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论述
第五章疫苗及其制备技术一、疫苗的概念疫苗：将病原微生物及其代谢产物，经人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的免疫制剂。一、疫苗组成
抗原佐剂防腐剂稳定剂
灭活剂缓冲液、盐类等非活性成分
抗原（antigen ，Ag ）能刺激机体产生免疫反应的物质，是疫苗最主要的有效活性成分
免疫原性（immunogenicity ）：刺激机体特异性免疫细胞，使其活化、增殖、分化并产生免疫效应物质（抗体和致敏淋巴细胞）
免疫反应性（immunoreactivity ）：与免疫效应物发生特异性结合而产生免疫反应
半抗原：有免疫反应性，缺乏免疫原性
佐剂（adjuvant ）
非特异性增强抗原免疫应答或改变免疫应答类型的物质。
要求：安全无毒、在非冷藏条件下稳定
作用机制：改变抗原的物理形状，延长抗原在机体内保留时间刺激单核巨噬细胞对抗原的递呈能力
刺激淋巴细胞分化，增加扩大免疫应答能力
防腐剂大多数的灭活疫苗都使用防腐剂目的：防止外来微生物的污染
常用：0.01％～0.02％硫柳汞2-苯氧乙醇氯仿
副作用：接触性皮炎、变应性结膜炎、耳毒性
稳定剂（保护剂）目的：防止生物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质，使其保持免疫原性冻干生物制品中除抗原物质以外的添加物
国产保护剂主要包括脱脂牛奶、明胶、蔗糖等，组方简单，保护能力弱，常称之为传统冻干保护剂
1.5%蔗糖(乳糖)脱脂乳保护剂
2.明胶蔗糖保护剂
3.聚乙烯吡咯烷酮乳糖保护剂
4.SPGA 保护剂
灭活剂
灭活病毒或细菌抗原的方法：物理方法（如加热、紫外线照射等）化学方法（丙酮、酚、甲醛等）对人体有一定毒害作用，因此在灭活抗原后必须及时从疫苗中除去，并经严格检定以保证疫苗的安全性。
灭活（inactivation ）：破坏微生物的生物学活性、繁殖能力和致病性，但不损害其免疫原性，用以制备灭活疫苗。
灭活方法：物理方法：加热、紫外线和射线照射
化学方法：化学试剂，如甲醛，β-丙内酯等。甲醛是最常用的灭活剂
灭活剂（inactivator ）：用于灭活微生物的化学试剂如甲醛溶液、烷化剂、苯酚、结晶紫、β-丙酰内脂等
疫苗作用原理
当机体经过口服或注射等途径接种疫苗后，其中的抗原分子刺激机体免疫系统产生高效价特异性的免疫保护物质
当机体再次接触到相同病原菌抗原时，免疫系统依循免疫记忆，迅速制造出保护物质来阻断病原菌的入侵，从而使机体获得针对病原体特异性的免疫力，使其免受侵害而获得保护。疫苗的类型与特点
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Q:979290924短信177********第五章疫苗及其制备技术唯一支付码
（一）减毒活疫苗（二）灭活疫苗（三）亚单位疫苗（四）联合疫苗（五）核酸疫苗（六）治疗性疫苗
（一）减毒活疫苗（live attenuated vaccine）
通过一定方法使病原体的致病性减弱或丧失后获得的由完整微生物组成的疫苗制品
特点：能引发机体感染但不发生临床症状，但其免疫原性可引发机体免疫反应，刺激机体产生特异性的记忆B细胞和记忆T细胞，起到获得长期或终生保护的作用
分为细菌性和病毒性活疫苗
优点：
接种次数少，一般只需接种1次
免疫效果好，免疫应答全面，可引起体液免疫、细胞免疫、黏膜免疫，
成本低廉，不需要佐剂，也不需浓缩纯化
缺点：
仍保留一定残余毒力，稳定性差，有毒力返祖现象
污染环境，可能滞留在环境中形成传染源
免疫缺陷者不能接种，可能诱发严重疾病
（二）灭活疫苗（inactivated vaccine）
将病原体经培养增殖、灭活、纯化处理后获得的保留病原体几乎全部组分的疫苗制品。
特点：失去了病原体的感染性，但保留了较强的免疫原性和较好的安全性
灭活疫苗优点：
不受循环抗体影响，即使已有抗体存在依然可以接种
在体内不能复制，免疫缺陷者也可接种
缺点：
需多次接种，免疫效果较差，只能引起体液免疫；
接种灭活疫苗产生的抗体滴度随着时间而下降，因此，一些
灭活疫苗需定期加强接种
（三）亚单位疫苗（subunit vaccine）
利用微生物的某种表面结构成分制成的能诱发机体产生抗体的疫苗制品。
分类：纯化亚单位疫苗：单个蛋白或寡糖组成（细菌脂多糖、病毒表面蛋白、去掉毒性的毒素），常与佐剂配合增强其免疫原性；
合成肽亚单位疫苗：抗病毒/肿瘤/细菌、寄生虫感染；
基因工程亚单位疫苗；
基因工程活载体疫苗基本概念：
活载体疫苗可以是非致病性微生物通过基因工程的方法使之表达某种特定病原物的抗原决定簇基因，产生免疫原性；也可以是致病性微生物通过基因工程的方法修饰或去掉毒性基因，但仍保持免疫原性。
活载体疫苗中抗原决定簇的构象与致病性病原体抗原的构象相同或者非常相似,活载体疫苗克服了常规疫苗的缺点,兼有死疫苗和活疫苗的优点,在免疫效力上很有优势
基因工程活载体疫苗特点：
可制备出不含感染性物质的亚单位疫苗、减毒疫苗、多价疫苗等
具有减毒活疫苗相似的特点，可模拟天然感染路径
