密码子优化的重组黄曲霉毒素解毒酶_省略_在毕氏酵母中组成型分泌表达的研究_左振宇
中国农业科技导报,2007,9(5):87-94Jou rna l of A g ricu lt ura l Science and T echno logy
收稿日期:2007-06-21;修回日期:2007-09-01 基金项目:国家十五“863”计划项目“黄曲霉毒素解毒酶基因的克隆及其基因工程菌的构建”(2002AA213011;2005AA213010)和国家自然科学基金项目“黄曲霉毒素解毒酶基因的克隆及表达的研究”(30270043)资助。 作者简介:左振宇,硕士研究生,从事分子生物学和微生物学研究。通讯作者:刘大岭,教授,研究方向为应用微生物学。
Tel :020-********;E -m ail :tl d l @j nu https://www.360docs.net/doc/6218687445.html,
密码子优化的重组黄曲霉毒素解毒酶(r ADTZ )
在毕氏酵母中组成型分泌表达的研究
左振宇, 刘大岭, 胡亚冬, 胡 熔, 姚冬生
(暨南大学(科仁)微生物技术研究所,广州510632)
摘 要:黄曲霉毒素解毒酶(ADTZ )来源于真菌Ar m ill ari e ll a tabescens ,它能够有效地分解黄曲霉毒素。为了使重组蛋白r A DTZ 能在毕氏酵母中高效分泌表达,根据毕氏酵母密码子的偏好性对r ADTZ 的5'末端的编码区域进行了优化,利用t w o -step DNA syn t hsis 技术合成出A DTZ 优化的基因序列O PT -ADTZ ,并与组成型表达载体pGAPZaA 连接,构建重组质粒pNOA ,线性化p NOA 后转化至毕氏酵母G S115中,实现了密码子优化的r ADTZ 组成型分泌表达。
关键词:ADTZ ;t w o -step DNA synthesis ;组成型分泌表达
中图分类号:Q 78,Q 814 文献标识码:A 文章编号:1008-0864(2007)05-0087-08
Stud i es on Constituti ve and Secreti ve Expression of Codon -O ptm i ized
R eco mb i nant A flatoxi n -D etox ifi zy m e (r ADTZ )i n P ichia past oris
ZUO Zhen -yu ,LI U Da -ling ,HU Ya -dong ,HU Rong ,YAO Dong -sheng
(I n stitute ofM icrobial B i otechnology ,Jinan Universit y ,Gu angz hou 510632,C hina )
Ab strac t :A fl a t ox in -detoxifizym e (ADTZ ),being fro m Ar m ill ariella t abescen s ,can e ffec tively deco m pose aflatoxins .The 5'cod i ng region o f its cDNA w as opti m ized accord i ng to t he codon b ias o f P ichi a past oris t o m ake it secreti ve l y expre ss in P ichia pastoris w it h h i gher perfor m ance .Two -st ep DNA s yn t hsisw as used t o synthesize t he c DNA sequence being op ti m ized o fA DTZ (O PT -ADTZ ).O PT -ADTZ wa s connec t ed w ith constit u tive