生物材料

皮肤的研究领域及其研究现状

王鑫 121598

摘要:在回顾和总结几十年来人工皮肤研究进展的基础上 , 将人工皮肤分为普通型人工皮肤和组织工程化皮肤两类 , 综述了人工皮肤的研究现状和最新进展 , 并展望了人工皮肤的发展前景。

关键词: 人工皮肤现状发展前景烧伤

皮肤作为人体最大的组织,是与外界环境接触的屏障。当由于外界损伤或疾病等原因造成皮肤缺损时,其危害可以是轻微的,也可以是致命的。传统修复方法有:自体植皮、同种异体植皮、异种植皮和人工合成代用品的应用。但由于供区不足、免疫排斥及传播疾病等缺点,寻找一种理想的皮肤替代物一直是临床上一个亟待解决的难题。组织工程学技术在天然或生物合成材料上接种皮肤干细胞, 在生物支架逐步降解吸收的过程中,种植的细胞继续增生繁殖,形成新的组织工程化皮肤,达到修复创伤和重建自身组织功能的目的。因此,“组织工程”的提出为人工构建皮肤替代物提供了崭新且富有挑战性的新方法。目前组织工程皮肤研究的热点问题主要是: ①皮肤种子细胞的分离与体外培养。②表皮组织和支持基质。③真皮组织和支架材料。④复合人工皮肤。⑤临床应用所面临的问题。

最近多年来,组织工程的迅猛发展,使得研究开发具有良好生物相容性的、在植入体内后可以自行生物降解的、可用于器官和软、硬组织的重建与修复的组织工程材料成为可能。组织工程的第一个面市产品是人工皮肤,也是迄今为止在临床应用方面最为成功的组织工程材料。目前,已有的商品是Biobrane-TM、Dermagraft-TC和Apligraft-TM等,且已在烧伤、慢性静脉溃疡以及先天性皮肤畸形等疾病的治疗方面取得良好效果。近些年来,人工皮肤的研究开发十分活跃,新的人工皮肤产品不断涌现。有人曾把人工皮肤分为表皮替代物、真皮替代物和全皮替代物三类,然而,根据人工皮肤的发展,笔者以为,已有的人工皮肤可以根据其性能分为普通型人工皮肤和组织工程化人工皮肤也可根据其与损伤皮肤的结合方式分为暂时替代性人工皮肤和永久替代性人工皮肤。

1 暂时替代性人工皮肤

暂时性代用品提供伤口暂时的生理性覆盖,就象正常皮肤一样,具有避免机械损伤、防止细菌人侵、阻止水分蒸发和丢失的作用。因而,这些代用品用于伤口有助于形成潮湿的伤口环境。使用暂时替代性人工皮肤的好处是:(1)作为供皮区敷料,有利于减轻疼痛,促进伤口上皮化;(2)在切削痴手术后,为深度和度伤口提供暂时的生理性班盖物;(3)对可疑伤口作为实验性移植物。临床上应用的暂时替代性人工皮肤大体又可分为以下几种:

1.1猪皮

多种生物来源的异种皮在临床已应用多年,最常用的物种是家畜,如羊、牛、猪。其中猪是应用最广泛且时间最长的一种异种猪皮被加工后制成膜片或筛网状的均质真皮结构,已被广泛用于暂时覆盖清洁创面、浅伤口和供皮区。也有医院在有表皮溶解坏死的中毒病人中使用。虽然猪皮不能血管化,但它将粘附到干净创面并有效控制疼痛。然而,这种材料并不属于与人体相容的生物医学材料,只是暂时性替代品,因此,最终要被宿主所排斥。