可操作性强，可人为设计各种疫苗或基因治疗转载系统
可能产生毒力返祖与环境污染等潜在问题
（四）联合疫苗（combined vaccine）
两种或两种以上抗原物理混合后制成的疫苗制剂
多联疫苗（multi-combined vaccine）：预防不同病原微生物引起的传染病（例：百白破百日咳白喉破伤风）
多价疫苗（multivalent vaccine）：预防由同一病原微生物不同亚型引起的传染病（例：23价肺炎多糖疫苗）
具有减少接种次数和使用方便等优点，一针防多病
混合使用/同次使用也可进行联合免疫
酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA）
使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原-抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。
由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
ELISA用于检测特异性抗原和抗体
特点：快速、灵敏、简便、载体易于标准化等
双抗体夹心法：
将特异性抗体（一抗）与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质
加受检标本:使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原-抗体复合物。洗涤除去其他未结合的物质
加酶标抗体:使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体（二抗）结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关
加底物:夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量免疫印迹法（Western blotting）
根据抗原-抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法：经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的二抗起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分
具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术
常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析
结合化学发光检测可同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异
第六章酶工程制药
酶工程(enzyme engineering):
利用酶或细胞所具有的特异催化功能，或对酶进行修饰改造，并借助生物
反应器和工艺过程来生产人类所需要产品的一项技术。
酶工程是把酶学基本原理与化学工程技术以及基因重组技术有机结合而形成的新型应用技术。
酶工程特点：利用酶或含酶细胞作为生物催化剂完成重要的化学反应。
酶：细胞所产生的，受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂
与一般非生物催化剂相比，酶的特点：
酶易失活：凡能使生物大分子变性的因素都能使酶失去活性
酶具有很高的催化效率：酶催化反应速率比非催化反应速率高108-1020倍
酶具有高度专一性：酶对催化的反应和反应物有严格的选择性，被作用的反应物称为底物；酶往往只能催化一种或一类反应，作用于一种或一类物质；淀粉酶只能催化淀粉糖苷键的水解，蛋白酶只能催化蛋白质肽键的水解。
酶活性受到调节和控制：酶的浓度受到机体调节（诱导或抑制酶的合成，调节酶的降解）；酶的活性受到激素调节；反馈抑制调节参与级联反应的酶活性；抑制剂或激活剂调节酶的活性。
酶的化学本质：
除了具有催化活性的RNA之外几乎都是蛋白质
具有催化作用的蛋白质，才能称为酶；酶的催化活性依赖于天然蛋白质构象的完整性，蛋白质酶的空间结构对其催化活性是必需的
酶的化学组成：
单纯蛋白质：除了蛋白质之外，不包含其他物质，如蛋白酶、脲酶
缀合蛋白质：全酶=脱辅酶（蛋白质）+辅因子（非蛋白小分子物质或金属离子）
辅酶：与脱辅酶结合比较松弛的小分子有机物质，透析即可除去
辅基：以共价键与脱辅酶相结合，不能通过透析去除的小分子
辅酶与辅基在酶催化反应中起着电子、原子或某些化学基团的传递作用。
酶的分类
根据酶蛋白分子特点，分为：
单体酶：一般由一条肽链组成，如溶菌酶、羧肽酶A，Mw：(13-35)×103
寡聚酶：两个或两个以上亚基组成的酶，亚基之间靠次级键结合，彼此容易分开Mw>35×103
多酶复合体：由几种酶靠非共价键彼此嵌合而成，酶催化反应依次进行，脂肪酸合成酶复合体
酶的专一性
结构专一性：酶只作用于一种或一类底物
立体异构专一性：酶只作用于旋光异构体或几何异构体的其中一种构型
酶的活力
酶的活力：酶催化某一化学反应的能力，以一定条件下催化反应的速率来表示，即单位时间内、单位体积中产物的增加量/底物的减少量