p las m i d p GAPZ a A to construc t the reco m binant p l as m id pNOA.p NOA w as linea rized and t hen transfo r med into P ichia pastoris G S115.Then codon -opti m ized ADTZ w as constit uti ve l y and secreti ve l y expressed in P ichia pastoris .K ey word s :ADTZ ;t w o -step DNA synthe sis ;constitutive and sec re tive expression
黄曲霉毒素(AFs ,aflatox ins )、杂色曲霉素等是自然界中霉菌的次级代谢产物,微量摄入即可在体内积蓄并引起危害。国内外已有学者报道从不同微生物中分离出黄曲霉毒素的降解活性物[1～3]
,Liu 等发现[4～6]
,真菌Ar m illariell a tabesce ns (E -20)中存在着可以降解黄曲霉毒素毒性的复合多酶体系,并从中分离出一种胞内酶,命名为黄曲霉毒素解毒酶(aflatoxin -de t o xifizy m e ,ADTZ ),并从Ar m ill a riell a t a besce ns 中克隆出ADTZ
基因c DNA ,构建了pH I L -S1-ADTZ (pSA )重组表达质粒,导入P ic hia pastoris GS115酵母中,成功
地构建了表达r A DTZ 的基因工程菌。由于该工程菌是使用了乙醇氧化酶(AOX )启动子,诱导表
达过程中会产生AOX 产物,该酶分子量(约72kDa )与r A DTZ 的分子量(约76kDa )接近,给分离纯化带来难度。而且,由于ADTZ 来源于丝状真菌,其密码子与毕赤酵母存在较大的差别不利于表达,使用AOX 为启动子的r A DTZ P ic h i a pastoris GS115酵母菌大规模表达r A DTZ 需要使用大量甲醇诱导,并且进行精确发酵控制,对工业化生产十分不利。
为此,本研究尝试根据毕赤酵母密码子偏好
性优化ADTZ基因编码框的5'末端长为936bp的核苷酸序列,并把ADTZ基因部分优化的完整阅读框与组成型表达载体pGAPZa A连接,转化毕赤酵母GS115,构建一个ADTZ密码子优化的组成型分泌重组ADTZ的酵母重组子,为进一步获得高性能重组基因工程生产菌株作一个初步探讨。
1 材料与方法
1.1 菌种、质粒及其试剂
P ichia pastoris GS115购自Inv itrogen公司,重组质粒pSA(插入ADTZ cDNA ORF片段的亚克隆)及大肠杆菌TOPI0F为本试验室保存,质粒p GAPZa A为李校堃博士实验室馈赠,质粒p MD19-T购自Takara公司,限制酶类EcoR I、N otI 购自Ta K a Ra公司,限制酶类AvrⅡ购自NEB公司,T4DNA ligase购自Ta K a Ra公司,Taq酶类Pri m eSTAR T M H S及r Taq购自Ta KaRa公司,琼脂糖凝胶回收试剂盒购自OM E GA公司,质粒抽提试剂盒、DNA片段回收试剂盒购自TI A NGEN,引物合成及测序都由上海博亚公司完成。
1.2 ADTZ密码子的改造
根据来源于http://w ww.kazusa.or.j p/co-don/P.ht m l的酵母密码子使用频率分布信息,对ADTZ基因编码框5末端936bp的核酸序列进行优化,在不改变氨基酸序列的前提下,全替换成毕氏酵母使用频率较高的密码子,并设计重叠互补引物用t w o-step DNA synthsis方法[7]合成部分优化的ADTZ基因序列OPT-ADTZ(长2088bp)。
表1 引物序列
T ab l e1 pri m er sequences.
