MALDI_TOFMS和电子光谱_省略_铁蛋白亚基电离和释放铁动力学特性_黄琳

MALDI_TOFMS和电子光谱_省略_铁蛋白亚基电离和释放铁动力学特性_黄琳
MALDI_TOFMS和电子光谱_省略_铁蛋白亚基电离和释放铁动力学特性_黄琳

MALDI -TOF M S 和电子光谱技术研究

海兔肝铁蛋白亚基电离和释放铁动力学特性

黄琳1 陈旭1 林青1 朱斌琳1 黄河清*1,2

(厦门大学生命科学学院细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室1;

化学化工学院固体表面物理化学国家重点实验室,化学生物学福建省重点实验室2,厦门361005)

摘 要 选用肽质量指纹谱(pepti de m ass fi ngerpr i nt ,P M F )技术鉴定质谱纯海兔肝铁蛋白(liver ferriti n o f

A p l y sia ,ALF )。来源于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(M ALD I -TO F M S)仪中的激光和基质芥子酸协

同解吸海兔肝铁蛋白(ALF )为带双电荷、单电荷[M +H ]+和二聚体的亚基离子,并可供质谱分析。ALF 亚基

的质荷比m /z 分别为9784.03[M +2H ]2+、19678.42[M +H ]+和39387.80[2M +H ]+,其中亚基分子量

[M +H ]+略小于鲨鱼肝铁蛋白(li ve r ferriti n o f shark ,SLF )。在弱碱介质(p H 8.0)条件下,电子光谱技术研

究指出,抗坏血酸以1/2级反应方式参与ALF 释放铁全过程,同时又使ALF 以一级反应动力学方式释放铁,

呈现两种不同的速率。推测这一异常现象可能与ALF 含低铁量、亚基调节能力和海兔的进化地位有关。

关键词 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱,亚基解离,释放铁,动力学,进化

2007-04-18收稿;2007-08-01接受

本文系国家自然科学基金(N o .30470372)、福建省高校创新团队培育计划、厦门大学预研基金(No .xdkjcx20051006)资助

E-m ai:l h qhuang @x m u https://www.360docs.net/doc/7a6493237.html,

1 引 言

在自然界中,多数动植物及微生物机体中均存在着一种高效维持体内铁平衡的蛋白质,简称铁蛋白(ferriti n )[1,2]。铁蛋白分子结构由蛋白壳、铁核和电子隧道组成,其中蛋白壳由24个亚基组成,并表现

出高对称性亚基结构特点[3,4]。电子显微镜和电泳技术揭示了多数哺乳动物铁蛋白蛋白壳由H 和L 类

型亚基组成,其中H 亚基主要参与是负责铁的矿化和铁核晶体形成,而L 亚基是提供酸性残基以促进或加速铁的成核作用[5~7]。细菌铁蛋白、SLF 和由基因克隆表达的铁蛋白均由单类型亚基组成。由单类型亚基组成的铁蛋白必须同时承担铁储存与释放的功能,类似于哺乳动物铁蛋白H 和L 亚基的生理

功能,但其调控机理尚未清楚[8,9]。由于多数哺乳动物铁蛋白的H (19kD a)、L (21kDa)亚基和SLF 、细

菌铁蛋白单类型亚基(20kDa)的分子量很接近,使低分辨率的电泳技术难以高效分离铁蛋白亚基类型,从而得出同一种类的铁蛋白,不同亚基类型的实验结果。目前,对不同来源于的铁蛋白亚基组成、结构与功能的论点仍有争论[8,9]

。有关铁蛋白亚基之间的协调作用与执行生理功能的研究并不多,其主要原因在于缺乏研究铁蛋白亚基及亚基外表层电荷分布规律的有效分析技术。如何选用与拓展高效分析技术,并适合测定铁蛋白H 和L 亚基组成、分布与结构,对科学地阐明铁蛋白亚基的结构与功能至关重要,但相关研究进展缓慢。有关海兔或其它软体动物肝脏铁蛋白的结构与功能研究尚未见详细报道。

海兔(Ap lysia )归属于腹足纲软体动物,它是开展分子神经生物学研究的经典模式之一[10]。本实验

采用MALD I -TOFM S 和电子光谱技术研究海兔肝铁蛋白(ALF)解吸成亚基离子的能力和释放铁动力学规律,其目的是想了解在弱酸和弱碱介质中,激光和基质协同解吸由多亚基组成蛋白质成为亚基离子的可能性,铁蛋白释放铁的动力学规律以及这些规律与动物进化地位的联系,同时也为阐明低等动物肝脏在进行铁代谢途径和机理提供科学依据。2 实验部分

2.1 仪器、试剂与材料

提取铁蛋白所需要的肝脏均取材于活鲨鱼。分离介质二乙基氨基乙基纤维素(DE AE )-52购置于第35卷

2007年12月 分析化学(FENX I HUAXU E) 研究报告Ch i nese Journa l o f Ana l y ti ca l Chem istry 第12期1745~1750

1746分析化学第35卷

华美公司。牛血清白蛋白均购置于Sangon公司。三羟甲基氨基甲烷(Tris)等有机与无机常规试剂均选用国产产品,纯度为96%~99%。采用美国B io-Red公司生产的蛋白质分离纯化系统制备铁蛋白,监测波长280nm。

2.2粗ALF的制备

新鲜海兔肝脏,去除脂肪组织后,以湿重1B1.5的比例加入蒸馏水。采用组织捣碎机高速捣碎鲨鱼肝成为匀浆(约15m i n左右),随后,将匀浆液置于恒温(70~75e)水浴锅内热变性处理20m in,使非耐热杂蛋白变性。匀浆液置于4e冷柜冷却后,以12000r/m in高速离心30m i n,取上清液,弃去沉淀物。按每100mL上清液加入35g(NH4)2SO4的比例,加入(NH4)2SO4于所收集的上清液,使铁蛋白产生沉淀,并置于4e冰箱过夜,促使铁蛋白缓慢地析出,并形成晶体。取出ALF晶体混合物,以15000r/m i n,离心30m i n,弃上清液,收集棕色沉淀物。用0.025m ol/L T ris-H C l缓冲液(pH7.25)溶解棕色沉淀物,并置于透析袋内,用蒸馏水透析过夜,除去(NH4)2SO4和其它杂盐。取透析液,以12000r/m i n离心20m in,弃杂蛋白,收集上清液备用。此时,上清液中的蛋白浓度约为2.6g/L。

2.3脱盐和电泳制备ALF

Sephadex G-25层析介质经预处理后,装柱(32c m@1.7c m),并用0.025m o l/L Tris-HC l缓冲液(p H7.25)平衡。粗ALF再次经Sephadex G-25层析柱进一步除盐。采用PAGE技术分离粗ALF样品,并采用铁染法[8]和对比法剥离出ALF凝胶蛋白带,最后采用电洗脱技术分离电泳纯ALF,供实验所需。2.4元素分析

铁蛋白浓度采用改良的Lo w ry方法测定。标准蛋白浓度的配制选用99%的牛血清蛋白。ALF中P和Fe含量分别采用磷铋钼蓝法和原子吸收分光光度法测定[9]。

2.5基质配制和质谱分析

0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液和30%乙腈(CAN)按7B1体积比混合成溶液。根据实验要求加入饱和的芥子酸(SA)于混合溶液中,超声波处理5m i n,并离心(5000r/m in)5m i n,收集上清液,即为饱和基质溶液。样品和饱和基质溶液按1B1体积比混合后,取0.8L L混合物直接点滴在MALDI-TOF质谱仪专用样品靶上,待样品自然干燥后,将样品靶直接放入质谱仪的靶箱内,进行样品分析[11]。选用配置脉冲氮激光(337n m)离子源的MALDI-TOF质谱仪,采用线性模型分析,在加速电压控制在25kV等条件下,每一测定样品随机选择20~25个不同的点(如待测样品有检测出质谱峰,则累积检测到质谱峰的30个点,每个点激发25次),平均激光脉冲次数在120次,相对激光强度恒定为50%,采用标准的牛血清白蛋白外标法标定质谱峰位[11]。

2.6电子光谱技术研究ALF释放铁动力学

参考文献[8]和[12]电子光谱技术,研究铁蛋白释放铁动力学的技术和方法。选用张凤章等[13]已建立的铁蛋白释放铁的动力学方程式进行分析、计算和改良,建立更加科学的动力学方程式。

