实验二植物组织中可溶性糖的薄层层析分离与鉴定

实验二植物组织中可溶性糖的薄层层析分离与鉴定
实验二植物组织中可溶性糖的薄层层析分离与鉴定

实验二植物组织中可溶性糖的薄层层析分离与鉴定

[实验目的]

糖类是自然界存在的数量最多的有机化合物,它既是植物躯体和细胞的结构成份,又是生命活动能量的主要来源,并且与植物体内各类物质的代谢密切相关,分离鉴定植物组织中可溶性糖的种类及其变化,对了解植物体内的组织代谢和农产品的品质,具有重要意义。本实验采用硅胶G薄层层析法,分离鉴定植物组织中可溶性糖的种类,要求通过本实验,学习提取植物材料中可溶性糖的一般方法,掌握吸附薄层层析的原理,操作及其在糖类鉴定中的作用。

[实验原理]

植物组织中的可溶性糖可用一定浓度的乙醇提取出来,经除去杂质,即可获得较纯的可溶性糖混合物。

薄层层析是层析法的一种,层析法是利用被分离样品混合物中各组分的物理、化学差别,使各组分以不同程度分布在两个相中,这两个相通常使一个被固定在一定的支持物上的,称为固定相;另一个是移动的,称为流动相;当流动相流过固定相时,在移动过程中由于各组分在两相中的分配情况不同,或吸附性质不同,或电荷分布不同,或离子亲和力不同等,而以不同速度前进,从而达到分离的目的。

薄层层析是一种快速而微量的层析方法,它是将一种固定支持物均匀地涂在薄板上,对物质进行层析的方法,本实验只讨论吸附薄层层析,即所有支持物是吸附剂(如硅胶粉),层析时,主要是根据吸附剂对样品中各组分的吸附能力不同,因此个组分的移动速度不同,从而达到分离混合物的目的。

糖为多羟基化合物,具有较强的极性,在硅胶G薄板上展层时,糖与硅胶分子有一定的吸附力。硅胶分子与糖的吸附能力大小取决于糖的分子量和羟基数目,不同的糖分子由于分子量及羟基数的不同,因而它与硅胶分子间的吸附力不同。造成各种糖分子在展层过程中移动的距离不同,从而将各种糖分离出来,一般吸附力的大小为:三糖>双糖>己糖>戊糖。其中各种糖移动的速率可用Rf值表示。通过与标准糖的Rf值比较。即可鉴定出植物组织提取液中糖的种类。

溶质斑点中心到样点的距离:Rf( 值) = 溶剂前沿到点样点的距离

[器材与试剂]

1、材料:苹果或其他植物材料

2、仪器:离心机及离心管、天平、研钵、量筒(25ml)、移液管(10ml)、恒温水浴、毛细管、层析缸、吹风机、烘箱、喷雾器、烧杯、铅笔,尺子,硅胶GF254薄层层析板。

3、试剂

展开剂(氯仿:冰醋酸:水=30:35:5)

5%标准糖溶液(10mg/ml):木糖,葡萄糖,果糖,蔗糖等。

显色剂:2mL苯胺,10mL 85%磷酸,2g二苯胺,1mL浓盐酸,100mL丙酮,溶解后混匀)[实验步骤]

1、硅胶板活化:将硅胶板置于120℃烘干箱中,烘干30min。

2、水果中可溶性糖提取液的制备:取洗净的苹果(或其他水果)削去果皮,称3g果肉在研钵中研成匀浆后,倒在双层洗净的纱布上。包起置于漏斗,用干净玻璃棒将果汁压出。取果汁1ml于离心管中,加无水乙醇3ml,充分混匀后,在3000转/分下离心20分钟,上清夜即为可溶性糖提取液。

3、苹果提取液中可溶性糖的分离鉴定:取活化后的硅胶G板一块,距底边1.5厘米水平线

上确定5个点,相互间隔1厘米,其中4个点,分别点上5%的木糖,葡萄糖,果糖,蔗糖标准溶液数滴,另一点点上苹果提取液数滴。在用毛细管点样时,毛细管应垂直于硅胶G 板的方向点样,而且毛细管接触G板的时间应尽量短,不然点样斑点直径难以控制,点样量约20-30μL,分次滴加,使点扩散后的直径不超过3mm。

4、展层

将点样后的薄层板置于密闭的薄层层析缸中,用新配制的展开剂,采用上行法展层,至展开剂距薄层板的上端约1cm时取出,用吹风机吹干。

5、显色

把一块薄板放在通风橱内,采用苯胺-二苯胺-磷酸(2g二苯胺,加2mL苯胺,10mL 85%磷酸,1mL浓盐酸,100mL丙酮,溶解后混匀)显色剂丙酮溶液喷雾法显色,然后于85℃烘箱中烘10-30分钟,各种糖即显示出不同色斑与标准糖比较,根据斑点颜色及Rf值即可鉴定出苹果提取液中所存在的可溶性糖的种类。

显色剂处理后不同单糖显现的颜色

单糖颜色

葡萄糖蓝紫

半乳糖蓝紫

果糖橙红

木糖蓝绿

鼠李糖绿

[实验结果]

精确量出原点至溶剂前沿,以及各斑点中心的距离,计算出它们的R f值。根据标准糖的颜色和R f值,鉴定出样品中糖的种类,并绘出层析图谱。

原点至斑点中心的距离

Rf=──────────────。

原点至展开剂前沿的距离

[注意事项]

1、点样时,要注意点样点不能太大,操作时,应待第一次点样风干后,再在原点样点上继续点样,为少量多次点样。

2、每个点样点不宜距离太近,点样点不宜靠近硅胶板边缘,注意边缘效应。

3、放置硅胶板时,不能碰着层析缸的内壁。

4、在用多元系统进行展层时,其中极性较弱的和沸点较低的溶剂(例如氯仿-甲醇系统中的氯仿)在薄层板的两边易挥发,因此,它们在薄层两边的浓度比在中部的浓度小,也就是说在薄层的两边比中部含有更多的极性较大或沸点较高的溶剂,于是位于薄层两边的Rf 值要比中间的高,即所谓“边缘效应”。为减轻或消除边缘效应,可先将展开剂导入层析缸中,使层析缸内溶剂蒸汽的饱和程度增加。