引物P ri m e r 序 列 Sequences
opt-AB:5'-TACGA TTTGTTGATCCTTACT-3'
opt-A1:5'-GA TTTGTTGATCCTTACTTTCTCTG TCAACGGAAAG TTGG CTGA CTTGAATG C-3'
opt-A2:5'-G TTGGCTGACTTGAA TGCTTTGAAGACATCTTCTGGTTTGTCTGAGGACGA TTGGGAGG-3'
opt-A3:5'-GAGGAC GATTGGGAGGCTTTGATTCAA T ACACTGTTCAAGTTTTGTCCAACTTGGTCAACTACAAGACCTTC GG-3' opt-A4:5'-CAACTACAAGACCTTCGGA TTTACTAAGA TTATTCCAAGAG TTGACGCCGAG-3'
opt-A5:5'-AAGAGTTGACGCCGAGAAGTTTGAGTCTGTTG TTAAAGCTTCTTCTAAC-3'
opt-A6:5'-TCTAACG CTGACCAAGG TTCTGCA TTGTTC A CTAAGCTTAAACAGCACATCTACG-3'
opt-A-6E:5'-CGTAGATGTG CTG TTTAAG-3'
opt-A-7B:5'-CTTAAACAGCACA TCTACG-3'
opt-A7:5'-CTTAAACAGCACA TCTACG CTTTG TCTCCTGAG TCC G CCTTGTTCATTG-3'
opt-A8:5'-GTCCGCCTTGTTC A TTGGTAAGAGAAAGGACGGTC ACGTTTCTAATTACTATTTGGGTGAGCCTGTTGGAGA T G-3' opt-A9:5'-G TGAGCCTGTTGGAGATG CTGAGGTTGA TGCTATTCAAAA TGTTGCTGAAAAGCTTGG TGTTG-3'
opt-A10:5'-CTGAAAAGCTTGG TGTTGA TATCTTGAA TACTAGAGTTAAGAAGAATGG TGCTGG-3'
opt-a10E:5'-CCAGCACCATTCTTCTTA-3'
opt-a-11B:5'-TAAGAAGAATGG TGCTGG-3'
opt-A11:5'-TAAGAAGAATGG TGCTGGTGATCACACTTTG TTGGTTGCTTCCGCTAAGACTTCTCCACC-3'
opt-A12:5'-CGCTAAGACTTCTCCACCA TCCGTTCATGACTTCCAAA TCGACTCTA CCCCAG C-3'
opt-A13:5'-A TCGACTCTA CCCCAG CTAAATTGA CTA TTGAGTA TGGTGA TTACGCCTCCTCTTTGAC-3'
opt-A14:5'-TACG CCTCCTCTTTGACTAAGG TTGTTG CTG CTCTTCAAGAGGCCAAGCAA TATACCGC-3'
opt-A-14E:5'-G C GG TATATTGCTTGGC-3'
opt-A-15B:5'-G CCAAG CAATA TACCG C-3'
opt-A15:5'-G CCAAG CAATA TACCG CTAACGA TCA TCAATCTGCTATGA TTGAGGG TTACG-3'
opt-A16:5'-G CTA TGATTGAGGGTTACG TTAAG TCTTTC AA CTCCGGTTCTATCCCTGAGCACAAG-3'
opt-A17:5'-TCTA TCCCTGAGCACAAGG CTG CTTCTA CCGAGTGGGTTAAGGATA TTGG-3'
opt-A18:5'-G TGGGTTAAGGATA TTGGA CCAGTTG TTGAG TCCTACATCGGA TTCG TTGAGAC-3'
opt-A-18E:5'-G TCTCAA C GAA TCC GA TG-3'
opt-B-b:5'-CATCGGA TTCG TTGAGACCTATG TCGACCCATATGGCG-3'
opt0:5'CGGAA TTCCACCA CCACCA CCACCACATG3'
88中国农业科技导报9卷
图1 Two-step DNA s y st hesis法合成优化片段实验设计图
F ig.1 Expe ri m en t a l desi gn of r ADTZ opti m izati on by t w o-st ep DNA systhesis me t hod.
