达融合蛋白 广义的原核表达，是指发生在原核生物内的基因表达。狭义的原核表达，常出现于生物工程中。是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。 表达载体：为了获得高水平的基因表达产物，人们通过综合考虑控制转录、翻译、蛋白质稳定性及向胞外分泌等诸多方面的因素，设计出了许多具有不同特点的表达载体，以满足表达不同性质、不同要求的目的基因的需要。通常关心的表达载体质粒上的元件包括：启动子、多克隆位点、终止密码、融合Tag（如果有的话）、复制子、筛选标记或报告基因等。现在常用的pET表达系统以及GST-融合蛋白表达系统。 复制子：通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。pSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoE1，pMBI(pUC)类的复制子的拷贝数高达500以上，是表达载体常用的。通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关，当然也不是越多越好，超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。如果碰巧需要2个质粒共转化，就要考虑复制元是否相容的问题。 筛选标记和报告基因：氨苄青霉素抗性是最常见的筛选标记，卡那霉素或者是新霉素次之，通常是另一个载体的筛选标记用。四环素，红霉素和氯霉素等已经日渐式微。抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。在表达筛选中要注意的问题应该就是LB倒板前加抗生素的温度，温度过高容易导致抗生素失效。对于做表达来说，如果不是要研究启动子的强弱，通常比较少关心或者用到报告基因吧。绿色荧光蛋白是最常用的报告基因了。其他还有半乳糖苷酶、荧光素酶等。一些融合表达Tag也有报告基因的功能。 启动子：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的启动子。 终止子：转录终止子对外源基因在大肠杆菌中的高效表达有重要作用，即控制转录的RNA长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降。放在启动子上游的转录终止子还可以防止其他启动子的通读，降低本底。转录终止子有两类，Rho因子作用下使转录终止mRNA和根据模版上的对称序列形成发夹结构而终止mRNA。常见的是rrnB rRNA操纵子的T1T2串连转录终止子。 核糖体结合位点：启动子下游从转录起始位点开始延伸的一段碱基序列，其中能与rRNA16S亚基3'端互补的SD序列对形成翻译起始复合物是必需的，多数载体启动子下游都有SD序列，也有些载体没有。 表达菌株：表达菌株是我们往往最容易忽视的一点。目前绝大多数重要的目的基因都是在大肠杆菌中表达的。不同的表达载体对应有不同的表达菌株，一些特别设计的菌株更有助于解决一些表达难题。将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点： 易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
融合蛋白标签
在蛋白质功能及结构研究过程中，研究的首要任务就是利用多种方法获得纯化的具有完整结构及生物学功能并能够正确折叠的高度纯化蛋白质。除了蛋白质的研究，具有特定生物活性的高价值蛋白质的生产也需要对蛋白质产品进行纯化。因此，科研人员和工业生产往往大量采用多种多样的表达系统来获得高表达的蛋白质，对其纯化后进行研究或加工，这些表达系统包括原核表达系统、酵母菌表达系统、昆虫动物细胞表达系统、真核细胞表达系统等。 如何将系统中表达的目标蛋白质与其他蛋白分离，一直是表达纯化中的一个重点。为了克服从复杂样品中纯化单一蛋白质这种困难，科学家利用生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别某种特定物质并与该物质分子特异性结合的能力，利用生物分子间的这种特异性结合能力而形成的亲和纯化技术。亲和标签纯化技术已广泛应用于蛋白质，特别是重组蛋白的分离纯化中。在重组蛋白的亲和纯化中，利用基因工程技术，将经过改造优化的亲和标签与目标蛋白融合表达，通过一步简单快速的亲和层析，直接获得纯度较高的重组融合蛋白，已成为重组蛋白纯化的一个通用方法，具有结合特异性高、纯化步骤简便、纯化条件温和、适用性广泛等优点，为蛋白质的有效纯化提供了一条解决的途径，广泛应用于蛋白质结构与功能的研究及重组蛋白纯化工艺的开发中。 自从20世纪70年代中期融合标签技术出现以来，亲和标签已成为一种重组蛋白纯化十分有效的工具，具有结合特异性高、纯化条件温和、纯化步骤简便、适用性广泛等显著优势。通常，亲和标签定义为对特定的生物或化学配基具有高度亲和力的一段氨基酸序列。到目前为止，已经出现了种类众多、功能各异、用途多样的亲和标签，极大地促进了对重组蛋白的有效纯化。 根据自身分子量大小的不同，亲和标签可以分为两大类：一类是结合固定化配基的短肽标签，如His-tag、FLAG-tag、Strep-tagⅡ等；另一类是识别小分子配基的蛋白标签，如GST、MBP等。 短肽标签： His-tag：His标签是目前高通量蛋白纯化最普遍使用的亲和标签，广泛用于多种重组蛋白在各种表达系统的表达与纯化中。His标签一般为5~15个组氨酸，被认为是重组蛋白纯化的首选标签，具有以下优点：（1）位于目标蛋白Ｎ端的His标签与细菌的转录翻译机制相互兼容，利于蛋白的表达；（2）His标签几乎