酵母菌的分离纯化

酵母菌的分离纯化-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN

酵母菌的分离纯化、固定化和酒精发酵 第一部分酵母菌的分离纯化 一、实验目的 应用酵母菌的生理生化和生态学的特点,从自然环境中分离酵母菌,并掌握微生物分离纯化的基本方法。 二、实验原理 酵母菌常见于含糖份比较高的环境中,如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件,最适pH为酵母菌生长迅速,容易分离培养。在液体培养基中,酵母菌比霉菌生长快,利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养,然后在固体培养基上划线分离纯化。 三、器材和用品 1、甘蔗、苹果皮、葡萄皮、果园土、菜园土等。 2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基:马铃薯200g(煮开10min后过滤取汁),葡萄糖20g,琼脂20g,水1000ml,pH自然。分装三角瓶;试管斜面1支/组 3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液:配方同上,不加琼脂加乳酸,按1000ml培养基加入5ml乳酸,pH为左右,再分装试管9ml2支/组。 4、无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、美兰染液、显微镜、接种环等。 四、实验方法 1、接种:取果皮(不需冲洗)或土壤5克,加入到100ml无菌水中,充分搅拌后,用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中,在28-30℃培养箱中培养24h,可见培养液变浑浊。 2、加富培养:用无菌吸管取上述培养液1m l,注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中,在28-30℃培养箱中培养24h。 3、镜检:用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上,中央滴一滴美兰染液,混合均匀后制成水浸片,在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式,并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞,因活细胞使美兰染液还原,故菌体不着色。 4、涂皿:用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板,用无菌吸管取加富培养液到平板中,用涂棒涂匀后培养24h。 5、分离纯化:用接种环挑取单个酵母菌菌落,在平板上四区划线,培养后分

生物化学实验五 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定

实验五酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 一、目的要求 学习和掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法;了解核酸的组分,并掌握鉴定核酸组分的方法。 二、实验原理 酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液,在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀,由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解,从水解液中可以测出上述组分的存在。 三、器材与试剂 1〉材料 酵母粉。 2〉器材 乳钵、150ml锥形瓶、水浴锅、量筒、吸管、洗耳球、漏斗、滴管、试管、试管架、烧杯、离心机、滤纸、试管夹。 3〉试剂 (1) 0.04mol/L氢氧化钠溶液。 (2)酸性乙醇溶液:将0.3ml浓盐酸加入30ml的乙醇中。 (3)95%乙醇。 (4)乙醚。 (5)

1.5mol/L硫酸溶液。 (6)浓氨水。 (7) 0.1mol/L硝酸银溶液。 (8)三氧化铁-浓盐酸溶液: 将2ml 10%三氧化铁溶液(用FeCl 3·6H 2O配制)加入到400ml浓盐酸中。 (9)苔黑酚乙醇溶液: 溶解6g苔黑酚于100ml 95%乙醇中。 (10)定磷试剂。 a.17%硫酸溶液: 将17ml浓硫酸(比重 1.84)缓缓加入到83ml水中。 b. 2.5%钼酸铵溶液:将2.5g钼酸铵溶于100ml水中。 c.10%抗坏血酸: 将10g抗坏血酸溶于100ml水中,储于棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用,如呈深黄色或棕色则失效。 临用时将上述3种溶液与水按比例混合:17%硫酸溶液︰ 2.5%钼酸铵溶液︰10%抗坏血酸︰水=1︰1︰1︰2(体积分数)。

四、实验步骤 1〉RNA提取 将10g酵母悬浮于90ml 0.04mol/L氢氧化钠溶液中,并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150ml 锥形瓶中。在沸水浴上加热30min后,冷却。(3000r/min)离心10分钟,将上清液缓缓倾入30ml酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后,(3000r/min)离心5分钟。弃去上清液。用95%乙醇洗涤沉淀两次,每次10ml。乙醚洗涤沉淀一次后,再用乙醚将沉淀转移至漏斗中过滤。沉淀即为粗RNA,可在空气中干燥。作鉴定或测定含量用。 2〉鉴定 取200mg提取的RNA,加入 1.5mol/L硫酸溶液10ml,在沸水浴中加热10min制成水解液并进行组分的鉴定。 (1)嘌呤碱: 取水解液1ml加入过量浓氨水,然后加入约1mL 0.1mol/L硝酸银溶液,观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。 (2)核糖: 取一支试管加入水解液1mL、三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液 0.2ml。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色,说明核糖的存在。 (3)磷酸: 取一支试管,加入水解液1ml和定磷试剂1ml。在沸水浴中加热10min,观察若溶液变成蓝色,说明有磷酸存在。 五、结果处理

植物组织中可溶性糖含量的测定

九植物组织中可溶性糖含量的测定 一.实验目的 学习可溶性糖测定的蒽酮比色法 二.实验原理 植物在个体发育的各个时期,代谢活动也发生相应的变化,碳水化合物的代谢也不例外其含量也随之发生变化。了解可溶性糖含量的变化,在生理上和实践上都有重要的意义。本实验采用蒽酮比色法测定可溶性糖的含量。糖在硫酸的作用下生成糠醛,糠醛再与蒽酮作用,形成一种绿色的络合物.在低浓度时,625nm 的OD值与糖含量成正相关。该实验方法简便,但没有专一性,对于绝大部分的碳水化合物都能与蒽酮反应,产生颜色。 三.实验用品 721型分光光度计分析天平研钵恒温水浴锅烧杯刻度试管大试管活性炭移液管漏斗酒精(80%) 葡萄糖标准溶液:称取已在80℃烘箱中烘至恒重葡萄糖100mg,配制成 500mL溶液,即得每mL含糖为200μg的标准溶液。 蒽酮试剂:称取1g经过纯化的蒽酮,溶解于1000mL稀硫酸中即得。稀硫酸溶液由760mL浓硫酸(比重1.84)稀释成1000mL而成。四.实验步骤 1.可溶性糖的提取 称取0.5g的新鲜植物(青菜)叶片,于研钵中加80%酒精4ml,仔细研磨成匀浆,倒入离心管内,置于80℃水浴中不断搅拌30min,离心10分钟(5000转/min),收集上清液于10ml的刻度试管中,其残渣加2ml80%酒精重复提1