1.2合成膜

许多生物性材料如胶原、6一硫酸软骨素、透明质酸、甲壳素和相似的纤维网都可被用于制作合成膜。这种半透性膜敷料当应用到干净伤口或供皮区时,能有效地控制疼痛,防止细菌人侵,同时还具有防止水分蒸发的特性,这对于清洁浅2度创面和供皮区有较好的作用。目前常用的一种简单的双层合成膜Biobrane,其内层由能够纤维血管化的尼龙膜组成,而外层则由起保持水分和细菌屏障作用的硅胶膜构成,并已在清洁的浅度创面和供区的临床应用上证明疗效良好。水状胶质敷料也是一种人工合成材料膜,其目的是为伤口建立一个湿润的环境。当吸收伤口分泌物时,实验和临床均发现湿润环境有助于伤口的上皮化,有助于伤口愈合。所有合成膜或多或少都是闭合的,故必须谨慎使用,常有选择性地用在清洁的浅2度创面和供区。如果应用于感染、深度或有坏死组织的伤口,那么膜下积脓就可能发生,甚至导致灾难性后果。合成敷料如硅胶膜比较容易获得,但尽管增加了胶原和蛋白多糖等生物材料,它们的作用仍是暂时性的。

1.3异体皮暂时性替代品

覆盖烧伤创面最理想的方法是移植自体皮,早在1910年自体皮肤移植即获成功。但对于大面积烧伤病人(>50%体表皮肤),自体皮源不足,必须采用其他来源的替代物。从自愿捐献者获得的同种异体皮是最常用的异体暂时性替代品。经过加工处理后,用液氮冰冻保存备用,需要时,异体皮被迅速解冻使用。异体皮将为烧伤创面提供暂时的生物敷料,并与宿主建立短暂的血运,直到宿主识别出异体皮上面表达的外源性抗原表面物质,启动机体的免疫机制,产生排斥反应。这个过程通常在移植3一4周后发生。如果应用抗排斥药物可能会延长异体皮在宿主的生存时间,但对大面积烧伤病人来说,则不太实际。因为这种治疗将进一步减弱宿主抵抗力,会导致脓毒败血症的发生。新鲜、冷冻或冻干的异体皮对治疗热烧伤,特别是大面积3度烧伤很有效,如1958年我国上海瑞金医院采用异体皮移植的方式成功地抢救了大面积烧伤的钢铁工人。

1.4其它

虽然异体皮处理和使用简单方便,但由于异体皮的采集难度大,皮源严重缺乏,受体也常面临病毒感染的威胁,因而导致人工构建异体皮的产生。等可能是第一个尝试构建这种生物皮的,他用一个胶原网作异体表皮细胞的培养支架,并成功地移植到一个无胸腺鼠模型中。

这个产品后来证明在烧伤病人、慢性溃疡病人中都有一定的临床效果。其它暂时性异体皮还包括：（1）由体外将异体表皮和成纤维（FB）细胞种植到双层牛胶原基质中培养而成的复合皮肤替代品。这种产品主要被研究用于2度烧伤创面,但它的疗效仍值得进一步观察;(2)生长在可生物降解网或内层尼龙膜的异体FB细胞,也被认为是伤口愈合的增强剂。

还有人在浅2度创面和供区使用异体表皮细胞作暂时性覆盖。虽然这些细胞在宿主存在不会超过天,但由这些异体细胞分泌的物质如生长因子可能给宿主提供加速伤口愈合的信号。目前,至少有种生长因子包括EGF、TGF一β、IGF一1、PDGF和FGF在伤口愈合中起促进作用。培养异体表皮细胞还可避免培养自体表皮细胞的时间延误。虽然培养的异体表皮只是暂时覆盖创面,最终都要被宿主自体细胞所取代,但许多研究者认为,它可能通过分泌某些生长因子而刺激伤口快速愈合。

2永久性皮肤替代品

利用组织工程原理研究人工皮肤是近年来皮肤缺损修复临床研究中一个重要课题,为在临床上根本解决皮肤缺损的修复问题提供了良好的前景。大面积烧伤与皮肤慢性溃疡是临床常见病、多发病,其治疗是外科难题之一。因此,如何促进和加快伤口愈合、减少疤痕形成是人们历来关注的重要课题,如何及时覆盖大面积创面、减少创面收缩和避免疤痕增生,更是全球医疗市场上一个急需解决的重要临床问题。