3结果与讨论

3.1肽质量指纹谱技术鉴定ALF

采用上述铁蛋白制备技术对海兔肝进行分离、提取、纯化,所获得铁蛋白样品经PAGE分离后显示出单条层析带。SDS-PAGE实验结果显示,经PAGE纯化后的ALF样品同样也呈现单一的蛋白带,这说明了ALF由单类型亚基组成,它的亚基类型与由单类型亚基组成的SLF和细菌铁蛋白很相似,但明显不同于由H和L亚基类型组成的哺乳动物铁蛋白[5,14]。P MF技术可作为鉴定蛋白质种类的有效手段之一。为了进一步证实已获得电泳蛋白质样品是否为ALF,本实验选用本课题组编写的r ubhish peak killer(RPK)分析软件,可直接删去图1中胰酶自降解产物和基质等所形成的干扰质谱峰,并筛选出ALF亚基酶解产物所对应的肽质谱峰,从而提高鉴定ALF的可信度,这项分析技术同样也适合于鉴定其它蛋白质。参考图1测定结果和RP K软件提供的数据,选用MASCOT检索网站中的S W I SS-PORT、M SDB和NCB r n数据库进行检索与比对。经检索和分析后,发现ALF与鸡和鼠的铁蛋白H亚基一级结

构具有60%的同源性。由于目前国际各大数据库中鸡和鼠的铁蛋白H 亚基一级结构来自它们各自的c DNA 序列直接翻译而成的蛋白质一级结构,与其真实的一级结构存在着一定的差异,导致P M F 分析技术和数据库比对法鉴定蛋白质过程中所获得覆盖率数据偏低。尽管鉴定ALF 只能获得60%覆盖率,但仍然可认为ALF 与鸡和鼠的铁蛋白H 亚基具有较高同源性论点的可靠性。

3.2 ALF 亚基质谱特性

近期研究指出:SLF 由单类型亚基组成[14]。在基质芥子酸辅助下,来源于质谱仪激光器的激光能

解离SLF 成为亚基[M +]和亚基聚合体离子,并可被飞行时间质量分析器所检测,其亚基的m /z 分别为

10611.07、21066.52、41993.16和63555.64,即认为亚基分子结构分别为[M +2H ]

2+,[M +H ]+,[2M +H ]+和[3M +H ]+[14],但相关亚基解离成分子离子的机理尚未清楚。实验采用SDS -PAGE

研究 图1 ALF 质量肽指纹谱的质谱分析

F i g .1 M S ana lysis o f pepti de mass fi ng erpr i nti ng i n liver

ferr iti n of aplysia (ALF

) 图2 ALF 亚基质谱图F i g .2 M ass spectru m of subunit in ALF

发现了ALF 由单类型亚基组成,其亚基分子量约为19kD a 。图2是ALF 亚基质谱图,图中显示出3个

质谱峰,其m /z 分别为9784.03([M +2H ]2+)、19678.42([M +H ]+)和39387.80([2M +H ]+),亚基

聚合态的类型数目和所对应的m /z 均明显低于SLF,即ALF 和它亚基分子量均低于SLF 。实验选用PAGE 方法证实这一论点。不同来源铁蛋白之间的亚基聚合态的类型数目不同与亚基之间外表层的疏水键之间的相互作用强度不同有关。可参与疏水键数目越多,所形成的聚合态数目也多。这一现象也反映出SLF 和ALF 亚基之间的一级结构存在较为明显的差异。

在p H 2.0条件下,脱铁核铁蛋白蛋白壳能解离成游离的亚基,并随着pH 值递增,游离的亚基可重新组装成脱铁核铁蛋白

[15]。采用类似方式,铁蛋白可通过亚基解离途径直接捕获各类有机小分子及药物[5,15]。根据前人的研究报道和图2实验结果,拟出MALD I -TOF M S 测定铁蛋白亚基的示意图,

并阐明 图3 激光和基质解吸ALF 成亚基离子过程F ig .3 G enerati ng process of subun it i on by lase r and m atr i x desorpti on in ALF

其机理,具体如图3所示。

根据图3和前人的研究结果[12,14],作者提出MALD I -

TOF M S 引起ALF 亚基解离且形成分子离子途径的观点,

具体如下:(1)基质芥子酸和TFA 提供酸性微环境,削弱

ALF 亚基之间的相互作用力,在有机溶剂乙腈促进下,ALF

处于易解离成亚基的状态;(2)由于带有铁离子的蛋白质

可能比其它蛋白质更易接受激光能量的特性[16]

,基质辅助提高激光解吸/电离多肽离子化率和绝对强度,使ALF 亚基之间的相互作用强度进一步降低;(3)由于在解吸亚基离子且供飞行时间质谱仪质量分析器检测之前,ALF 部分

亚基出现去折叠现象。此时增强了已解离后的亚基之间的疏水基团相互作用强度,并形成亚基二聚体或形成双电荷单亚基类型,因而可获得图2结果,显示出[M +2H ]2+、[M +H ]+和[2M +H ]+亚基分子结构式。为了证实上述论点科学性,比较在弱酸和弱碱性介质下,ALF 释放铁的动力学过程与规律,拟进一步了解ALF 亚基之间的稳定性、柔性调节能力和形成亚基离子的可能性,为更加科学地阐明图21747第12期黄琳等:MA LD I -TOF M S 和电子光谱技术研究海兔肝铁蛋白亚基电离和释放铁动力学特性

实验结果和图3模型提供实验证据。

3.3在弱碱介质下,ALF释放铁的动力学

抗坏血酸(维生素C)(-11.0mV,相对于标准氢电极电位,下同)和N a2S2O4均是双电子供体,其中抗坏血酸的氧化还原电位高于铁蛋白(-245.0mV)[17]。从表观数据推测,抗坏血酸不可能作为电子供体参与铁蛋白进行释放铁反应,但图4是以抗坏血酸为电子供体,在弱碱介质中(p H8.0),ALF释放铁的动力学全过程。ALF含铁量约为530Fe3+/ALF,明显低于绝大多数由H和L亚基类型组成的哺乳动物铁蛋白含铁量(约为2400Fe3+/ALF),但与细菌铁蛋白含铁量较为相似[18]。推测这一现象与高、低等动物之间在进行铁代谢过程中所需求的铁量和供铁速率需求有关。同时反映出由单、双类型亚基组成的铁蛋白储存铁的能力与数量不同。不同类型的亚基执行着不同的生理功能,但由单类型亚基结构组成的铁蛋白,其亚基必须起着多种生理功能的作用,否则它无法同时承担储存和释放铁的重要生理功能。参考文献[19],可认为A c A-dipyri d yl螯合铁蛋白铁核中的Fe2+速率远远大于还原剂还原Fe3+为Fe2+的速率。此时,铁蛋白释放铁的限制性步骤应该是还原剂参与还原铁核中Fe3+组分的速率,即考虑铁蛋白铁核中未释放铁的含量,而不是考虑已释放铁的含量。这一认定方式不同于通常酶催化动力学的计算式。早期所建立的释放铁动力学方程(C m ax-C t)1/2=k T m ax-T t[20],其中(C max-C t)1/2计算模式主要考虑在单位时间内(T t)还未释放的铁组分,而不是考虑已释放的铁组分(C t)。所以,对已建立铁蛋白释放铁的动力学方程式应修正为(C max-C t)1/2=kT t更为合理。由于抗坏血酸的分子尺寸明显大于铁蛋白的物质交换隧道宽度(0.3~0.4nm),因而抗坏血酸只能借用络合铁蛋白途径改变蛋白壳构象,提高蛋白壳的氧化还原电位,向铁蛋白提供电子,并供铁的还原与释放。把图4结果代入(C max-C t)1/2=k T t方程后作图,可获得图5结果,显示线性对应关系。这一实验现象说明了在弱碱介

质(pH8.0)下,用抗坏血酸以1/2级方式参与铁还原与释放(图5),抗坏血酸还原ALF

铁核中的铁组

图4以抗坏血酸为电子供体,ALF释放铁的动力学全过程(p H8.0)

F i g.4Co m plete process of iron re lease reduced w ith as-co rb i c ac i d as e lectron ic donor from the ALF at p H8.

0图5根据图4结果代入动力学方程(C

m ax

-C

t

)1/2=

kT

t

作图

F i g.5R esu lts shown i n F i g.6we re obta i ned by a k i neti c

equation(C

m ax

-C

t

)1/2=k T

t

accordi ng to F i g.4results C ma x:铁蛋白释放铁最大量(the m ax i m um num bers of i ron rel ease)。C t和T t:在单位时间内(T t)内,铁蛋白释放的铁量(C t and T t:the nu m bers of iron release(C t)accord i ng to d es i re reacti ve ti m e)。

成全过程中未发生差异速率现象。进一步实验表

明,作者拟在弱碱介质中,采用MALDI-TOF M S技

术测定ALF亚基的m/z,但均未获得成功。显然在

弱碱介质下,ALF亚基分子结构由柔性转变为刚性

结构,亚基之间的相互作用强度增加。激光和基质均无法直接解吸ALF且形成亚基分子离子,供质谱分析。ALF亚基稳定性在弱碱介质中高于在弱酸介质中。ALF易被激光解吸成亚基离子,可能与铁蛋白复杂的亚基结构体系和在弱酸介质中呈现出不稳定现象有关。