次,合并上清液。在上清液中加0.5g活性炭,80℃水浴脱色30min,定容至10ml,过滤后取滤液(稀释10倍或20倍后)测定。 2.显色及比色 吸取上述糖提取液1mL,放入一干洁的试管中,加蒽酮试剂5mL混合之,于沸水浴中煮沸10分钟,取出冷却,然后于分光光度计上进行测定,波长为625nm,测得吸光度。从标准曲线上查得滤液中得糖含量(或经直线回归公式计算),然后再行计算样品中含糖百分数。 3.绘制标准曲线 取标准葡萄糖溶液将其稀释成一系列不同浓度的溶液,浓度分别为每mL含糖0、5、10、20、40、60、80μg。按上述方法分别测得其吸光度,然后绘制A625-糖浓度曲线,或进行直线回归求得直线方程。 试剂(ml) 管号 1 2 3 4 5 6 葡萄糖标准液0 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 80%酒精 1.0 0.95 0.9 0.8 0.7 0.6 蒽酮-硫酸试剂 5 5 5 5 5 5 葡萄糖浓度(ug/ml) 0 10 20 40 60 80 4.计算样品中含糖量% 设V为植物样品稀释后的体积(m L) C为提取液的含糖量(μg/ m L) W为植物组织鲜重(g) 则得计算式如下:

实验 酵母RNA的分离及组分鉴定

※实验六酵母RNA的分离及组分鉴定 【实验目的】 了解核酸的组分,并掌握鉴定核酸组分的方法。 【实验原理】 酵母核酸种RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液,在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解,从水解液中可以测出上述组分的存在。 鉴定依据:磷酸与定磷试剂反应产生蓝色物质。核糖与苔黑酚作用产生绿色物质。嘌呤碱与硝酸银能产生白色的嘌呤碱银化合物沉淀。 【实验器材】 150 ml锥形瓶、水浴、量筒、漏斗及抽虑瓶、吸管7、滴管8、试管及试管架9、烧杯、离心机、漏斗 【试剂和材料】 1、0.04 mol/L氢氧化钠溶液; 2、酸性乙醇溶液:将0.3毫升浓盐酸加入30毫升乙醇中; 3、95%乙醇; 4、乙醚; 5、1.5 mol/L硫酸溶液; 6、浓氨水; 7、0.1 mol/L硝酸银溶液; 8、三氯化铁浓盐酸溶液:将2 ml 10% 三氯化铁溶液(用FeCl3·6H2O配制)加入到400 ml浓盐酸中; 9、苔黑酚(地衣酚)乙醇溶液:溶解6 g苔黑酚于100 ml 95% 乙醇中(可在冰箱中保存一个月); 10、定磷试剂:(1)17% 硫酸溶液:将19 ml浓硫酸(比重1.84)缓缓加入到83 ml 水中(2)2.5% 钼酸铵溶液:将2.5 g钼酸铵溶于100 ml水中(3)10% 抗坏血酸溶液:10 g抗坏血酸溶于100 ml水中,贮棕色瓶保存(溶液呈淡黄色时可用,如呈深黄或棕色则失败,需纯化抗坏血酸)。临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。17% 硫酸溶液:2.5%

酵母菌的分离筛选方法

酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生,一般生长在含糖较高,偏酸的环境中,在通气条 件下,液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似,较大而厚,多数不透明, 菌落光滑湿润粘稠,乳白色,少数干皱,边缘整齐,呈红色或粉红色, 圆形椭圆卵形,液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。 含高糖浓度(45%),分离蜂蜜酵母,球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1.培养基: 葡萄糖 50g/L 尿素1g/L (NH4)2SO41g/L L L MgSO41g/L FeSO4 L 酵母膏 L 孟加拉红 L (富集用) ★乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基:马铃薯200g/L 葡萄糖(霉菌用蔗 糖)20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g,加水煮沸30min,纱布 过滤,补足蒸馏水1L,PH自然。(去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培养 用)(富集用) ★麦芽汁培养基:1:4水60-65℃水浴3-4小时,4-6层纱布过 滤,可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫,倒入糖化液中,煮沸过滤, 10-15波林,氯霉素L 121℃ 20min (分离保存 用) 灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素(集菌用) ★虎红(孟加拉红)培养基:蛋白胨L 葡萄糖10g/L L L 孟加拉红L 氯霉素L 琼脂15g/L PH自然 (分离纯化用)

★豆芽汁培养基:黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g黄豆芽,加水煮沸30min,纱布过滤,补足蒸馏水1L 察氏培养基:主要培养霉菌观察形态用 蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾L 硫酸镁 L 硫酸亚铁L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然 一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基,啤酒酵母用酒花麦汁培养基,葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌:研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系,一般不进行集菌,以免改变其中不同种类数量间的对比,将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株,加酸性含糖的培养基,酸性豆汁,必要时注入高浓度的酒精(13-17%),霉菌在液体中形成菌丝体,酵母不形成菌丝,25-28℃2-3d,遇到菌丝体用接种环挑去烧掉,去掉上清液,取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中,集菌连续两至三次才能完成,要配合镜检。 实例:将待分离的样品10g(ml)放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶(玻璃珠),摇床振荡20-30min,取上清液接种于酸性培养液(乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁)25-28℃2-3d,培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉,集菌连续两至三次,培养液变成混浊,产生菌膜和沉淀物。镜检:美兰染液染色,活菌可还原美兰染液,菌体无色。 3.筛选:

植物组织中可溶性糖含量的测定(蒽酮法)