1.2.1 引物设计 见表1。op t0引物中单下划线区域为限制性内切酶位点E coRⅠ;双下划线区域为6-H is标签位点,opt8引物中下划线区域为限制性内切酶位点No tⅠ。
1.2.2 t w o-st e p DNA systhnsis法合成密码子优化区域 用t w o-step DNA systhnsis法合成密码子优化区的实验设计如图1所示。
1.2.3 one-step 分别把重叠互补引物op t-A1、opt-A2、opt-A3、opt-A4、opt-A5、opt-A6为组Ⅰ,opt-A7、
op t-A8、opt-A9、opt-A10为组Ⅱ,opt-A11、op t-A12、op t-A13、op t-A14为组Ⅲ,opt-A15、opt-A16、opt-A17、opt-A18为组Ⅳ,各组引物按10μm o l L-1等量混合后,加入Pri m eSTAR T M H S高保真酶反应体系,94℃5m i n;98℃10s,46℃+1℃15s,72℃1m i n进行7个循环;72℃10m in完成第一轮PCR扩增。取各组的产物1μL为模板,分别在组Ⅰ中加入引物op t-AB、opt-A6E,组Ⅱ中加入opt-A7B、op t-A10E,组Ⅲ中加入opt-A11B、opt-A14E,
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5期左振宇等:密码子优化的重组黄曲霉毒素解毒酶(r ADTZ)在毕氏酵母中组成型分泌表达的研究
组Ⅳ中加入opt-15B、opt-18E,然后加入Pri m e STAR T M H S高保真酶反应体系,94℃5m in;98℃10s, 50℃15s,72℃1m in进行25个循环;72℃10 m in完成第二轮PCR扩增,分别得到产物DNA片段O pt-A1(270bp);Opt-A2(192bp);Opt-A3 (183bp);Op t-A4(159bp),并把获得的各个片段与r Taq酶反应体系混合,72℃温浴30m in,给DNA片段末端加A尾后与p MD-19T载体连接进行测序分析。
1.2.4 t w o-step DNA片段Op t-A1、Opt-A2、Opt-A3、Opt-A4及Op t-p3(实验室已构建DNA片段)测序结果证实后,混合各个DNA片段,并加入Pri m e STAR T M HS高保真酶反应体系,94℃5 m in;98℃10s,46℃+1℃15s,72℃1m in进行7个循环,完成第一轮PCR扩增。取第一轮产物0.5μL为模板,以op t0、opt-A18E为末端引物,加入Pri m e STAR TM H S高保真酶反应体系,94℃5 m in;98℃10s,50℃15s,72℃1m in进行25个循环完成第二轮PCR扩增,得到优化的ADTZ基因部分编码框区域Op t-A'(936bp)。接着把获得的片段与r Taq酶反应体系混合,72℃温浴反应30 m in,给DNA片段末端加A尾,之后再与p MD-19T载体连接进行测序分析。
1.2.5 ADTZ基因密码子非优化区域的扩增 以pSA质粒为模板,应用引物opt-B-b、op t8,用高保真酶Pri m eSTAR T M HS进行PCR扩增,反应条件为94℃5m i n;98℃10s,52℃15s,72℃1m i n,25个循环;72℃1m in。获得PCR产物ADTZ-B(1100bp)。把获得的片段在r Taq酶的作用下,72℃温浴反应30m in,给DNA片段末端加A尾,再与p MD-19T载体连接进行测序分析。
1.2.6 密码子部分优化的ADTZ完整阅读框序列的拼接 混合DNA片段Opt-A'和ADTZ-B,加入Pri m e STAR TM H S高保真酶反应体系,94℃5 m in;98℃10s,46℃+1℃15s,72℃1m in进行7个循环,完成第一轮PCR扩增。取第一轮产物0.5μL为模板,以opt0、opt8为末端引物,加入Pri m e STAR TM H S高保真酶反应体系,94℃5m in; 98℃10s,50℃15s,72℃1m in进行25个循环完成第二轮PCR扩增,得到优化的ADTZ基因完整编码框区域Opt-ADTZ(2088bp)。
1.2.7 酵母表达载体的构建及其鉴定 利用Eco RⅠ及N otⅠ双酶切基因合成产物OPT-ADTZ 与pP GAPZa A,酶切产物在T4li g ase的作用下定向连接成真核表达重组质粒p NOA,连接产物转化大肠杆菌TOP10F',经限制性酶切鉴定及测序正确后,用于下一步实验。
将重组表达质粒pNOA用Av rⅡ线性化后,电转化至毕氏酵母GS115中,电击条件为1500μF,时间为5m s。用含有100μgμL-1的Zeoc i n YPDS平板筛选表达抗性转化子,挑取单克隆,提取酵母基因组为模板,以opt0和op t8为引物, PCR初步鉴定阳性转化子,并扩大培养进行组成型表达的研究。
1.2.8 SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达 取培养96h的菌液,4000g离心2m in,取10μL 上清直接SDS-P AGE电泳,并染色检测重组子r A DTZ的表达。
2 结果
2.1 PCR扩增DNA片段Opt-A1、Opt-A2、O pt-
A3和Opt-A4的电泳检测及其测序鉴定。
在one-step中扩增的DNA片段O pt-A1、Opt-A2、Opt-A3和Op t-A4的结果见图2和图3,各组第二轮PCR产物大小与预期的270bp,192bp, 183bp,159bp大小相符。且各个片段的测序结果与理论核酸序列比较后,证实为预期的结果。
图2 PCR扩增O p t-A1和O pt-A2的电泳检测
F ig.2 E lectropho re sis ana l ysis o f PCR
produc ts O pt A1and O pt A2.