3.4在弱碱介质下,ALF异常释放铁过程

作者前期的研究结果已报道,如把铁蛋白释放铁全过程代入(C max-C t)1/2=k T t方程,并获得(C max-C t)1/2与T t的线性对应关系。以l g(C m ax-C t)以与T t作图,同样也能获得线性对应关系。这一现象说明了还原剂Na2S2O4或抗坏血酸均以1/2级动力学途径参与铁还原与释放,而铁蛋白自身释放1748分析化学第35卷

图6 根据图4结果代入动力学方程lg(C m ax -C t )1/2=kT t 作图F ig .6 R esults sho w n i n F i g .4w ere obta i ned by a k i netic equa ti on lg (C m ax -C t )1/2=kT t accord -ing to F i g .4results C m ax :C t 和T t :在单位时间内(T t )内,铁蛋白释放的铁量;C m ax :铁蛋白释放铁最大量(the m ax i m um num-bers of iron release);C t and T t :the num bers of i ron release (C t )accord i ng t o desire reacti ve ti m e(T t )。

铁的全过程却遵循一级反应动力学(Fe 3+转化成Fe 2+)。

根据图4结果,并以l g (C max -C t )与T t 作图,获得图6A 、B

结果,说明了ALF 释放铁全过程表现出非线性对应关系,

并呈现出两种不同释放铁的速率,其速率转折点约为

42m in ,但均遵循一级反应动力学规律。如果以lg C t 与T t

作图,可获得图6C 结果,其释放铁动力学曲线变化趋势相

似于图4结果;不遵循一级反应动力学规律,呈混合级动

力学过程。比较由H 和L 亚基类型组成的哺乳动物铁蛋

白和由单类型亚基组成的细菌铁蛋白释放铁动力学过程和

规律,ALF 表现出异常的释放铁现象。海兔属于低等软体

动物,从进化地位考虑,它高于细菌,但低于哺乳动物地位,

也许是海兔在动物界中归属于对储存和释放铁过程中具有

特殊需求的途径的动物之一,使ALF 释放铁动力学过程兼

有细菌和哺乳动物铁蛋白特性。铁蛋白释放铁动力学特性

是否也可作为评判生物进化地位或时代等指标还有待于进

一步研究,但它对拓展生物分析化学应用领域将有一定的

促进作用,并具有重要的科学意义和价值。

3.5 小结

(1)P AGE 、SDS -P AGE 和MALD I -TOF M S 等分析技术证实了ALF 由单类型的亚基组成,其亚基分子量为19678.42Da([M +H ]+);(2)酸性介质(例如:酸性基质)削弱ALF 亚基之间相互作用强度,协助来源于MALDI -TOF M S 的激光解吸ALF 成为亚基离子。在弱碱介质条件,ALF 亚基之间的相互作用强度增强,此时难于直接测定ALF 亚基。提出MALDI -TOF MS 解吸ALF 成亚基离子,并可供质谱分析的简易模型图。ALF 亚基之间的相互作用强度与介质的酸碱度有关;(3)选用释放铁动力学技术研究在弱酸弱碱条件下,ALF 释放铁的动力学及规律,提出抗坏血酸以1/2级反应方式参与ALF 释放铁全过程同时,又使ALF 以一级反应动力学方式释放铁,并呈现两种不同的速率,提出这一异常现象可能与ALF 含低铁量、亚基调节能力和海兔的进化地位有关的观点,所获得的动力学参数能更加科学合理地阐明选用MALDI -TOF MS 技术分析高分子量ALF(约为440kDa)的亚基理化特性和释放与储存铁的机理。R eferences

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D esorpti on/Ionization of Subunit and K i netics of Iron R elease R eveal ed

w ith M atrix-assisted Laser D esorpti on Ion i zati on-T i m e of Fli ght

M ass Spectro m etry and E lectronic Spectru m i n L iver Ferriti n of Ap lysi a

Huang L i n1,Chen X u1,L i n Q ing1,Zhu B i n-L in1,Huang H e-Q i ng*1,2

(K ey Laboratory of theM i nistry of Education for Cell B io l ogy and T u m or Cell E ngineer i ng,School of L i fe Sciences1;

S t a teK e y Laboratory of Physical Che m istry of Soli d Surface,T he K ey Laboratory of Che m ical B io l ogy

of Fujian Province2,X ia m en Universit y,X ia m en361005)

Abst ract Liver ferritin of Ap lysia(ALF)w ith purity o fm ass spectro m etry has been i d entified by a techno l o-gy o f pepti d e m ass fi n ger pri n.t Both lasers co m i n g fro m the MALD I-TOF M S and m atrix sinap ic acid together deco m posed ALF i n to m o lecular i o n o f the subun it for M S analysis,sho w ing three mo lecular ions such as si n g le subun it w ith doub le[M+2H]2+and si n g le[M+H]+charges,and di m er i c subun itw ith si n g le char ge [2M+H]+.The ratio of m ass to charge(m/z)of these i o ns is divided to be9784.03、19678.42and 39387180,respecti v e l y.The m o lecular w e i g ht of ALF w as so m e what little t h an that o f li v er ferritin in shar k (SLF).In w eaken basic m ed i u m(p H8.0),t h e exper i m enta l resu lts used w ith e lectron spectra l techno logy sho w ed that ascorb ic ac i d,as a1/2order reaction,reduced the w ho le iron co mponentw ith i n the ferr itin core for releasing,wh ich resulted i n ALF released the iron as firs-t order la w rat h er than ha l-f order la w,sho w ing t w o different rates of iron re l e ase.The results suggested that these nove l pheno m ena be tightl y connected w ith the lo w ir on content and the capac ities o f subunit regulation i n ALF,and w ith evo l u tion leve.l

K eywords M atrix-assisted laser desorption i o nization-ti m e of fli g ht m ass spectr um(MALD I-TOF M S), subunit desorption,iron release,k i n etics,evolution

(Recei ved18April2007;accep t ed1Augus t2007)

实验报告 小麦种子储藏蛋白

实验二小麦种子储藏蛋白─HMW-GS的分离 (SDS-PAGE) 一、实验目的 利用SDS─聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)研究小麦种子储藏蛋白,高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)组成结构。此外SDS-PAGE也是测量蛋白质亚基分子质量常用的方法。通过本实验,掌握SDS-PAGE的基本原理、技术以及应用。 二、实验原理 用十二烷基硫酸钠(SDS)和还原剂(巯基乙醇或二硫苏糖醇)热处理蛋白质样品,蛋白质中的二硫键被还原,解离的亚基与SDS发生定量结合后使蛋白质亚基带上大量负电荷,从而掩盖了蛋白质各亚基原有的电荷差异。亚基的构象均呈长椭圆棒状,各各种蛋白质亚基-SDS复合物表现出相等的电荷密度,在电场中迁移速度仅与亚基分子质量有关。因此,SDS-PAGE可用来分离蛋白质亚基并测定其蛋白质亚基的分子质量。 三、材料与仪器 1、仪器 电泳仪、垂直板电泳槽、台式高速离心机、脱色摇床、加样枪、50ml烧杯2个、移液管。 2、试剂和材料 70%乙醇、50%正乙醇、样品提取缓冲液、样品提取液、30%丙烯酰胺+甲叉双丙烯酰胺、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、10%SDS、10%过硫酸铵、TEMED、电极缓冲液、染色液、漂洗液。 四、实验步骤 1、样品的提取 [1] 分别取4粒小麦种子研碎,加入70%乙醇1000ul,10min后,1200转离心8min,弃乙醇晾干。 [2] 加50%正丙醇(含2%β-巯基乙醇)250ul混匀后,50℃水浴1.5h,中途

振荡,1200转离心8min。 [3] 取上清液加满丙酮置于-20℃中3h。 [4] 1200转离心8min,倒掉丙酮晾干,加样品提取液250ul、待溶解完全后,煮沸3分钟,取上清液点样。 2、SDS-PAGE分析 [1] 组装电泳槽(略)。 [2] 凝胶制备 取两只50ml干净的烧杯,按下表1加样。在组装好的电泳槽中先制备分离胶,待分离胶聚合后,倒掉乙醇容易,再灌浓缩胶,灌好浓缩胶后迅速插入样品梳静止聚合。 表1 凝胶制备试剂配方 聚丙烯酰胺凝胶配方分离胶浓缩胶 30%Acr-Bis(ul) 2.5 0.62 pH8.8Tris-Hcl(ul) 2 ─ pH6.8Tris-Hcl(ul) ─ 1.3 H2O(ul) 2.95 3.0 1%AP(ml) 100 75 [3] 加样及电泳 待凝胶完全聚合后,拔掉电泳梳子。然后将电泳槽注满电极缓冲液。取适量上清液加样。为了比较蛋白质条带的效果,将4个小麦品种的样品,分别按照2.5ul和5ul两种不同剂量加入。此外,电泳装置上接负极,下接正极,恒流20mA,待溴酚蓝走出分离胶30min后停止电泳,取出玻璃板,剥胶染色。 [4] 染色 剥下的胶用蒸馏水洗涤后加入染色液,盖上盖子,放入微波炉中低温染色3min,每隔一分钟取出振荡。 [5] 脱色 将染色液倒回瓶内,加入漂洗液至背景无色为止,照相保存。 五、结果与分析 本次实验没有加入标准蛋白质,无法计算相对迁移率。实验结果见下图。