Ⅳ、植物组织中可溶性糖含量的测定(蒽酮法) 一、目的 掌握蒽酮法测定糖的原理和技术。 二、原理 糖类(包括单糖、双糖、寡糖)在浓硫酸存在下,脱水生成糠醛或羟甲基糠醛,然后蒽酮与糠醛或羟甲基糠醛经脱水缩合,生成蓝绿色的糠醛衍生物,颜色深浅与糖浓度成正相关。其反应式如下: 显色反应与反应温度、加热时间、反应系统中水和硫酸比例有关。本实验通过控制反应系统中水和硫酸比例,利用硫酸与水发生水合作用释放的热能,使反应系统自行升温而达到显色效果免去外加热步骤。 蒽酮法具有很高灵敏度,适用于糖的微量测定,且试剂简单,操作简便,因而得到普遍应用。 三、材料、仪器设备及试剂 1.材料:烘干材料粉末(过筛100目)或剪碎混匀鲜样品。 2.仪器设备: 分光光度计;电子分析天平;水浴锅;100ml容量瓶;试管;漏斗;剪刀;移液管;洗耳球等。 3.试剂及配制: 蒽酮试剂:称取蒽酮200mg溶于100ml浓硫酸中。该试剂不能久贮,宜用前配制。 100μg·ml-1 蔗糖标准母液:准确称取蔗糖100mg于烧杯加少量水溶解后,洗入 100ml容量瓶中定容至刻度。 四、实验步骤 1.蔗糖标准曲线制作 1.1取6支试管,编号,按下表配制每管含量为0~100μg蔗糖标准液 加入表中试剂后,向各管沿管壁迅速加入蒽酮试剂6.5ml,并立即摇动使混合均匀,置试管架上室温下显色,冷却后倒入比色杯,以0号管作空白对照,在620nm波长处,以多点校准总量法,制作标准曲线。 2.样品提取 称取干样品粉末100mg或剪碎混匀的鲜样品1g,放入试管中,加入蒸馏水10ml,置于沸水浴中提取20min,冷却后过滤入100ml容量瓶中,以热水冲洗残渣2~3次,一并滤入容量瓶中,待冷至室温,定容至刻度,即为样品待测液。 3.糖含量测定 吸取待测液0.2ml(含糖量30~80μg),加入试管中,再加蒸馏水2.3ml,摇匀。随后沿试管壁迅速加入蒽酮试剂6.5ml,立刻摇动混合均匀,置于试管架上显色,冷却至室温后,以空白管作对照,在620nm波长处,按多点校准定量法测定待测管中提取液糖含量。 五、结果计算

根际细菌分离纯化及鉴定实验方案

根际土壤细菌分离纯化及鉴定实验方案 一、方法: 稀释涂布分离法 二、培养基: 1、GPM 培养基(Glucose Peptone Meat extract Agar) 2、牛肉膏蛋白胨培养基(NB ) 3、金氏培养基B (King ) 4、CSEA 培养基(Cold extracted soil extract agar) 5、YG 6、NA 7、无氮培养基 8、分解纤维素菌筛选培养基 9、TSA 培养基 三、实验流程 梯度稀释 涂板分离 挑取不同的单菌落于斜面培养 液体培养及液体保种 提取DNA PCR 扩增 酶切带型分型确定操作单元 连接转化 克隆子挑选及PCR 鉴定 测序 序列拼接 建树 采集根际土壤样品

四、具体实验方案 1、采集根际土壤样品:将植株根系及附着的根际土壤一同装入无菌袋带回实验室。 2、土壤样品稀释及选择合适浓度梯度进行涂板分离:梯度稀释土壤样品,取10-1、10-2、10- 3、10- 4、10- 5、10-6六个梯度涂板,每个浓度梯度涂3个平行,过后放于37℃培养箱中培养1-2d观察菌落生长情况。选择合适的浓度平板,根据形态、大小、颜色,挑取不同菌株的典型单个菌落,达到分离纯化的目的。 3、挑取不同单菌落于斜面保种:通过上述的分离纯化步骤,可筛选得到不同的菌株,对筛选到的菌株接种于斜面放于37℃培养箱中培养。最后斜面放于4℃冰箱保存,备用。 4、液体培养及保种:从斜面上挑取菌苔于相应的液体培养基中放摇床上震荡(转速160r/min,37℃)培养。过后吸取菌液与灭过菌的甘油按7:3的比例于1.5ml灭过菌的EP管中放于-20℃保种。剩下的菌液用于以下实验。 5、提取DNA(CTAB法): (1)取1.5ml菌液于1.5ml离心管中,12000r/min离心2min,弃上清。 (2)向沉淀物中加入350ul双蒸水,重新悬浮沉淀。 (3)加入20ul10%SDS和3ul的蛋白酶K(20mg/ml),混匀,于55℃温育1h。 (4)加入50ul 5mol/L NaCl溶液,充分混匀,再加入50ul CTAB/NaCl溶液,混合后再65℃温育30min。 (6)冷却后加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),小心上下颠倒混匀,12000r/min离心5min,将上清液转移到新的EP 管,重复此步骤2-3次,直至分层界面无白色沉淀。 (7)加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),小心颠倒混匀,12000r/min离心5min将上清液转移到新的EP管。 (8)加入0.6倍体积的异丙醇,轻轻混合直到DNA沉淀下来,12000r/min离心15min弃上清。 (9)向离心管中加入75%乙醇,12000r/min离心5min洗涤DNA沉淀,小心弃上清,重复洗涤1次,弃上清将离心管倒置于吸水纸上,晾干。

实验8-植物组织中可溶性糖含量的测定(蒽酮比色法)

实验方案 一、实验目的 通过实验,掌握测定萝卜品质的方法 (一)萝卜外部形态的测定 1、实验材料 取鲜样3个∕小区 直尺、蒸馏水、笔、记录本、吸水纸 2、实验方法 .用自来水将各组萝卜洗净后,再用蒸馏水洗涤,擦干表面水分.每个小区取3个重复,用电子天平称量每株的鲜重,用直尺测量植株的茎长、茎粗、叶长,取平均值作为指标值 实验(二) 植物体内可溶性糖含量的测定(蒽酮法) 一、实验目的 了解蒽酮法测定可溶性糖含量的原理;掌握分光光度计的使用二、实验原理 糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一,也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。不同载培条件,不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中糖类的含量。因此对水果、蔬菜中可溶性糖的测定,可以了解和鉴定水果、蔬菜品质的高低。 蒽酮比色定糖法是一个快速而方便的定糖方法,在强酸性条件下,蒽酮可以与游离的或多糖中存在的己糖、戊糖及己糖醛酸(还原性和非还原性)作用生成蓝绿色的糖醛衍生物,其颜色的深浅与糖的含量在一定范围内成正比。蒽酮也可以和其他一些糖类发生反应,但显现的颜色不同。当存在含有较多色氨酸的蛋白质时,反应不稳定,呈现红色。上述特定的糖类物质,反应较稳定。该法特点:灵敏度高,测定量少,快速方便。 三、材料、仪器及试剂