近20年来随着组织工程学的创立、人工皮肤的研究和开发,医学界已经基本形成共识人工皮肤是解决上述问题的最根本途径。

人工皮肤是组织工程研究最成功的产品,在美国,已经有三家公司的“人工皮肤”材料成为商品用于烧伤治疗,效果极为显著。因此各国医学生物材料专家都在积极地探索和研制适合本民族的“人工皮肤”材料,这一类研究主要集中在美、日、英、法、德等发达国家,广大发展中国家则少有“人工皮肤”研制的报道和成果。

迄今为止,常见的永久性皮肤替代品有表皮膜、真皮类似物及复合皮代用品等,下面扼要地逐一介绍。

2.1皮肤干细胞

皮肤干细胞是目前引起广泛关注的一类成体干细胞, 它的分离对于皮肤损伤修复具有重要意义。干细胞在表皮基底层呈片状分布,在没有毛发的部位(手掌等), 表皮干细胞位于与真皮乳头顶部相连的基底层,其它有毛发的皮肤表皮干细胞则位于表皮脚处的基底层。

2.2表皮膜

1975年,Rheinwald和Green在建立了表皮角细胞培养技术和发现了中性蛋白酶Dispase之后,有人取患者正常小块皮肤经体外分离、培养表皮角细胞,待其融合后形成薄层状的表皮皮片,这种表皮皮片被称为人工表皮。1981年人工表皮首次进入临床使用,年我国也开始了人工表皮的临床应用。1989年人工表皮由Genzyme Tissue Repair公司实现商品化。采用上述方法制备人工表皮,可以获得原标本皮肤面积1000~10000倍的表皮皮片。这种人工表皮的临床应用大大地缓解了临床皮肤供体不足的矛盾。临床结果证实,人工表皮移植到人体后,可在自体或异体创面存活一段时间,缩短创面的愈合时间,减少体液的流失,防止细菌感染。但由于人工表皮不具备真皮组织,且其柔韧性、弹性和物理机械性能较差,容易破溃和感染,移植几个月后,创面疤痕较多,挛缩明显,其外观和功能不如自体分层皮肤移植。

表皮细胞的分离技术主要有胰蛋白酶消化法(Trypsin,Tr)和噬热蛋白酶一胰蛋白酶联合消化法(Thermolysin-trypsin,Th-Tr)。表皮细胞的培养主要有种方法,即皮块法、滋养层法、无血清培养法和气一液界面培养法等。

目前,人们在烧伤和其它慢性创面应用培养的表皮细胞方面已取得丰富的临床经验。使用该技术的最大优点是,它能提供大量可供移值的表皮膜或细胞,作用于病人受区时能迅速恢复皮肤的屏障功能,因而提高了病人的生存机会。但是,尽管这一上皮移植技术的进步令人振奋,但不可忽视的是它所提供的仅是单纯的搜盖创面的上皮,而不是一个完整的双层皮肤结构,而且利用此技术获得大量自体细胞要求病人必须有大量的正常皮肤组织和长达2~3周的治疗时间。在这个过程中仍然需要暂时性皮肤替代品来援盖创面。并且由于移植的表皮膜薄而脆,不能牢固地粘附于基底膜之上,因而缺乏正常的机能稳定性,移植后不可避免地减弱许多功能和影响观感,如瘫痕收缩、水泡形成等不足,而且上皮膜的使用和转移也费时费钱。尽管如此,限于技术原因,当大面积烧伤病人的供区有限时,表皮细胞覆盖创面仍是一个可行的治疗方法。

2.3真皮类似物

临床上单独使用表皮膜覆盖创面,移植成功率和远期效果都不理想。因此,有些学者将培养的表皮移植到真皮上,发现有更好的效果,提示真皮组织在伤口愈合过程中起重要作用。真正的真皮能影响表皮细胞的迁移、分化、粘附和生长。研究者认为,使用合适的真皮代用品能提高长期耐受力。Cuono提出用已除去表皮细胞,只留下可血管化、但理论上无抗原性的脱细胞异体真皮来覆盖创面,虽然研究有些进展,但这种技术并没被广泛应用和接受。因为在切除表皮时,如切得太浅则留下抗原性的表皮细胞,太深则易去掉表皮和真皮之间的粘附结构,因而有人试图寻找其它真皮类似结构。目前,已有多种真皮类似物在临床上使用。