临床生化检验部分复习试题a

临床生化检验部分复习试题 一、选择题(最佳答案) 1、下列说法正确的是 ⑴、高密度脂蛋白胆固醇是好胆固醇,⑵、氧化酶法测定血清胆固醇所用比色波长为340纳米,⑶、低密度脂蛋白胆固醇是好胆固醇,⑷、反映心肌损伤时肌红蛋白比肌钙蛋白特异性强,⑸、心肌肌酶谱中的CK增高就一定是心肌炎。(1) 2、下列说法错误的是(2) ⑴各种炎症时都伴有CRP增高,⑵、超敏CRP增高是动脉硬化的直接原因,⑶、超敏CRP增高是动脉硬化的病人出现心梗的标志,⑷、超敏CRP增高是冠心病人出现心梗的危险标志,⑸、CRP和超敏CRP本质是一样的。(2) 3、高密度脂蛋中含量最高的载脂蛋白是(1) ⑴、载脂蛋白A,⑵、载脂蛋白B,⑶、载脂蛋白C,⑷、载脂蛋白D,⑸、载脂蛋白E。 4、低密度脂蛋白中含量最高的载脂蛋白是(2) ⑴、载脂蛋白A,⑵、载脂蛋白B,⑶、载脂蛋白C,⑷、载脂蛋白D,⑸载脂蛋白E。 5、急性胰腺炎时血清淀粉酶增高峰值多在(5) ⑴、发病后2小时,⑵、发病后6~8小时,⑶、发病后9~10小时,⑷、发病后5~7小时,⑸、发病后12~24小时。 6、下列说法错误的是(1) ⑴、胰腺癌患者血清淀粉酶一定升高,⑵、暴饮是急性胰腺炎诱发因素之一,⑶、胰腺癌的病人CA199有可能增高,⑷、腮腺炎的病人血清淀粉酶升高,⑸、CEA升高可能为胃癌。 7、反映红细胞膜异常的试验是(1) ⑴、红细胞渗透脆性试验,⑵、酸洗脱试验,⑶、高铁血红蛋白还原试验,⑷、血红蛋白电泳,⑸、网织红细胞计数。 8、反映红细胞膜内酶缺泛的试验是(3) ⑴、红细胞渗透脆性试验,⑵、酸洗脱试验,⑶、高铁血红蛋白还原试验,⑷、血红蛋白电泳,⑸、网织红细胞计数。 9、反映红细胞血红蛋白结构异常试验是(4) ⑴、红细胞渗透脆性试验,⑵、酸洗脱试验,⑶、高铁血红蛋白还原试验,⑷、血红蛋白电泳,⑸、网织红细胞计数。 10、反映红细胞破坏加速首选的试验是(5) ⑴、红细胞渗透脆性试验,⑵、酸洗脱试验⑶、高铁血红蛋白还原试验,⑷、血红蛋白电泳, ⑸、网织红细胞计数。 11、VMA是(2) ⑴、肾上腺素的代谢产物,⑵、去甲肾上腺素的代谢产物,⑶、多巴胺的代谢产物,⑷、盐皮质激素的代谢产物,⑸、糖皮质激素的代谢产物。 12、醛固酮是(2) ⑴、肾上腺髓质产生,⑵、肾上腺皮质产生,⑶、甲状腺产生,⑷、甲状旁腺产生,⑸、肾上腺产生。 12、下列说法错误的是(5) ⑴、尿HCG增高;早期妊娠,⑵、尿HCG增高;异位妊娠,⑶、血HCG增高可能为肺癌, ⑷、血HCG异常高可能为葡萄胎,⑸、尿HCG增高可能为子宫癌。 13、低钾的病人常伴有(2)

健康评估 溶血性贫血实验室检查

一、红细胞破坏过多的检查 1.外周血液常规红细胞计数、血红蛋白含量减低,血涂片中可见破碎红细胞、异形红细胞等。出现 典型的异形红细胞或自身凝集现象时,可提供溶血原因的线索。 2.血浆游离血红蛋白测定意义正常血浆只有微量游离血红蛋白,>40mg/L是溶血尤其是血管内溶血 的重要指标,如阵发性睡眠血红蛋白尿、血型不合输血反应等。血管外溶血,如遗传性球形细胞增多症,一般不增高。 3.血清结合珠蛋白测定(Hp)意义 1.血清结合珠蛋白降低见于: ⑴各种溶血性贫血,包括血管内或血管外溶血; ⑵肝细胞损害、传染性单核细胞增多症、先天性无结合珠蛋白血症等。 2.血清结合珠蛋白增高见于感染、组织损伤、肝外阻塞性黄疸、恶性肿瘤等。 4.血浆高铁血红素白蛋白试验意义本试验有助于鉴别血管内或血管外溶血,阳性表示严重血管内溶 血。如阵发性睡眠性血红蛋白尿时,出现一条高铁血红素白蛋白区带,而球形细胞增多症系血管外溶血则无此区带。 5.尿液检查 ⑴尿胆原排出增多; ⑵隐血试验阳性,这是因为当血浆游离血红蛋白显著增高,超过结合珠蛋白的量和肾小管再吸收 功能时,出现的血红蛋白尿; ⑶尿含铁血黄素试验呈阳性反应,是反映慢性溶血,尤其是血管内溶血。 6.红细胞寿命测定是检测溶血的可靠指标,常用51Cr、3P-DFP或二异丙基氟磷酸标记红细胞法, 能反映红细胞寿命的指数。此项测定显示红细胞寿命缩短表明有溶血。 二、红细胞代偿性增生的检查 1.网织红细胞增多在5%~20%以上。 2.外周血出现幼红细胞,主要是晚幼红细胞。由于网织红细胞及幼红细胞的出现,故可表现大红细 胞增多。 3.骨髓幼红细胞显著增生,以中幼红和晚幼红细胞增生为主,粒红比例常发生倒置。 三、红细胞膜缺陷的检查 1.红细胞渗透脆性试验意义 1. 红细胞渗透脆性增高见于:遗传性球形细胞增多症、自身免疫性溶血性贫血伴继发球形细胞增 多等。 2.红细胞渗透脆性减低见于:缺铁性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血等。 2.红细胞孵育渗透脆性试验意义本试验对轻型遗传性球形细胞增多症的检出敏感,也见于丙酮酸激 酶缺乏症等酶缺陷的溶血性贫血。 3.自身溶血试验及纠正试验意义 1. 遗传性球形细胞增多症,在低渗盐水中溶血显著增强,加葡萄糖后溶血明显纠正,加ATP后溶 血明显纠正。 2. 先天性非球形细胞溶血性贫血Ⅰ型(G-6-PD缺乏症),低渗盐水中正常或溶血稍增强,加葡 萄糖后溶血部分纠正,加ATP后溶血部分纠正。

金属离子与蛋白质的相互作用

金属离子与血清白蛋白的相互作用 一、实验目的: 测定过渡金属离子对蛋白质功能的影响 二、实验原理: 金属离子在许多生命过程中发挥关键作用,研究金属离子与蛋白质的结合作用是生命科学的重要内容,是化学和生命科学研究的前沿领域。血清白蛋白是哺乳动物血浆中含量最丰富的蛋白质,它能够储存和转运众多的内源性和外源性物质。由于血清白蛋白在生理上的重要性和易于分离、提纯,从上世纪50年度(国内80年代末)开始,人们对血清白蛋白与金属离子(和药物分子等)的相互作用展开了大量研究,以期在分子水平上揭示相关生命过程的奥秘。 许多蛋白质含有金属离子,金属离子对蛋白质发挥生物学功能起着关键性的作用。在人体基因组编码的蛋白质中,超过30%的蛋白质含有一个或多个金属离子;所有酶中,超过40%的蛋白质含有金属离子,它们在生命活动过程中发挥着各样的生物学功能。许多人类的疾病与金属离子-蛋白质的异常相互作用相关。 目前用于研究金属离子与蛋白质相互作用的研究方法主要有:(1)紫外-可见吸收光谱法;(2)荧光光谱法;(3)平衡透析法;(4)毛细管电泳法;(5)电泳法等。 (一)紫外-可见光谱法 蛋白质通常有3个明显不同的紫外吸收带:(1)210nm以下的吸收来自肽键的吸收以及许多构象因素;(2)210-250nm为芳香族和其他残基的吸收、某些氢键的吸收、与其他构象和螺旋相关的相互作用等多种因素;(3)250-290nm附近为芳香族的残基,其中酪氨酸残基在278nm(Tyr,260-290nm)附近有强吸收,色氨酸残基(Trp)在290nm附近有强吸收,而苯丙氨酸(Phe,250-260nm)的吸收较弱。外界因素如溶剂极性以及pH等会影响吸收光谱。 当金属离子与蛋白质结合时,蛋白质或金属离子吸收光谱的强度或者谱带位置会发生变化,可分为两种情况:(1)蛋白质微扰的金属离子光谱变化,可以推断金属离子的配位环境;(2)金属离子微扰的蛋白质光谱变化,可以推断生色基微环境及蛋白质结构的变化。通过对光谱的比较分析和计算,可以推断金属离子与蛋白质的结合情况。若蛋白质的吸收峰增强,则可认为小分子进入蛋白质的疏