1.材料:植物种子、白菜叶、柑桔 2.仪器:分光光度计;恒温水箱;20ml具塞刻度试管(3支)漏斗;100ml容量瓶;刻度试管;试管架;剪刀;研钵 3.试剂 (1)200μg/ml标准葡萄糖:AR级葡萄糖100mg,蒸馏水溶解,定容至500ml。 (2)蒽酮试剂:1g蒽酮,用乙酸乙酯溶解,定容至50ml,棕色瓶避光处贮藏; (3)浓硫酸 四、实验方法 1.葡萄糖标准曲线的制作 取6支20ml具寒试管,编号,按下表数据配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。在每管中均加入0.5ml蒽酮试剂,再缓慢地加入5ml 浓H2SO4,摇匀后,打开试管塞,置沸水浴中煮沸10分钟,取出冷却至室温,在620nm波长下比色,测各管溶液的光密度值(OD),以标 2. 称取1克白菜叶,剪碎,置于研钵中,加入少量蒸馏水,研磨成匀浆,然后转入20ml刻度试管中,用10ml蒸馏水分次洗涤研钵,洗液一并转入刻度试管中。置沸水浴中加盖煮沸10分钟,冷却后过滤,滤液收集于100ml容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,摇匀备用。 3.糖含量测定 用移液管吸收1ml提取液于20ml具塞刻度试管中,加1ml水和0.5ml蒽酮试剂。再缓慢加入5ml浓H2SO4(注意:浓硫酸遇水会产生大量的热!),盖上试管塞后,轻轻摇匀,再置沸水浴中10分钟(比色空白用2ml蒸馏水与0.5ml蒽酮试剂混合,并一同于沸水浴保温10分钟)。冷却至室温后,在波长620nm下比色,记录光密度值。查标准曲线上得知对应的葡萄糖含量(μg)。 五、结果计算 样品含糖量(g/100g鲜重)=查表所得糖含量(μg)×稀释倍数×100/样品重(g)×106 六、注意事项

痢疾杆菌分离与鉴定培训

痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属(Shigellae)细菌又称痢疾杆菌,引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿,死亡110万,发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高,如阿根廷990.6/10万、印度972.3/10万;发达国家相对较低,如美国6~12/10万、德国2.7/10万、法国0.3/10万;我国上世纪50~80年代发病率在46.37~1018.93/10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位,但在卫生状况不良的地区,发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感,各年龄组均可受到感染,5岁以下儿童发病率最高。 据估计,在临床就诊的腹泻病人中的5%~15%是志贺菌引起的,而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见,发达国家以宋内志贺菌为主。美国

宋内志贺菌>75%,但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现,除印度次大陆地区较为常见外,其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性,发病高峰为夏秋季,通常在7~9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容: 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据; 缺乏快速、简便的病原学诊断方法,细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍; 志贺菌耐药性谱的不断扩大,细菌性痢疾抗菌治疗难度加大; 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化; 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体(O)抗原,某些新分离菌株有表面(K)抗原。 (一) 菌体(O)抗原 1.型特异性抗原:多糖,光滑型菌株主要抗原;分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原:光滑型菌株次要抗原,主要存在于B群,籍此将菌型分

植物中可溶性糖含量的测定

植物组织中可溶性糖含量的测定 在作物的碳素营养中,作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。它们在营养中的作用主要有: 合成纤维素组成细胞壁;转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等;分解产物是其他许多有机物合成的原料,如糖在呼吸过程中形成的有机酸,可作为NH 3的受体而转化为氨基酸;糖类作为呼吸基质,为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。由于碳水化合物具有这些重要的作用,所以是营养中最基本的物质,也是需要量最多的一类。 Ⅰ蒽酮法测定可溶性糖 一、原理 糖在浓硫酸作用下,可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛,生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物,在一定范围内,颜色的深浅与糖的含量成正比,故可用于糖的定量测定。 该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物,不但可以测定戊糖与己糖含量,而且可以测所有寡糖类和多糖类,其中包括淀粉、纤维素等(因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应),所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量,实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下,用蒽酮法可以一次测出总量,省去许多麻烦,因此,有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时,则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中,不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外,不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同,果糖显色最深,葡萄糖次之,半乳糖、甘露糖较浅,五碳糖显色更浅,故测定糖的混合物时,常因不同糖类的比例不同造成误差,但测定单一糖类时,则可避免此种误差。 糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为620 nm,故在此波长下进行比色。 二、实验材料、试剂与仪器设备