Burke和Yannas在1980年所建立的Integra人工真皮就是其中一种,现已被广泛应用。Integra人工真皮的作用是为新鲜创面提供暂时防止水分丢失和细菌人侵的屏障,并为以后真皮再生提供一个支架。这种人工真皮的内层是由来源于牛胶原蛋白、蛋白多糖以及6一硫酸软骨素构成的复合物,厚约2mm,有70~200nm的微孔,这种多孔结构有利于纤维血管从宿主增生。而外层是0.009英寸硅胶聚合物,具有水分通透性,能刺激皮肤正常上皮化。这种人工真皮的制作是个复杂的工艺,包括粘多糖和胶原纤维的快速冻干、交联、仔细冲冼。这种物质主要被用于3度烧伤面切痴手术后。2~3周后,外层硅胶膜由自体表皮细胞代替,而内层降解。该产品自面市以来,已在多家烧伤中心使用,对治疗严重烧伤病人可能有重要作用,但也需提防膜下积脓。

含有异体FB细胞的多聚泌乳素网也被探讨作为真皮类似物,这个新型载体通过水解而降解,炎症反应小,而异体FB细胞有助于宿主产生新真皮,但它在烧伤病人中的应用有待进一步研究。最近由Lifecell公司推出的Alloderm,其脱细胞的异体真皮来源于尸体皮,经严格的安全性检测后,用高渗盐水除去表皮层,并用清洁消毒剂灭活所有病毒,冻干。这个过程理论上可产生无抗原性的真皮支架,具有包含LN和IV和VII型胶原蛋白的基底膜。在应用时经生理盐水冲洗后,同培养的自体表皮细胞联合应用于烧伤病人。临床实验看来有效,但要广泛推广使用仍似为时尚早。

2.4复合皮替代品

近年来,已逐渐意识到上皮膜的应用面临着许多问题,因而导致由表皮、真皮构成的复合活性皮肤类似物的产生。最近的趋势是,应用由抗原性相对低的脱细胞异体真皮或其它真皮类似物与体外培养的自体表皮细胞复合移植。复合培养皮(CCS)就是将自体表皮细胞和成纤维细胞在牛FB型胶原蛋白支架上培养而成。当、胶原、血清和组织培养液在能够限制收缩的模子里混合后,FB收缩胶原纤维网形成胶原蛋白凝胶,构成了这个复合皮的真皮层。然后,自体表皮细胞悬液被加到这个胶原一层里,培养几天后,将表皮层暴露到空气中以刺激表皮细胞分化。7-10天后,在气一液界面就形成角化上皮。大多数研究者认为,这种培养的复合皮将为大面积烧伤病人提供理想的皮肤替代品。它不仅具有较理想的外观和功能,而且在真皮一表皮间还有重要的连接组织。相对表皮膜而言,复合移植减少了很多不足,有很大进

步。但自20世纪90年代以来,人们对这种乐观态度较前有所下降,主要因为这种方法培养

的表皮细胞移植到病人后,最初都能被接受,但在远期随访过程中常发现表皮会无故丢失,即最终接受率低,导致临床效果较差。因而,复合移植治疗大面积烧伤的真正临床效果还值得

怀疑。

Falanga等报告所制成的具有双层结构复合皮肤Apligraf的构建及应用情况,真皮层

是由FB、牛型I胶原、血清等形成凝胶。表面接种上皮细胞,体外培养7一10天形成含上

皮角化层的人工皮肤,应用治疗老年人静脉性溃疡,溃疡愈合快,临床亦未见对异体细胞所构建类皮肤的排斥反应。Boyce等所设计的皮肤替代品是将异体FB、胶原和糖胺多糖构成胶