M:100bp DNA m ar ker;1:第1轮PCR扩增Op t-A1产物;
2:第1轮PCR扩增Op t-A2产物;3:第2轮PCR扩增Op t-
A1产物;4:第2轮PCR扩增Opt-A2产物
M:100bp DNA m arker;1:Opt-A1p roduct by1st PCR;2:
Op t-A1p roduct by1s tPCR;3:Op t-A2produ ctby2nd PCR;
4:Op t-A2produ ct by2nd PCR
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图3 PCR 扩增O pt -A 3和O pt -A4的电泳检测F i g .3 E l ec trophoresis ana l y sis of PCR products
O pt -A 3and O p t -A 4.
M :100bp DNA m arker ;1:第1轮PCR 扩增Op t -A3产物;2:第1轮PCR 扩增Op t -A4产物;3:第2轮PCR 扩增Op t -A3产物;4:第2轮PCR 扩增Opt -A4产物
M :100bp DNA marker ;1:Op t -A3produ ct by 1s t PCR ;2:Opt -A3p r oduct by 1st PCR ;3:Op t -A4product by 2nd PCR ;4:Opt -A4p roduct by 2nd PC R
2.2 PCR 扩增DNA 片段O pt -A '及密码子非优
化区域ADTZ -B 电泳检测及其测序鉴定。在t w o -step 中,以DNA 片段Op t -A1、Op t -A2、Op t -A3、Opt -A 4和O pt -p3为基础扩增得到的Op t -A ',结果如图4,其第二轮的PCR 产物有2条带,其中分子量较大的条带与预期大小936bp 相符。图5为PCR 扩增ADTZ -B 的产物,它的大小与预期的1100bp 相符。将Opt -A '及ADTZ -BD -NA 片段的测序结果与理论核酸序列比较后,证实为预期的结果
。
图4 PCR 扩增O PT -A '电泳检测
F ig .4 E lectropho re sis ana l ysis o f PCR produc ts O pt -A '.
M :100bp DNA m arker ;1:第1轮PCR 扩增OPT -A '产物;2:第2轮PCR 扩增OPT -A '产物
M :100bp DNA m arker ;1:O pt -A 'p r oduct by 1st PCR ;3:Op t -A 'p roduct by 2nd
PCR
图5 PCR 扩增ADTZ -B 的电泳检测
F ig .5 E lectropho resis analysis o f PCR produc ts ADTZ -B .
M :100bp DNA m ar ker ;1:ADTZ -B 的PC R 产物M :100bp DNA m ar ker ;1:ADTZ -B p roduct
2.3 PCR 扩增完整阅读框OPT -ADTZ 的电泳
检测
图6是PCR 扩增密码子优化序列OPT -ADTZ 后琼脂糖凝胶电泳检测结果,在第二轮PCR 产物中存在2000bp 大小的预期条带。回收的该条带与载体pPGAPZa A 连接后转化至大肠杆菌,提取质粒,酶切结果与预期相符(图7),验证为阳性转化子。把该DNA 片段OPT 测序后,与理论设计的核酸序列比较,也证实为预期结果。
2.4 PCR 初步鉴定酵母阳性转化子的电泳分析
从Zeocin 抗性的YPDS 平板上挑取克隆进行PCR 鉴定,结果如图8。其中,P2和P3号克隆在2kb 处有一特异性条带,与预期的ADTZ 基因阅读框大小相符。初步说明表达载体已成功地通过单交换重组至酵母基因组中
。
图6 PCR 扩增O p t -AD TZ 电泳检测
g .6 E lectrophore sis ana l y sis o f PCR produc ts O pt -ADTZ .