酵母菌的分离与纯化

酵母菌的分离与纯化 土壤是微生物生活的大本营,是寻早有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同图样中各类微生物的含量不同,一般土壤中细菌数量最多,其次为放线菌和霉菌。放线菌一般在较干燥、偏碱性、有机质较多的土壤中较多;霉菌在含有机质丰富、偏酸性、通气性较好的土壤中较多;酵母菌在一般土壤中的数量较少,而在酒曲、面肥、水果表皮、果园土壤中数量多些。(一)菌源 1土样用无菌的采样小铲在橘树果园中取土壤表层下1~10cm土壤10g,装入灭菌的牛皮纸袋内。封好袋口,记录取样地点、环境及日期。图样采集后应及时分离,饭不能立即分离的样品,应保存在低温、干燥的条件下,以减少其中菌相的变化。 2面肥 (1)面粉500克,白酒100克,水250,和好静置发酵就可以了。冬季10个小时。(2)在温水中兑一点酒,倒入适量面粉拌匀后放入绝缘保温盛器(陶瓷,砂锅)中,用布将整个盛器盖好置于温度较高处,6小时后即成面肥。 *以上方法做出的面肥只能保存几天,不宜放置太久。 3水果果皮 桔子和葡萄等的果皮上含有数量较多的酵母菌,既可单独作为菌源也可以和果园土壤作为混合菌源。 (二)酵母菌的分离 1制备菌悬液 称取菌源1g,加入盛有99ml无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中。振荡20min,即成10-2的菌源悬液。再一次稀释成10-4、10-5、10-6三个稀释度。 2涂布法分离 取融化并冷却至45~50度左右的豆芽汁葡萄糖培养基,每皿分别倾注约12ml培养基到培养皿内。注意,温度过高易将菌烫死,皿盖上冷凝水太多也会影响分离效果;低于45度培养基易凝固,平板高低不平。呆平板冷却后,用无菌移液管分别吸取上述已经制好的菌源稀释液10-4、10-5、10-6三个稀释度菌悬液各0.1ml,依次滴加于相应编号的豆芽汁葡萄糖培养基平板上。每个稀释度做2~3个平行皿。左手拿培养皿,并用拇指将皿盖打开一缝,再火焰旁右手持无菌玻璃涂棒将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散。注意,切忌用力过猛,这样会将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。3培养 接种后,平版倒置于30度恒温箱中,培养2~3天,观察结果。 4纯化 用接种环挑取单个单个酵母菌菌落,在平板上四区划线,培养后分离得到单个菌落。 酵母扩培方案 一、培养基制备 (一)麦芽汁培养基的配制 1.培养基成分 新鲜麦芽汁一般为10-15波林。 2.配制方法 (1)用水将大麦或小麦洗净,用水浸泡6-12h,置于15℃阴凉处发芽,上盖纱布,每日早、中、晚淋水一次,待麦芽伸长至麦粒的两倍时,让其停止发芽,晒干或烘干,研磨成麦芽粉,贮存备用。 (2)取一份麦芽粉加四份水,在65℃水浴锅中保温3-4h,使其自行糖化,直

酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵3(DOC)

酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵 吴英玲 10197020 10生物创新班 摘要:酵母菌喜欢酸性环境,可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培养酵母菌,然后在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养,待长好后置于冰箱内 4 ℃下保存。用TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的酵母菌。并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行微生物鉴定。采用PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行酒精发酵。 关键词:酵母菌分离鉴定固定化酒精发酵 Abstract: Yeast like acid environment, the use of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and duchenne tubular observation screen high fermentation ability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation。 前言 酵母菌(yeast)是一类单细胞真菌。一般呈圆形、卵圆形、圆柱形,其菌落呈乳白色或红色,表面湿润、粘稠,易被挑起。酵母菌多数为腐生,专性或兼性好氧,广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中,例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳,主要用于馒头、面包等食品发酵;在工业上,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸

实验植物组织中可溶性糖含量的测定蒽酮比色法精修订

实验植物组织中可溶性糖含量的测定蒽酮比色 法 标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]

实验七植物体内可溶性糖含量的测定(蒽酮法) 一、实验目的 了解蒽酮法测定可溶性糖含量的原理;掌握分光光度计的使用 二、实验原理 糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一,也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。不同载培条件,不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中糖类的含量。因此对水果、蔬菜中可溶性糖的测定,可以了解和鉴定水果、蔬菜品质的高低。 蒽酮比色定糖法是一个快速而方便的定糖方法,在强酸性条件下,蒽酮可以与游离的或多糖中存在的己糖、戊糖及己糖醛酸(还原性和非还原性)作用生成蓝绿色的糖醛衍生物,其颜色的深浅与糖的含量在一定范围内成正比。蒽酮也可以和其他一些糖类发生反应,但显现的颜色不同。当存在含有较多色氨酸的蛋白质时,反应不稳定,呈现红色。上述特定的糖类物质,反应较稳定。该法特点:灵敏度高,测定量少,快速方便。 三、材料、仪器及试剂 1.材料:植物种子、白菜叶、柑桔 2.仪器:分光光度计;恒温水箱;20ml具塞刻度试管(3支)漏斗;100ml容量瓶;刻度试管;试管架;剪刀;研钵 3.试剂 (1)200μg/ml标准葡萄糖:AR级葡萄糖100mg,蒸馏水溶解,定容至500ml。 (2)蒽酮试剂:1g蒽酮,用乙酸乙酯溶解,定容至50ml,棕色瓶避光处贮藏; (3)浓硫酸 四、实验方法 1.葡萄糖标准曲线的制作 取6支20ml具寒试管,编号,按下表数据配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。 在每管中均加入0.5ml蒽酮试剂,再缓慢地加入5ml浓H 2SO 4 ,摇匀后,打开试管塞,置 沸水浴中煮沸10分钟,取出冷却至室温,在620nm波长下比色,测各管溶液的光密度值(OD 2.样品中可溶性糖的提取 称取1克白菜叶,剪碎,置于研钵中,加入少量蒸馏水,研磨成匀浆,然后转入 20ml刻度试管中,用10ml蒸馏水分次洗涤研钵,洗液一并转入刻度试管中。置沸水浴中加盖煮沸10分钟,冷却后过滤,滤液收集于100ml容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,摇匀备用。 3.糖含量测定