实验诊断学习题-贫血溶血性贫血

贫血、溶血性贫血 1.在诊断遗传性球形细胞增多症时,最没必要做的检测是D A.红细胞渗透脆性试验 B.红细胞渗透脆性孵育试验 C.自身溶血试验及纠正试验 D.氰化物-抗坏血酸试验 E.酸化甘油溶血试验 2、下列有配伍正确的是E A.自身免疫性溶血性贫血——Ham 试验阳性可确诊 B.遗传性球形细胞增多症——冷热溶血试验阳性 C.PNH——蔗糖溶血试验阳性可确诊D.G6PD缺陷症——高铁血红蛋白还原试验还原率增高 E.PK缺陷症——自身溶血试验溶血不能被葡萄糖纠正 3、下列用于诊断红细胞膜缺陷性溶血的指标中,何项除外E A.自身溶血试验及纠正试验 B.红细胞渗透脆性试验 C.红细胞孵育渗透脆性试验 D.酸化甘油溶血试验 E.冷热溶血试验 4、典型的缺铁性贫血属于D A.大细胞性贫血 B.正细胞正色素性贫血 C.单纯小细胞性贫血 D.小细胞低色素性贫血 E.大细胞低色素性贫血 5、女性,18岁,Hb80g/L,属于C A.正常 B.轻度贫血 C.中度贫血 D.重度贫血 E.极重度贫血 6、血管内溶血的特征不包括A A.血清结合珠蛋白升高B.尿胆原升高 C.血清游离血红蛋白明显升高 D.间接胆红素明显升高 E.高铁血红素白蛋白复合物出现 7、下列不属于遗传性红细胞内在缺陷的疾病是 D A.G6PD缺陷症 B.α-珠蛋白生成障碍性贫血 C.遗传性椭圆形红细胞增多症 D.PNH E.异常血红蛋白病 8、贫血的Bessman分型是按照以下何项指标进行的B A.MCV、MCH和MCHC B.MCV和RDW C.MCH和RDW D.MCHC和RDW E.Hct和MCV 9、营养性巨幼细胞贫血属于A A.大细胞性贫血 B.正细胞正色素性贫血 C.单纯小细胞性贫血 D.小细胞低色素性贫血 E.小细胞高色素性贫血 10、判断是否贫血,应该看以下何项指标C A.MCV、MCH和MCHC B.Hct和RDW C.RBC、Hb和Hct D.RBC、WBC和BPC E.网织红细胞数和Hb 11.RDW是A A.红细胞容积分布宽度 B.红细胞比容 C.平均红细胞体积 D.平均红细胞血红蛋白含量 E.平均红细胞血红蛋白浓度 12、判断贫血严重程度的指标是B A.RBC

血红蛋白

血红蛋白是血细胞的重要组成部分,它负责将氧气从肺部输送到身体的其它组织。血红蛋白在任一时刻所含的氧气量被称为血氧饱和度(即SpO2)。 血氧饱和度是反映人体呼吸功能及氧含量是否正常的重要生理参数,它是显示我们人体各组织是否健康的一个重要生理参数。严重缺氧会直接导窒息、休克、死亡等悲剧的发生。 在肺部,氧气附着在受红细胞约束的蛋白质上,称为血色素(符号Hb),血液中的血色素有两种形态:氧合血红蛋白(HbO2)和还原血红蛋白(Hb),则 血氧饱和度SpO2=(HbO2x100)/(HbO2+Hb)x100% 血氧仪的测试原理是:氧合血红蛋白和还原血红蛋白在可见光和接近红外线的频谱范围内具有不同的吸收特性,还原血红蛋白吸收较多的红色频率光线,吸收较少的红外频率光线;而氧合血红蛋白吸收较少的红色频率光线,吸收较多的红外频率光线。这个区别是SpO2测量系统的最基本依据。 为测量人体对红光和红外光线的吸收。红色和红外线发光二极管位置相互靠得尽可能近,发射的光线可透过人体内的单组织点。先由响应红色和红外光线的单个光电二极管接收光线,然后由互阻放大器产生正比于接收光强的电压。红色和红外LED通常采用时间复用的方式,因此相互间不会干扰。环境光线经估计将从每个红色和红外光线中扣除。测量点包括手指、脚趾和耳垂。 脉搏血氧仪提供了以无创方式测量血氧饱和度或动脉血红蛋白饱和度的方法。脉搏血氧仪的工作原理基于动脉搏动期间光吸收量的变化。分别位于可见红光光谱(660纳米)和红外光谱(940纳米)的两个光源交替照射被测试区(一般为指尖或耳垂)。在这些脉动期间所吸收的光量与血液中的氧含量有关。微处理器计算所吸收的这两种光谱的比率,并将结果与存在存储器里的饱和度数值表进行比较,从而得出血氧饱和度。 典型的血氧仪传感器有一对LED,它们通过病人身体的半透明部位(通常是指尖或耳垂)正对着一个光电二极管。其中一个LED是红光的,波长为660nm;另一个是红外线的,波长是940nm。血氧的百分比是根据测量这两个具有不同吸收率的波长的光通过身体后计算出的。