M :1kb DNA m arker ;1:第1轮扩增Op t -ADTZ 结果;2:第2轮扩增Opt -ADTZ 结果
M :1kb DNA m arker ;1:Op t -ADTZ p roduct by 1st PCR ;3:Op t -ADTZ p roduct by 2nd P C R
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5期左振宇等:密码子优化的重组黄曲霉毒素解毒酶(r ADTZ )在毕氏酵母中组成型分泌表达的研究
图7 酶切鉴定重组质粒p NOA
F i g.7 Iden tification of p NOA by
restric tion enzy m e digestion.
M:1kb DNA m arker;1,3:双酶切重组质粒p NOA;2:双酶切载体pP GAPZa A;4:单酶切重组质粒pNOA
M:1kb DNA m arker;1,3:pNOA digested by doub l e en-z ym es;2:pP GAPZa A d i gest ed by doub l e enz ym es;4: pNOA digested by singl e enzy m
e
图8 PCR初步鉴定酵母阳性转化子
F i g.8 PCR ana l y sis of yeast transt o r m an ts.
M:1kb m ar k er;1:P1号克隆;2:P2号克隆;3:P3
号克隆
M:1kb m ar k er;1:P1clone;2:P2cl one;3:P3cl on e 图9 毕氏酵母分泌表达重组蛋白的S D S-PAG E检测
Fig.9 SDS-PAG E ana l y sis of reco m binant pro tein secreti ve l y exp ressed i n P ichia p ast oris.
A:M arker:低分子量蛋白m arker;BSA:小牛血清蛋白;1:P1号克隆;2:P2号克隆;3:P3号克隆;4:空载体阴性对照B:M arker:低分子量蛋白m arker;1:空载体阴性对照;2:N端未优化的ADTZ/G S115分泌表达产物
A:M arker:l ow m ol ecu l ar w ei gh t p rot ein m arker;BSA:Bovi ne s erum potei n;1:P1cl one;2:P2cl one;3:P3cl one;4:N egati ve con trol B:M arker:l o w mo l ecu l arw eigh t p r o t ei n m ar k er;1:N-t er m inal un-codon-opti m ized ADTZ/G S115p r oduct
2.5 组成型分泌表达重组蛋白的S D S-PA GE检测
将重组毕氏酵母GS115培养96h,对其分泌到胞外的产物进行SDS-P AGE分析,结果(图9-A)表明,组成型分泌表达的P2号克隆重组菌与对照菌相比在76KD左右处出现特征目的带,与理论氨基酸序列推导的分子量大小一致,表明密码子优化的重组ADTZ在毕氏酵母中得到了分泌表达。与N 端未优化的重组ADTZ甲醇诱导分泌表达相比较(图9-B),其表达量未有明显的增加。3 讨论
生物使用密码子的频率不是没有规律的,而是存在明显的偏好性[8]。在不同宿主中同一氨基酸对应的不同密码子之中,有使用频率的高低之分,这就是遗传密码的偏好性。这种现象的原因之一就是,无论在原核还是真核生物体内,密码子的使用频率都是与tRNA的丰度呈正相关的。