酵母菌的分离纯化实验方案

酵母菌的分离纯化 ?实验目的 1.了解培养基的配置与灭菌技术; 2.无菌操作技术; 3.工业微生物的分离与纯化技术; 4.工业微生物的检测及保藏。 ?基本原理 1、培养基是人工配置的用于培养、分离、鉴定和保存各种微生物的营养基质。也适合微生物在生命活动中积累各种代谢产物。由于微生物种类不同,营养类型各异以及实验目的不同,因此培养基的种类也很多。不同微生物对营养的要求不同,在配置时根据微生物对PH 的要求选择合适的PH。由于本次实验主要是分离纯化酵母菌,所以配置的培养基是适合酵母菌生长麦芽汁平板培养基,同时添加抗生素抑制霉菌及其它菌的生长。 2、接种和培养过程中必须保证不被其它微生物所污染,关键在于严格进行正确的无菌操作,但是绝对无菌是不可能的,只能人工创造相对无菌的环境。所以本次实验无菌操作是在超净工作台的酒精灯火焰旁进行。 3、把特定微生物从混杂的微生物群体中分离出来而获得某一种或某一株微生物的过程叫微生物的分离与纯化。首先根据其生长特性设计只利于此菌生长的条件,再根据各种稀释法使他们在固体培养基上单独长成菌落。分离纯化的方法通常有:稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法和平板划线。此次实验采用梯度稀释涂布平板法。 4、微生物检测项目最常用的是细胞数的检测,方法比较多,主要有显微镜直接计数法、平板菌落计数法(CFU)、光电比浊计数法等。本次实验设计酵母菌的数量检测,选用显微镜直接计数法和平板菌落计数法。 实验器材 仪器设备 恒温水浴锅、电热干燥箱、蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、恒温摇床、水浴锅、电炉、铜锅、酒精灯、接种环、电子天平、研钵、光学显微镜、血细胞计数器 玻璃器皿 烧杯、锥形瓶、大小试管、培养皿、漏斗、三角涂棒、吸管、试管架、玻璃涂棒、盖玻片 试剂与材料 苹果、大麦芽、琼脂、蒸馏水、碘液、抗生素、染色液 其它 纱布、滤纸 ?实验内容及操作步骤 (一)、样品的选择 酵母菌一般在果园的土壤中或者水果的表面含量较多,因此选择苹果为样品。 (二)、样品的处理 制备苹果悬液 1.首先将1g苹果在研钵中磨细,放入装有10ml生理盐水和玻璃珠的100ml三角瓶中去。

植物体内可溶性糖和可溶性蛋白含量的测定

植物体内可溶性糖和可溶性蛋白含量的测定 摘要:目的通过标准曲线的绘制,测定白菜、芹菜、菠菜中可溶性蛋白和可溶性糖的含量,了解可溶性糖和可溶性蛋白的测定方法。方法分别用蒽酮法和考马斯亮蓝染色法来测定植物体内可溶性糖和可溶性蛋白的含量。结论 关键词:白菜;芹菜;菠菜;可溶性蛋白含量;可溶性糖含量;蒽酮法;考马斯亮蓝染色法 1 引言 植物体内的可溶性糖和可溶性蛋白含量是重要的生理生化指标。 在作物的碳素营养中,作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。它们在营养中的作用主要有:合成纤维素组成细胞壁;转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等;分解产物是其他许多有机物合成的原料,如糖在呼吸过程中形成的有机酸,可作为NH 3 的受体而转化为氨基酸;糖类作为呼吸基质,为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。由于碳水化合物具有这些重要的作用,所以是营养中最基本的物质,也是需要量最多的一类。 可溶性蛋白是植物体内氮素存在的主要形式,其含量的多少与植物的代谢和衰老有密切的关系,同时它与植物体维持渗透压抗脱水也有很大关系。 白菜是十字花科芸薹属叶用蔬菜,味道鲜美可口,营养丰富,素有“菜中之王”的美称,为广大群众所喜爱。芹菜属伞形科植物,富含蛋白质、碳水化合物、胡萝卜素、B族维生素、钙、磷、铁、钠等,同时,具有有平肝清热,祛风利湿,清肠利便、润肺止咳、降低血压、健脑镇静的功效。菠菜藜科一年生草本植物,菠菜含有丰富的维他命A、维他命C及矿物质,它对各种贫血症和糖尿病、肺结核、高血压、风火赤眼等诸多疾病可起辅助治疗作用。 2 材料与方法 2.1 植物体内可溶性糖含量的测定 2.1.1材料 新鲜的白菜、芹菜、菠菜叶片(剪碎后各取0.5—1.0g) 2.1.2试剂 葡萄糖标准溶液(200ug/ml)、蒽酮试剂 2.1.3仪器设备 分光光度计;分析天平;恒温水浴;试管;三角瓶;移液管;剪刀;玻璃棒;滤纸;研钵 2.1.4测定方法 样品中可溶性糖的提取:称取剪碎混匀的新鲜样品0.5 ~1.0 g (或干样粉5~100 mg ),放入大试管中,加入15 ml 蒸馏水,在沸水浴中煮沸20 min,取出冷却,过滤入100 ml 容量瓶中,用蒸馏水冲洗残渣数次,定容至刻度。 标准曲线制作:取6 支大试管,从0~5分别编号,按下表加入各试剂。 试剂管号 0 1 2 3 4 5 200ug/ml葡萄糖标准溶液(ml)0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蒽酮试剂(ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 葡萄糖量(ug)0 20 40 60 80 100

植物体内可溶性糖含量的测定

植物体内可溶性糖含量的测定(蒽酮法) 糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一,也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。不同载培条件,不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中糖类的含量。因此对水果、蔬菜中可溶性糖的测定,可以了解和鉴定水果、 蔬菜品质的高低。 一、目的: 糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一,也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。不同载培条件,不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中糖类的含量。因此对水果、蔬菜中可溶性糖的测定,可以了解和鉴定水果、蔬菜品质的高低。 二、原理 糖类遇浓硫酸脱水生成糖醛或其衍生物,反应如下: 糠醛或羟甲基糠醛进一步与蒽酮试剂缩合产生蓝绿色物质,其在可见光区620nm波长处有最大吸收,且其光吸收值在一定范围内与糖的含量成正比关系。 此法可用于单糖、寡糖和多糖的含量测定,并具有灵敏度高,简便快捷,适用于微量样品的测定等优点。 三、实验材料、仪器及试剂 1.材料:植物组织叶片 2.仪器:分光光度计恒温水箱20ml具塞刻度试管(3支)漏斗100ml 容量瓶刻度试管试管架剪刀研钵