玉米贮藏蛋白质的提取及亚基电泳分析

玉米贮藏蛋白质的提取及亚基电泳分析 李艳1,郝建平1,郑亚军2,王将2(1.山西农业大学农学院,山西太谷030801;2.山西农业大学食品学院,山西太谷030801) 摘要采用SD S-PAG E,浓缩胶浓度为5%,分离胶浓度为12%,对2种新品种玉米———强盛49和奥玉3101的贮藏蛋白亚基进行了电泳分析,并对组成2种玉米贮藏蛋白的各亚基的分子量和含量进行了分析。结果表明,分离胶浓度为12%的电泳图谱最佳。2种玉米蛋白的亚基组成相同,都含有14个亚基,二者分子量分布范围也接近,但是亚基含量差别较大,尤其是亚基13差别最为显著。在玉米蛋白的亚基组成中,以低分子量亚基为主,玉米蛋白亚基分子质量范围约为1.0×104~8.0×104D a。 关键词玉米贮藏蛋白亚基;SD S-P AG E;组成;分子量 中图分类号O658.9文献标识码 A 文章编号0517-6611(2007)115-04626-02 A n a ly s is o f th e M a iz e S to rag e P ro te in Subu n its w ith SD S-PAGE LI Y an e t a l(C o lle ge o f A gr icu ltu re,S h an x i A g ricu ltu re U n ive rs ity,T a igu,S h an x i030801) A b s tra c t T h e expe r i m en t in th e i n v es tiga tion o f tw o k i n ds o f m a ize’s sto rag e pro te in subu n its w ith sod iumdodecy l su lph a te-po ly acrlam ide ge l e lec-troph ore sis(SD S-PAG E)w a s con du cted.T h e re su lts sh ow ed th a t th e re so lv i n g e ffe ct o f m a ize’s sto rag e p ro te in subu n its cou ld be gre a tly a ffe cted by th e con cen tra tion s ch an g e o f re so lv in g ge l.A n d th e go od re so lv in g e ffe ct o f a l m on d s to rage p ro te in subu n its cou ld be ob ta in ed w h enth e re so lv in g g e l con cen tra-tion w a s12%.F u rth e rm o re,th e re su lts sh ow edth a t th e tw o k i n ds o f m a ize s con ta in ed14subu n its an d th e m o lecu la r w e igh t o f m a ize’s s tora ge p ro te in su b-u n its w e re abou t1.0×104~8.0×104D a.T h e percen t o f13th su bu n it is ve ry diffe ren t i n Q ian g sh en g49and A oyu3101. K e y w o rd s M a ize sto rage p ro te in su bu n its;SD S-P AG E;C om pon en t;M o lecu la r am ou n t 植物贮藏蛋白亚基的构成对蛋白的功能性和营养特性影响较大[1],即玉米蛋白亚基的组成和含量直接影响玉米品质。因此,对玉米贮藏蛋白亚基进行凝胶电泳分离、鉴别和分析,在玉米的资源筛选、加工利用和鉴定品种真实性、检测品种纯度上尤显重要。SD S-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)在蛋白质的量化、比较及特性鉴定中是一种经济、快速、重复性好的方法[2]。笔者采用SD S-PAG E法,对2个玉米品种进行了亚基分析,以期为玉米的品种纯度检测和加工利用等研究提供参考。 1材料与方法 1.1 试验材料以玉米品种强盛49和奥玉3101为试材。1.2 试验方法 1.2.1 脱脂玉米的制备。将玉米籽粒粉碎后过60目筛,所得玉米粉末与乙醚按1∶20的比例混合,4℃水浴中磁力搅拌8h,弃取上清液,保留玉米粉。3次重复,最后将脱脂玉米粉风干,-20℃保存。 1.2.2 玉米贮藏蛋白质的提取。将脱脂玉米粉与pH值8.0的磷酸盐缓冲液按料液比1∶20混合,4℃水浴中磁力搅拌提取8h后,4000r/m in离心15m in,弃去沉淀(不溶性糖类和杂质),收集上清液,用0.1m ol/L H C l调上清液pH至4.5,使蛋白质在等电点沉淀后,再次磁力搅拌15m in,在12000r/m in 下,离心20m in,将离心所得沉淀用蒸馏水洗涤5~6次,收集沉淀,真空冷冻干燥即得玉米贮藏蛋白。 1.2.3 玉米贮藏蛋白的电泳检测方法。 1.2.3.1 电泳贮存液的配制。①丙烯酰胺溶液。将29.2g 丙烯酰胺和0.8g N,N′-甲叉双丙烯酰胺溶解在50m l双蒸水中,定容至100m l,移入棕色瓶中4℃保存;②浓缩胶缓冲液。将12.11g T r is溶解于100m l双蒸水中,加入10%S DS溶液8 m l,用浓盐酸调pH至6.8,定容至200m l,4℃保存;③分离胶缓冲液。将90.83g T r is溶解于200m l双蒸水中,加入10% 基金项目山西省科技攻关项目(2006031041)。 作者简介李艳(1980-),女,山西榆社人,硕士研究生,研究方向:作物栽培与耕作学。 收稿日期2007-02-08SD S溶液20m l,用浓盐酸调pH至8.8,定容至500m l,4℃保存;④电极缓冲液。将3.03g T ris,14.41g甘氨酸,1g SD S溶解于双蒸水中,定容于1000m l,4℃保存;⑤样品缓冲液。 0.5m o l/L T ris-H C l pH6.8,2.0m l;20%丙三醇,2.0m l;20% SD S,2.0m l;0.1%(W/V)溴酚蓝,0.5m l;β-巯基乙醇,1.0m l;以上溶液混合后加蒸馏水2.5m l;⑥10%过硫酸铵。1g过硫酸铵加10m l双蒸水(新鲜配制);⑦10%TEM ED。0.1m l TEM ED加0.9m l双蒸水(新鲜配制)。 1.2.3.2 凝胶浓度的计算。凝胶浓度用T和C来表示。T 是2个单体(丙烯酰胺和N,N′-甲叉双丙烯酰胺)的总百分浓度,C是与浓度有关的交联百分度。 T(%)=[A cr(g)+B is(g)]/V(m l)×100%,C=B is(g)/ [A cr(g)+B is(g)]×100% 式中:A cr(g)为丙烯酰胺的克数,B is(g)为N,N′-甲叉双丙烯酰胺的克数,V(m l)为溶液的终浓度。 1.2.3.3 蛋白质亚基迁移率的计算。蛋白质的相对迁移率R f是用每条蛋白带的迁移距离(分离胶与浓缩胶分界线至带中心位置的距离)除以溴酚蓝前沿的迁移距离得到的,即:R f=蛋白带迁移距离/溴酚蓝迁移距离。 1.2.3.4 玉米贮藏蛋白的S DS-PAGE方法。将玉米蛋白溶液浓度标定至1m g/m l,与样品缓冲液按1∶1的比例混合,100℃煮沸5m in,上样20μl,恒压电泳(浓缩胶100V,分离胶150 V),当溴酚蓝指示剂距胶底部5m m时,停止电泳,剥下胶片后,将胶片放入固定液中固定2h,然后考马斯亮蓝R-250染色,过夜,放入脱色液中脱色,直至胶片背景蓝色完全透明状,数码照相,分析。 1.2.3.5 玉米贮藏蛋白亚基分析。用天能凝胶成像系统软件分析系统分析电泳图谱。 2结果与分析 2.1 玉米贮藏蛋白电泳的最佳分离胶浓度的选择 2.1.1 不同胶浓度的配制(表1)。SD S-PAGE全部采用5%浓缩胶,分离胶浓度采用10%、12%、1 3.5%、14%、15%共5个水平,对比其电泳图谱和蛋白质迁移率,以图谱清晰、差异 安徽农业科学,J ou rn a l o f A n hu i A g r i.S c i.2007,35(15):4626-4627责任编辑罗芸责任校对李洪

血红蛋白尿(专业知识值得参考借鉴)

本文极具参考价值,如若有用请打赏支持我们!不胜感激! 血红蛋白尿(专业知识值得参考借鉴) 一概述血红蛋白尿(hemoglobinuria)指尿中含有游离血红蛋白而无红细胞,或仅有少许红细胞而含有大量游离血红蛋白的现象。反映了血管内有超出正常的溶血。由于尿中血红蛋白含量不等尿色可以呈红色、浓茶色,严重时呈酱油色。患者因疾病病因不同可表现不同症状,如阵发性睡眠性血红蛋白尿患者的血红蛋白尿容易清晨第一次尿出现。蚕豆病有进食蚕豆史或在蚕豆开花季节发生。溶血严重时常伴贫血、黄疸,肝、脾大。根据引起血红蛋白尿的原发疾病,针对病因进行治疗。二病因及常见疾病1.尿路中溶血 若尿相对密度低于1.006,则红细胞在尿中溶解,尿色呈红色称假性血红蛋白尿。 2.肾梗塞 在梗塞区域产生溶血,此种血红蛋白尿的特点是血中与珠蛋白结合的血红蛋白和游离的血红蛋白均属正常,和血管内溶血引起真正血红蛋白尿容易区别。 3.血管内溶血 是血红蛋白尿最重要最常见的原因,具体如下: (1)红细胞先天缺陷所致的溶血性贫血。 (2)血型不合:输血反应。 (3)细菌感染:见于败血症、感染性细菌性心内膜炎;原虫感染常见恶性疟疾,此病又称黑尿热。(4)药物和化学制剂所致溶血:如奎宁、奎尼丁、氯丙嗪、非那西汀等药物。化学制剂及重金属盐类常见苯肼、硝基苯、苯胺、砷、砷化氢,铅等。 (5)动植物因素引起血管内溶血:见于毒蛇咬伤,毒蕈中毒。 三检查实验室检查对确定溶血性贫血的存在和原因有决定性价值,根据临床最大可能地进行相应的特殊试验,如酸溶血、热溶血、冷溶血以及红细胞震荡试验等,以便确定具体疾病的诊断。红细胞脆性试验可作为初步检查。血常规除贫血外,网织红细胞增加是特点,周围血象出现幼稚红细胞,骨髓检查红系列增生活跃,而粒系列、巨核系列正常。 四鉴别诊断1.阵发性睡眠性血红蛋白尿 是一种获得性红细胞内在缺陷慢性溶血性贫血。血红蛋白尿(酱油样尿)的发生直接与睡眠有关(不止限于夜间睡眠)。酸溶血试验阳性(Ham试验)有确诊意义。卢斯试验阳性(ROuS试验)尿沉渣