原膜,然后在它表面接种上皮细胞,移植裸鼠的动物实验获得成功,但在小量的试验中结果尚不理想,目前正对此进行深人研究。

国内的研究也取得了很大的进展。王旭等直接在胶原膜的两面分别种植表皮细胞和成

纤维细胞,经培养形成纤维母细胞一胶原膜一表皮细胞夹心式人工复合皮,该复合皮具有一

定的机械强度和柔韧性,不易碎裂,便于手术操作。将其异体移植于临床患者,未发现明显排斥现象,移植存活率为70%。

第一个组织工程化人工皮肤已于1997年3月经美国批准上市。这种产品是由器官基因公司推出的,被称为”适移植”的活性皮肤,它由新生儿的包皮细胞培植而成,呈层状结构,

与正常人的皮肤极为相似,能分泌人体皮肤胶原、生长因子和结构性蛋白,可与病人自身的

皮肤很好地融合,不存在排异作用,就连病人自身的血管和色素也会逐渐转移到”适移植”

活性皮肤中去,愈后不留瘫痕。

近些年来,国内人工皮肤的研究与开发取得了许多进展,如转基因猪皮、全层皮肤、一

人工皮肤以及丝素蛋白制造人工皮肤等新的人工皮肤材料相继研究成功。

2.5复合人工皮肤

理想的组织工程化皮肤应包含表皮与真皮 2层,因为无论在解剖上还是在功能上两者

都是相互依存的整体。在上述真皮替代物上接种角质细胞,经过培养后形成人工复合皮肤[17] 。1981 年,Bell 等培养、扩增的 SD 大鼠成纤维细胞融铸于胶原网格中, 胶原收缩

后成为一种真皮类似物,5～7 天后再在其表面种入未经培养的自体表皮细胞,这种人工复合皮肤被固定在供体鼠背部的开放创面上。表皮细胞植入后第 4 天,就可观察到胶原网格被

表皮细胞部分覆盖,5 周后可见多层分化的表皮细胞覆盖创面并且具有规整、光滑的基底层; 移植后 1 周就有血管长入真皮层,7 周时血管形成情况与周围组织无明显差别; 术后 50 天,80%的移植物仍保持原来的大小和形状。这种人工皮肤类似物应该是第一种真正意义上

的复合皮替代物皮肤芯片瑞士医学专家日前表示，他们研发出一种可植入人体皮肤组织下

的微型芯片，可监测病人健康状况，并通过手机信号发射相关信息。研究人员将这种芯片

称为“微型血液实验室”。这种微型血液实验室包括5个传感器、1个无线电传送设备以

及一个电力交换系统。

该设备之所以能监测人体的健康状况，是因为其内部每个传感器的表面都覆盖着一种酶类，可以监测人体内的不同物质，如乳汁、葡萄糖或三磷酸腺苷等的变化情况。目前，传感器表面酶类的监测功能一般可维持半个月的时间，有的甚至能维持一个月，这对于很多病情的研究来说已经够了。由于设备体积小，它的植入和替换也非常简单。这个小设备对于那些正处于化疗期间的病人非常有帮助，同时它还可以通过监测血液中的相关元素提前数小时预警病人心脏病的发作。此外，对于一些慢性病患者来说，它的作用也非常大，因为它可以在人体出现病症之前就能发出相关的预警信号，这个系统的工作潜力巨大，只要人体病理上有变化，它就能够监测到，并且它耗能很低临床应用上所面临的问题现有的几种组织工程化皮肤虽然在治疗烧伤及慢性溃疡上取得了长足进步,但无论在功能上还是在外形上仍有待进一步改善。目前此领域的研究方向是: ①最适于细胞生长基质的选择与开发; ②生长因子基因转染表皮细胞,以缩短表皮细胞培养时间,提高创面修复质量; ③表皮细胞与基质的相互作用; ④同种异体成纤维细胞、表皮角朊细胞的应用与转归; ⑤将黑色素细胞、朗格罕氏细胞引入皮肤构建等 [20] 。⑥组织工程化组织的移植与自体组织移植一样,植入体内后同样存在一个血运重建的过程,小块的移植组织由于可以尽快建立血液供应而获得成活,而大块的移植组织如果不能尽快建立血液循环,将由于缺血而发生坏死,最终导致移植的失败 [21] 。随着 21 世纪生命科学、手术技术、材料科学以及诸多相关学科的飞速发展, 在未来几年内,这些问题将会被逐一解决, 而创造出一种理想的功能与外形近乎正常的人工皮肤替代物将不再是梦想

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