蛋白体外表达与纯化
蛋白体外表达与纯化 随着后基因组时代的到来，蛋白质组成为科学研究的热点。蛋白质作为生命机体的主要活动的承担者，其体外表达与纯化在研究相应基因的功能上有重要意义。 蛋白体外表达系统按其表达宿主可分为原核表达系统，真核表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 一：原核表达系统 原核表达系统的宿主菌主要以大肠杆菌为代表，大肠杆菌表达体系是目前应用最广泛的外源基因表达体系，这也是外源基因表达的首选体系。该表达体系的优点：遗传学和生理学背景清楚；容易培养；外源基因经常可以高效表达及操作简单、周期短、成本低等。其不足之处是不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰；广泛的二硫键的形成及外源蛋白组装成蛋白复合体的能力也受到限制；另外外源基因产物在大肠杆菌中易形成不溶的包涵体；有时由于真核mRNA的结构特性及密码子使用频率与大肠杆菌的差异，而的不到足够的产物。二：真核表达系统 真核表达系统的宿主菌主要以酵母表达系统为代表，酵母基因表达系统的载体通常既能在酵母中进行复制也能在大肠杆菌中进行复制，形成所谓酵母菌――大肠杆菌穿梭载体。因以大肠制备质粒DNA较方便，通常利用大肠杆菌系统构建酵母载体以简化手续，缩短时间。作为基因表达系统的宿主应该具备以下条件：安全无毒，不致病；遗传背景较清楚，容易进行遗传操作；容易进行载体DNA的导入；培养条件简单；有良好的蛋白分泌能力；有类似高等真核生物的蛋白翻译后修饰功能。 三：哺乳动物细胞表达系统 由于本专业不涉及哺乳动物细胞表达系统的应用，故此不赘述。 表达载体的种类及相应的分离纯化方法 作为表达载体必须具备以下特征：稳定的遗传复制、传代能力，无选择压力下能存在于宿主细胞内；具有显性的筛选标记；启动子的转录是可调控的；启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止；具有外源基因插入的多克隆位点。 在原核表达系统中常用的表达载体有：PET－载体系列，用这类载体表达出的外源蛋白在Ｎ端或Ｃ端或两端均具有his tag。用该载体表达出的外源蛋白通过其末端组氨酸与Ni2+的结合以亲和层析的方法而纯化。PGEX－载体系列，用这类载体表达出的外源蛋白以GST融合蛋白的形式存在，以Glutathione Sepharose 4B 柱亲和层析得以纯化。 本实验将以PGEX4T—3为载体，在大肠杆菌BL21DE3菌株中表达外源蛋白OsWAK2为例介绍蛋白的表达与纯化。 实验方法与步骤： 一：目的蛋白的粗提 1．构建载体，转化BL21DE3宿主菌感受态细胞 2．挑单菌落于10ml 含有60ug/ ml的液体LB培养基中37℃200rpm摇培16—18小时3．取5 ml摇好的菌液加到250 ml备好的含有60ug/ ml的液体LB培养基中37℃200rpm 摇培，至对数生长中后期
绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
生化绿色荧光蛋白的基因克隆及表达开题报告
题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达 李宏远 2014236053 立题依据： 随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。 1.选材：大肠杆菌 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 %，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。 2.基因标记技术 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。
3.绿色荧光蛋白 从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。分子质量为 26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。 【实验目的】 研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 【研究意义】 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。 GFP的应用特点 检测方便：不需要外加底物和辅助因子，用内眼就可以观察到，在长紫外光照射下特别漂亮，以此作为标记，观察表达产物。