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一般来说表达量较高的蛋白所含的密码子种类会较少,且这些密码子对应的t R NA分子的数目也较多,使生物能更快更多地合成出编码蛋白。而对于生物体内含量较少的蛋白,其基因中则含有低t R NA丰度的密码子,这样就限制了该蛋白的表达。所以要提高某一蛋白在某生物体内的表达量,根据该生物的密码子偏好性,改造该基因序列是一个可行的策略。基于这些观点,许多研究者依据不同宿主的密码子偏好性改造了目的蛋白的序列,极大地提高了蛋白的表达量。有实验证明,如果按照宿主密码子偏好性对目的基因的全编码序列进行改造,表达量可以提高10～50倍[9～16],即使只对目的基因的5'末端进行改造,其表达量都有明显的提高[17]。
这种密码子的改造从分子机理水平上来说是针对蛋白翻译水平的改造,减小基因序列的GC 含量,降低二级结构的复杂性,使蛋白的翻译顺利进行,提高蛋白的表达水平[11]。酵母习惯在密码子的第三位摇摆位置上倾向使用A/T碱基,据推测就是出于这个机理[18]。
本研究从这个角度出发对ADTZ的5'末端编码区进行了密码子的优化,并避免高GC含量区域及其重复序列区的出现,降低m RNA二级结构的复杂度,期望能够较大地提高ADTZ的表达量。在进行全基因合成时,我们选择的Tw o-step DNA syn t h esis法是一种有效的迅速合成DNA序列的技术[7],它周期短,消耗低,出错率小,可以合成出较长的DNA序列,与传统的DNA合成方式比较有较大的优势[19～20]。
对于此种基因合成的方式,引物设计尤为重要。合成引物时,寡聚核苷酸的长度要适中,过短会造成成本的增加,过长容易造成其合成的难度,使出错率提高。本研究中引物一般保持在50n t 左右。对于重叠互补引物之间的重叠碱基数,也是需要认真考虑的因素,过短其特异性过低,过长引物成本增高,建议选择在15nt～20nt,而且所有引物的重叠碱基数不要差异过大,最好使他们的退火温度相近,这样更有利于基因片段的合成。
组成型表达质粒pPGAPZa A[21～23],在蛋白表达的过程中不需要添加诱导剂,这种不使用甲醇诱导的毕氏酵母表达系统,可大大降低实验及工业化生产过程中潜在的危险度,而且也有利于大规模发酵的控制。根据宿主菌密码子偏好性替换目的基因5'端密码子,也有助于建立稳定、高效、低危险、适宜于工业放大的表达系统。在本研究中,根据毕氏酵母密码子的偏好性,对r A DTZ的5'末端936bp的核酸编码框区域进行优化,构建了组成型表达载体,并转化毕氏酵母,用PCR初步筛选出2株酵母阳性转化子P2和P3。对P2和P3转化子进行摇瓶发酵培养,在P2菌株的分泌中上清的分泌中检测到r A DTZ蛋白,而P3菌株的上清中没有检测到目的蛋白,P3菌株的结果与其他文献[24]报道中的情况类似,即在筛选酵母转化子的过程中,表达株之间的差异较大。推测可能与以下因素有关:①可能是基因的拷贝数目不高,导致某些表达株蛋白表达量没有达到可检测水平;②有可能表达株的表达框在传代过程中产生丢失的现象。除此之外,密码子使用频率只是影响蛋白表达量的一种因素,其他如蛋白稳定性,培养条件,目的基因的拷贝数目,启动子与阅读框的距离等等都会影响到外源蛋白的表达量,这都是我们今后工作中需要考虑的。从目前的结果看,P2菌株与N端未优化的ADTZ/G S115甲醇诱导表达系统相比较,优化的组成型P2菌株分泌表达的背景蛋白少,大部分为目的蛋白,给后续的分离纯化带来很大的便利;从大规模生产来看,该系统无需甲醇诱导,利于放大,单一的表达产物和占绝大部分的目标产物也利于发酵工艺优化研究,并节约生产成本,提高产品质量。
致谢:暨南大学生物医药技术中心李校堃教授赠送质粒p GAPZa A,使本研究工作得以顺利开展,在此表示衷心感谢
参 考 文 献
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《中国种业》征订启事
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94中国农业科技导报9卷