3.试剂: (1)200μg/ml标准葡萄糖:AR级葡萄糖100mg,蒸馏水溶解,定容至500ml。 (2)蒽酮试剂:1g蒽酮,用乙酸乙酯溶解,定容至50ml,棕色瓶避光处贮藏; (3)浓硫酸 四、实验方法 1.葡萄糖标准曲线的制作 取6支20ml具寒试管,编号,按下表数据配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。 在每管中均加入0.5ml蒽酮试剂,再缓慢地加入5ml浓H2SO4,摇匀后,打开试管塞,置沸水浴中煮沸10分钟,取出冷却至室温,在620nm波长下比色,测各管溶液的光密度值(O D),以标准葡萄糖含量为横坐标,光密度值为纵坐标,作出标准曲线。 2.样品中可溶性糖的提取 称取1克叶片,剪碎,置于研钵中,加入少量蒸馏水,研磨成匀浆,然后转入20ml刻度试管中,用10ml蒸馏水分次洗涤研钵,洗液一并转入刻度试管中。置沸水浴中加盖煮沸10分钟,冷却后过滤,滤液收集于100ml容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,摇匀备用。3.糖含量测定 用移液管吸收1ml提取液于20ml具塞刻度试管中,加1ml水和0.5ml蒽酮试剂。再缓慢加入5ml浓H2SO4(注意:浓硫酸遇水会产生大量的热!),盖上试管塞后,轻轻摇匀,再置沸水浴中10分钟(比色空白用2ml蒸馏水与0.5ml蒽酮试剂混合,并一同于沸水浴保温10分钟)。冷却至室温后,在波长620nm下比色,记录光密度值。查标准曲线上得知对应的葡萄糖含量(μg)。

植物组织中可溶性糖含量的测定

植物组织中可溶性糖含量的测定 碳素营养中,作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。它们在营养中的作用主要有:合成纤维素组成细胞壁;转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等;分解产物是其他许多有机物合成的原料,如糖 在呼吸过程中形成的有机酸,可作为 NH 3 的受体而转化为氨基酸;糖类作为呼吸基质,为作 物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。由于碳水化合物具有这些重要的作用, 所以是营养中最基本的物质,也是需要量最多的一类。 Ⅰ蒽酮法测定可溶性糖 一、原理 糖在浓硫酸作用下,可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛,生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮 反应生成蓝绿色糠醛衍生物,在一定范围内,颜色的深浅与糖的含量成正比,故可用于糖的定 量测定。 该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物,不但可以测定戊糖与己糖含量,而且可以测所 有寡糖类和多糖类,其中包括淀粉、纤维素等(因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖 而发生反应),所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量,实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物 总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下,用蒽酮法可以一次测出总量,省去许多 麻烦,因此,有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时,则应注意切勿将样品的未溶 解残渣加入反应液中,不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加 了测定误差。此外,不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同,果糖显色最深,葡萄糖次之,半 乳糖、甘露糖较浅,五碳糖显色更浅,故测定糖的混合物时,常因不同糖类的比例不同造成误 差,但测定单一糖类时,则可避免此种误差。 糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为 620 nm ,故在此波长下进行比色。 二、实验材料、试剂与仪器设备 (一)实验材料 任何植物鲜样或干样。 (二)试剂 1. 80 %乙醇。 2. 葡萄糖标准溶液( 100 μg/mL ):准确称取 100 mg 分析纯无水葡萄糖,溶于蒸馏水并 定容至 100 mL ,使用时再稀释 10 倍( 100 μg/mL )。 3 .蒽酮试剂:称取 1.0 g 蒽酮,溶于 80% 浓硫酸(将 98% 浓硫酸稀释,把浓硫酸缓缓加 入到蒸馏水中) 1000 mL 中,冷却至室温,贮于具塞棕色瓶内,冰箱保存,可使用 2 ~ 3 周。 (三)仪器设备 分光光度计,分析天平,离心管,离心机,恒温水浴,试管,三角瓶,移液管( 5 、 1 、 0.5 mL ),剪刀,瓷盘,玻棒,水浴锅,电炉,漏斗,滤纸。 三、实验步骤 1. 样品中可溶性糖的提取称取剪碎混匀的新鲜样品 0.5 ~ 1.0 g (或干样粉末 5 ~ 100 mg ),放入大试管中,加入 15 mL 蒸馏水,在沸水浴中煮沸 20 min ,取出冷却,过滤入 100 mL 容量瓶中,用蒸馏水冲洗残渣数次,定容至刻度。 2. 标准曲线制作取 6 支大试管,从 0 ~ 5 分别编号,按表 24-1 加入各试剂。 表 24-1 蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量

酵母菌的培养与分离

. . . 微生物学大实验 实验指导 编者: 生物技术教研室 2007.3

目录 实验一酵母菌的培养与分离‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥2 实验二酵母菌的鉴定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥7 实验三酵母菌耐受能力的测定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥19 实验四酵母菌发酵工艺条件的优化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥22 实验五耐高温酵母菌株的诱变选育‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥24 实验六酿酒酵母细胞固定化与酒精发酵‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥27

耐高温酒精酵母菌的选育及发酵条件的研究 实验一酵母菌的培养与分离 一、实验目的 学习培养和分离酵母菌的技术和方法 二、基本原理 大多数酵母菌为腐生,其生活最适pH为4.5-6,常见于含糖分较高的环境中,例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生长迅速,易于分离培养,在液体培养基中,酵母菌比霉菌生长得快。 利用酵母菌喜欢酸性环境的特点,常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液(这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长),然后在固体培养基上用划线法分离之。 三、实验主要内容和要求 (一)本次实验的方案由同学们自己制定,实验包括: 1.马铃薯葡萄糖培养基, 乳酸马铃薯葡萄糖培养液的配制。 2.菌株的筛选,根据一定的生产目的并从特定的样品筛选出高产酒精的适宜的酵母菌株。 3.酵母菌的分离,要求接种一次, 28-30℃,培养24小时,转接一次,28-30℃,培养24小时,并用镜检的方法独立判定所分离菌株是否为酵母菌。 4.用划线分离法对酵母菌进行纯化,要求每组挑取单个菌落,连续划线分离4代,镜下为单一纯菌株,每组扩繁10支斜面菌种,备用。 四、实验的准备 1、甘蔗、成熟葡萄或苹果等果皮、0.1%美蓝染液、1ml的无菌吸管、无菌培养皿等。 2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基: 原料:马铃薯(200克)、葡萄糖(20克)、琼脂(15-20克)、蒸馏水(1000ml)。 配制方法: (1)先将马铃薯去皮,切片,称200克并加蒸馏水1000ml,煮沸半小时,用纱布过滤,补足蒸馏水量至1000ml ,制成20%的马铃薯汁。 (2)在20%的马铃薯汁中加入琼脂,煮沸溶化,补足水分并在115℃条件下高压灭菌20分种。 (3)加入葡萄糖,制成培养酵母菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。

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