血红蛋白含量测定

血红蛋白含量测定 发表时间:2011-04-27T15:02:00.683Z 来源:《中外健康文摘》2011年第2期供稿作者:马骅1 刘海虹2 [导读] 血红蛋白测定方法很多,如比色法、比重法、血氧法、血铁法等,国际血液学标准化委员会推荐氰化高铁血红蛋白为首选测定法。马骅1 刘海虹2 (1黑龙江省临床检验中心 150008)(2中国造血干细胞捐献者资料库黑龙江省管理中心 150008) 【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2011)2-0049-02 【关键词】血红蛋白生理检测 血红蛋白是由珠蛋白和亚铁血红素组成的结合蛋白质。每个血红蛋白分子有4条多肽链,每条折叠的多肽链中,包裹1个亚铁血红素。亚铁血红素由原卟啉和1个铁原子组成。血红蛋白分子量为64 458D。 (一)血红蛋白生理 每分子血红蛋白中的4个亚铁血红素含有4个Fe2+原子,可结合4个氧分子。因此,64 458 g血红蛋白,含铁4×55.84,可结合4×22.14 L氧,即每克血红蛋白含铁3.47 mg(即铁占0.347%),可结合氧1.38 ml。 血红蛋白除能与氧结合形成氧合血红蛋白(HbO2)外,尚能与某些物质作用形成多种血红蛋白衍生物。它们具有特定的色泽和吸收光谱,在临床上,可用以诊断某些变性血红蛋白血症或做血红蛋白的定量测定。 (二)氰化高铁血红蛋白测定法 血红蛋白测定方法很多,如比色法、比重法、血氧法、血铁法等,国际血液学标准化委员会推荐氰化高铁血红蛋白为首选测定法。现就氰化高铁血红蛋白(HiCN)法介绍如下: 1.原理血红蛋白被高铁氰化钾氧化为高铁血红蛋白,新生或的高铁血红蛋白再与氰结合成稳定的棕红色的氰化高铁血红蛋白(HiCN),在规定的波长和液层厚度条件下,具有一定的吸光系数,根据吸光度,可求得血红蛋白浓度。 2.方法取HiCN转化液5ml,加末梢血20μl,混匀后静置5分钟,用光径1.0 cm,波长540 nm的分光光度计测定吸光度OD(以水或稀释液调“0”),求得每升血液中血红蛋白含量。 (三)血红蛋白测定的质量控制 血红蛋白测定的质量控制除了所用量器必须事先校准外(允许误差,5 ml吸管为2.5%,血红蛋白吸管为1%),还要进行下面几项质量控制。 1.多仪器的线性校正取50 g/L、100 g/L、150 g/L、200 g/L的HiCN标准参考液,在λ540 nm测出其A值(以HiCN转化液为空白),标准状态下其值应分别为0.135、0.271、0.407、0.543,如测定值与理论值不符合。 日常工作中测得的A值×367.7×K=Hbg/L或者将一血红蛋白含量较高的样品,分别稀释成1/4、1/2、3/4和原液四个梯度进行线性校正,仪器在200 g/L范围内应有良好线性,重复性试验 CV应≤2%。 2.比色皿的光径和透光度标准比色皿的光径和透光度应符合下述标准:光径1 cm的比色皿误差应<0.005 cm。 3.质控物的应用用来校准仪器和控制实验准确度的制品称为参考品;用于控制实验精密度的制品称为质控品(物)。 4.质控要求手工操作OCV≤3%,RCV≤6%,EQA DI≤2。 (四)红细胞计数和血红蛋白测定的临床意义 通常情况下,单位容积血液中红细胞数量与血红蛋白量大致呈平行的相对应关系。健康成人的红细胞数与血红蛋白量的比例约为100:3,故两者测定的意义大致相同。但在某些情况下,特别是在红细胞内血红蛋白浓度发生改变的贫血时,两者的减少程度往往不一致。如小细胞低色素性贫血时,血红蛋白的降低程度较红细胞明显,大细胞性贫血时,红细胞数量减少程度比血红蛋白下降程度明显,因此同时对患者的红细胞和血红蛋白量进行比较,对诊断就更有意义。 1.红细胞及血红蛋白增多是指单位容积血液中红细胞数及血红蛋白量高于正常参考值高限。一般来讲,经多次检查,成年男性红细胞>6.0×1012/L,血红蛋白>170 g/L;成年女性红细胞>5.5×1012/L,血红蛋白>160 g/L时即认为红细胞血红蛋白增多。一般分为相对增多和绝对增多两类: (1)相对增多:指因血浆容量减少,造成红细胞数量相对增加。见于严重呕吐、腹泻、大量出汗、大面积烧伤、慢性肾上腺皮质功能减退、尿崩症、甲状腺功能亢进症危象、糖尿病酮症酸中毒等疾病。 (2)绝对增多:临床上称为红细胞增多症,是一种由多种原因引起红细胞增多的症候群。按发病原因可分为继发性和原发性两类。 ①继发性红细胞增多症:是一种非造血系统疾病,发病的主要原因是因为血液中促红细胞生成素增多。 ②原发性红细胞增多症:即真性红细胞增多症,是一种原因未明的以红细胞增多为主的骨髓增殖性疾病,目前认为是多功能造血干细胞受累所致。其特点是红细胞持续性显著增多,甚至可达(7~10)×1012/L,血红蛋白180~240g/L,全身总血容量也增加,白细胞和血小板也有不同程度增多。本病属慢性病和良性增生,但具有潜在恶性趋向,部分可转变为白血病。 2.红细胞及血红蛋白减少指单位容积循环血液中红细胞数、血红蛋白量都低于正常参考值低限,通常称为贫血。临床上根据血红蛋白减低的程度将贫血分为4级:①轻度:血红蛋白<参考值低限至90g/L;②中度,90~60g/L;③重度:60~30g/L;④极重度:<30g/L。参考文献 [1]刘兰廷,黄如衡.高铁血红蛋白简易测定法[J];军事医学科学院院刊;1986年03期. [2]陈耀强,王婧,万家义,谢均.血红蛋白的分子结构及与其载氧功能相关的药物研究进展[J];绵阳师范学院学报;2004年05期. [3]沈高山,谷怀民,闫天秀,魏华江.亚硝酸钠和氧合血红蛋白反应的拉曼光谱[J];中国激光;2008年09期. [4]李清文,高宏,黄昊,王义明,冯军,罗国安.血红蛋白与NO分子间相互作用的电化学表征[J].高等学校化学学报;2001年08期.

生物化学重要术语

供学生使用的《生物化学》重要术语中英语对照 碳水化合物(carbohydrate) 单糖(monosaccharide) 寡糖(oligosaccharide) 多糖(polysaccharide) 醛糖(aldose) 酮糖(ketose) 蔗糖(sucrose) 乳糖(lactose) 麦芽糖(maltose) 纤维二糖(cellobiose) 多糖(polysaccharides) 淀粉(starch) 直链淀粉(amylose) 支链淀粉(amylopectin) 纤维素(cellulose) 半纤维素(hemicellulose) 糖原(glycogen) 几丁质(chitin) 糖胺聚糖(glycosaminolgycan) 脂类(lipids) 脂肪酸(fatty acid) 甘油三酯(glycerol triester) 亲水脂类(amphipathic lipids) 蜡(wax) 磷酸甘油脂(phosphoglyceride) 甘油磷脂(glycerophospholipid) 磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine) 磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine)磷脂酰丝氨酸(phoshatidylserine)磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI) 肌醇三磷酸(inositol-1,4,5-trisphosphate,IP3)二脂酰甘油(diacylglycerol,DAG) 磷脂酸(phosphatidic acid,PA) 磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2) 磷脂酶C(phospholipase C,PLC) 磷脂酶D(phospholipase D,PLD) 溶血磷脂(1ysophospholipid) 鞘磷脂(sphingomyelin) 神经酰胺(ceramide) 类固醇(steroids) 萜类(terpenes) 胆固醇(cholesterol) 麦角固醇(ergosterol) 蛋白质protein 简单蛋白质simple protein 氨基酸amino acid 结合蛋白质conjugated protein 多肽polypeptide 肽peptide 肽键peptide bond 介电常数dielectric constant 范德华力van der waals force 层析法chromatography 吸附层析法adsorption chromatography 分配系数partition or distribution confficient 活性肽active peptide 二硫键disulfide bond 兼性离子zwitterion 一级结构primary structure 疏水效应hydrophobic effect

溶血性贫血的实验室检查

溶血性贫血的实验室检查 一、红细胞破坏过多的检查 1. 外周血液常规红细胞计数、血红蛋白含量减低,血涂片中可见破碎红细胞、异形红细胞等。出现典型的异形红细胞或自身凝集现象时,可提供溶血原因的线索。 2. 血浆游离血红蛋白测定意义正常血浆只有微量游离血红蛋白,>40mg/L是溶血尤其是血管内溶血的重要指标,如阵发性睡眠血红蛋白尿、血型不合输血反应等。血管外溶血,如遗传性球形细胞增多症,一般不增高。 3. 血清结合珠蛋白测定(Hp)意义 1. 血清结合珠蛋白降低见于: ⑴各种溶血性贫血,包括血管内或血管外溶血; ⑵肝细胞损害、传染性单核细胞增多症、先天性无结合珠蛋白血症等。 2. 血清结合珠蛋白增高见于感染、组织损伤、肝外阻塞性黄疸、恶性肿瘤等。 4. 血浆高铁血红素白蛋白试验意义本试验有助于鉴别血管内或血管外溶血,阳性表示严重血管内溶血。如阵发性睡眠性血红蛋白尿时,出现一条高铁血红素白蛋白区带,而球形细胞增多症系血管外溶血则无此区带。 5. 尿液检查 ⑴尿胆原排出增多; ⑵隐血试验阳性,这是因为当血浆游离血红蛋白显著增高,超过结合珠蛋白的量和肾小管再吸收功能时,出现的血红蛋白尿; ⑶尿含铁血黄素试验呈阳性反应,是反映慢性溶血,尤其是血管内溶血。 6. 红细胞寿命测定是检测溶血的可靠指标,常用51Cr、3P-DFP或二异丙基氟磷酸标记红细胞法,能反映红细胞寿命的指数。此项测定显示红细胞寿命缩短表明有溶血。 二、红细胞代偿性增生的检查 1. 网织红细胞增多在5%~20%以上。 2. 外周血出现幼红细胞,主要是晚幼红细胞。由于网织红细胞及幼红细胞的出现,故可表现大红细胞增多。 3. 骨髓幼红细胞显著增生,以中幼红和晚幼红细胞增生为主,粒红比例常发生倒置。 三、红细胞膜缺陷的检查 1. 红细胞渗透脆性试验意义

关于硫氧还蛋白系统在细胞死亡进程中的作用

关于硫氧还蛋白系统在细胞死亡进程中的作用 概论 意义:硫氧还蛋白(Trx)系统,包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,Trx还原酶(TrxR),Trx是维持细胞氧化还原平衡和抗氧化功能的关键,包括控制氧化应激和细胞死亡。最新进展:我们专注于研究Trx系统调控参与细胞凋亡。在哺乳动物细胞中,细胞内的Trx1和线粒体Trx2是主要的二硫化物还原酶为细胞增殖和发育提供电子和酶。减少/硫醇硫氧还结合凋亡信号调节激酶1 (ASK1 )并抑制其活性以防止应力和细胞因子诱导的细胞凋亡。当TRX被氧化,它将解离ASK1并且刺激凋亡。结合抑制Trx的相互作用蛋白(TXNIP )也有助于细胞凋亡的过程通过将ASK1上的TRX移除。TrxRs是一个大的同型二聚体硒蛋白,其整体结构类似于谷胱甘肽还原酶,TrxRs在C-末端还包含活性部位GCUG。关键问题和未来发展方向:在调节细胞死亡过程中TRX氧化还原状态和TrxR的活化是决定细胞命运的关键因素。在TrxRs的SEC的高反应性在反应位置使TrxR 的酶出现作用药物的靶点。通过共价修饰使TrxR失活不仅仅改变TRX的氧化还原状态和活化,而且也使TrxR转换成活性氧发生器。许多电子化合物,包括一些环境毒素和药品可抑制TrxR。这些化合物的分类,分为四种类型,并提出了一些有用的原则,以了解这些化合物对TrxR抑制的反应机理。 序言 蛋白巯基参与许多蛋白质的催化活性并在氧化反应下可能改变二硫化物。该硫醇- 二硫化物的变化可能会影响酶的活性,因此调节细胞功能。硫氧还蛋白(Trx),是一个12 kDa的硫醇蛋白,它从古菌和细菌到人进化上保守,它本身就是维持蛋白质硫醇/二硫化物动态平衡的一个关键因素。Trx与Trx还原酶(TrxR)结合,Trx可以提供电子从烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH )到关键的细胞蛋白的,因此它参与广泛的细胞功能(图1)。例如,最初发现的Trx由大肠杆菌核糖核苷酸还原酶(RNR )作为电子给体。普遍存在的RNR 催化的从头合成2 '- 脱氧核糖核苷酸其相应的核糖核苷酸和DNA复制和修复是必不可少的。RNR从脊椎动物到大肠杆菌都是有二聚体R1和R2亚基组成的复合物。R2亚基有一个稳定的酪氨酰自由基氧联的铁中心,这是催化反应所必须的。R1亚单位含有一个底物结合部位、一个变构部位、一个二硫醇的活性位点和两条穿梭在C-末端的巯基。在活性位点的二硫醇被转换为二硫化物后引起一个周期的催化反应,但是二硫醇经C-末端巯基通过硫醇-二硫化物交换后减少。相反,在C-末端的二硫化物减少是由Trx或谷氧还蛋白(GRX)。其他已知的TRX底物有广泛分布于各种亚细胞器的过氧还蛋白(Prxs)、Trx依赖的过氧化物酶。这使他们能够清除H2 O2和更具体的控制信号转导。甲硫氨酸- S -亚砜还原酶可以自身催化还原或蛋白结合蛋氨酸亚砜还原为蛋氨酸,它也是Trx的底物。Trx除了是一个二硫键还原酶,它还通过介导蛋白质S- 去亚硝基化参与调控细胞过程中。 Trxs基因在哺乳动物细胞死亡进展中的作用 哺乳动物Trx系统 胞质内Trx1和线粒体内Trx2存在于哺乳动物细胞中,包含有一个活性位点Trp-Cys-Gly-Pro-Cys,在一个表型Trx折叠结构(图2)。人类TRX1与105个氨基酸残基一起,三种结构的Cys残基的位置为62、69和73 ,除了Cys32和Cys35在活化位点。Cys62和Cys69位于Trx- S2 在氧化应激条件下可以形成第二个二 , 硫键(图2)。虽然这两个二硫键形成低表征Trx- S2,但不能直接通过TrxR被减

血红蛋白异常所致的贫血及其实验诊断题库1-1-8

血红蛋白异常所致的贫血及其实验诊断题 库1-1-8

问题: [单选,A2型题,A1A2型题]红细胞镰变形试验可用于诊断下列哪种疾病(). A.HbC B.HbE C.HbH D.HbS E.HbBarts 镰状细胞贫血是常染色体显性遗传疾病,HbS在脱氧状态下,互相聚集,形成多聚体。纤维状多聚体排列方向与细胞膜平行,并与之紧密接触,当有足够的多聚体形成时,红细胞即由双面凹盘状变成镰刀形,此过程称"镰变"。镰状细胞贫血红细胞镰变形试验阳性。

问题: [单选,A2型题,A1A2型题]HbBarts的组成是(). A.α2β2 B.α2γ2 C.α2δ2 D.γ4 E.δ4 HbBarts的组成是γ4。

问题: [单选,A2型题,A1A2型题]HbBarts见于下列哪种疾病(). A.HbC B.β珠蛋白生成障碍性贫血 C.α珠蛋白生成障碍性贫血 D.HbE E.HbS 珠蛋白基因缺失或基因缺陷导致一种或一种以上的珠蛋白肽链不能合成或合成不足,如α珠蛋白基因缺失,α链不能合成或合成不足,结果形成的HbH(β4)、HbBaIts(γ4)两种异常血红蛋白,都对氧有极高的亲和力,失去向组织释放氧的功能,而且极不稳定,易发生沉淀形成包涵体,导致溶血。(11选5 https://www.360docs.net/doc/7a6493237.html,)

问题: [单选,A2型题,A1A2型题]下列哪项不是溶血的实验诊断依据(). A.网织红细胞计数增高 B.骨髓红系增生明显活跃 C.间接胆红素升高 D.尿胆原增高 E.血清游离血红蛋白40mgL 溶血性贫血时血清游离血红蛋白增高(40mgL),血管内溶血明显升高,血管外溶血轻度增高。

溶血全套实验操作规程

溶血全套实验操作规程 一, 抗碱血红蛋白(HbF)测定 1.取抗凝血1-2ml, 用等渗盐水离心沉淀, 洗涤红细胞3-4次, 将洗涤后的红细胞按沉淀体 积加1.5倍蒸馏水和半量四氯碳, 用力震荡混合5-6分钟, 使红细胞完全溶解后离心20分钟, 上层即为100g/lHb液. 2.对照管: 100g/lHb液0.02ml, 再加5ml蒸馏水, 混匀. 3.测定管: 100g/lHb液0.1ml, 加入预温至25℃的0.083M的KOH1.6ml,同时开动秒表, 混匀数秒钟,至1min整,立即加入酸性半饱和硫酸铵溶液3.4ml,倒转混匀,过滤取上清夜。 4.分光光度计540nm,蒸馏水调零,分别测两管光密度。 HbF%=测定管光密度/(对照管光密度X5)X100 5.正常人1.0-3.1%,新生儿55-85%,一岁后接近正常人。 二,异丙醇试验 1ml7%异丙醇溶液,置有塞试管中,37℃水溶液预热数分钟后,加入0.1mlHb(10%)溶液,加塞混匀,计时观察,同时做正常对照。若放在37℃水溶液中,5min出现浑浊,40min 之内出现沉淀,则为阳性。 三,血浆游离血红蛋白测定 试剂(ml)标准管测定管空白管 1. 10g/L联苯胺0.5 0.5 0.5 2. 被检血浆(血清)——0.02 —— 3. 标准血红蛋白0.02 ———— 4.1%HO 0.5 0.5 0.5 5.10%醋酸液 5 5 5 (注:1-4试剂混合后,于室温下静置20min, 再加5试剂) 10min后,用比色剂(0.5cm)测定各管的光密度,波长530nm空白管为比色对照。结果按下列计算: 血浆游离Hb(mg/L)=测定管光密度/标准管光密度(0.025)X100) 正常值:〈40mg/L 四,高铁血红蛋白还原实验 1,静脉采血1.5-2mL,加入含有38g/L枸橼酸钠抗凝剂的小瓶内,再加葡萄糖20mg.血液与抗凝剂按9:1混合,亦可用ACD抗凝。 2,将此血标本离心沉淀5分钟(1000R/M),或置于4℃冰箱24小时,待红细胞下沉后,吸取部分血浆,使血液与血浆之比约为1:1(相当于红细胞压积30-40%) 3,摇匀后,取此血液1.0毫升,加12.5%g/l亚硝酸钠-葡萄糖溶液和0.0004mol/L美兰液各 0.05ml,颠倒混合15次,使与空气中的氧气充分接触,加塞,37℃水浴(孵箱)保温3 小时(血不足用半量)。 4,取出后摇匀,吸取此血液0.1 ml,加于10ml0.02mmol/L磷酸盐缓冲液中,2分钟后,634nm 处(或红色滤光板)比色,用蒸馏水做空白,测定其光密度为A。

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