酶的活力单位（U，activity unit）：在一定条件下，1min内能转化1微摩底物所需的酶量1U=1μmol/min
用于表示酶的含量：每克或每毫升酶制剂含有酶单位的量（U/g，U/mL）
酶的比活力：每mg蛋白质所含有的酶活力单位数，代表酶的纯度
比活力=活力U/mg蛋白
对同一种酶，比活力越大，酶的纯度越高
酶活力测定方法分光光度法：底物和产物光吸收不同荧光法：底物和产物荧光性质存在差别电化学方法：玻璃电极+pH计；氧电极等
酶促反应动力学：米氏常数
米氏常数意义
Km为酶的一个特征常数：其大小只与酶的性质有关，与酶浓度无关
Km值随底物、温度、pH以及离子强度等酶反应条件而改变；
对某一酶促反应而言，在一定条件下都有特定的Km值，可用于鉴别酶的种类
Km可用于判断酶的专一性和最适底物：
酶若能作用于几种底物，就有几个Km值
1/Km值可近似表示酶与底物亲和力的大小，1/Km越大，酶对底物的亲和力越强
酶的抑制作用
酶抑制剂的应用举例
有机磷农药：敌敌畏、敌百虫等
通过酶分子活性部位的丝氨酸羟基共价结合方式，来抑制胆碱酯酶的活力，使乙
酰胆碱不能分解为一酸和胆碱，为神经毒剂
青霉素：可通过与糖肽转肽酶的活性部位丝氨酸羟基共价结合的方式，使糖肽转肽酶失活，导致细菌细胞壁合成受阻，从而损害细菌生长
酶的活性部位
酶的活性部位：酶分子中与酶活力直接相关的区域，分为结合部位和催化部位
活性部位的特点：
由数个氨基酸残基构成，只占酶分子体积的1-2%
活性部位是一个三维空间实体：酶的高级结构改变时，酶也即失去活性
活性部位与底物的结合存在诱导契合的过程
活性部位一般位于酶分子表面的一个裂缝内，内部疏水
底物通过非共价相互作用与活性部位结合
酶的来源和生产
提取分离：以动植物为主要原料
适用于动植物资源丰富的地区，如从木瓜中分离木瓜蛋白酶
缺陷：生产周期长、来源有限，不适于大规模生产
化学合成
主要用于短肽合成、人工模拟酶合成以及酶的化学修饰等
缺陷：合成步骤多，成本高，工艺复杂，难以工业化
生物合成：又称为生物转化法，是指经过预选设计，利用微生物细胞、动植物细胞的生命活动而获得目的酶的技术过程
目前酶的工业生产一般都以微生物为主要来源
优点：品种全、产量高、成本低，易于利用基因工程等手段进行改造
酶制备的基本原则
1.防止酶的变性失活，全部操作一般在低温（0～4℃）进行，避免剧烈搅拌，0避免使用强酸和强碱，加入保护剂（EDTA、β-巯基乙醇等）
2.分离纯化过程中对目的酶的活力回收率和比活力进行跟踪监测，活力回收率：每一步的总活力/原液的总活力，比活力：每mg蛋白质所含有的酶活力单位数，U/mg
酶制备的一般程序
酶的提取（细胞破碎）
细胞破碎：酶提取必要的前处理操作，大多数酶存在于细胞内
物理方法：主要通过剪切力、压力、超声波、渗透压、冻融等各种物理因素的作用使组织细胞破碎的方法
化学方法：主要利用化学试剂对细胞壁或细胞膜的作用使细胞破碎
生物方法：主要是酶溶法，利用细胞自身的酶系或外加酶制剂的作用，使细胞外层结构受到破坏从而破碎细胞
酶的抽提
酶的提取：将酶从生物组织或细胞破碎液中以溶解状态最大限度释放出来的过程，也称为酶的抽提原则：“相似相容”酶提取时应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂，一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中
盐溶现象
盐溶：在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，会吸附在蛋白质分子上，增加蛋白质分子表面的电荷，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大
影响提取的主要因素
温度：提取时温度不宜高，特别是采用有机溶剂提取时，整个提纯操作应尽可能在低温下（0～4℃）进行；适当提高提取温度，可以提高酶的扩散速率，增加酶的溶解度，有利于酶的提取
pH值：酶提取液的pH值首先应保证在蛋白质稳定的范围内，为了增加酶的溶解度，提取时溶液的pH值应远离酶的等电点两侧
提取液的体积：适当增加提取液的用量可提高提取率；过量的提取液，使酶浓度降低，不利于进一步分离纯化，提取液的用量一般为含酶原料体积的3-5倍，少量多次
盐浓度：合适浓度的盐溶液盐溶效应；防止盐浓度过高时的盐析
添加保护剂：为防止酶变性失活，可以加入适量的EDTA、抗氧化剂等
酶的沉淀分离
凡能破坏蛋白质分子水化作用或减弱分子间同性相斥作用的因子，都有可能降低蛋白质在水中的溶解度而使它沉淀下来
盐析法：高浓度的盐溶液中的异性离子中和了蛋白质颗粒的表面电荷，从而破坏了蛋白质颗粒表面的水化层，蛋白质胶体溶液的稳定性被削弱
有机溶剂沉淀法：有机溶剂减小了溶剂的极性，削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用，增加蛋白质分子间作用力；有机溶剂在溶于水的同时从蛋白质分子的水化层中夺走水分子，破坏了蛋白质分子的水膜
等电点沉淀法沉淀能力：丙酮>乙醇>甲醇
复合沉淀法：聚丙烯酸等与酶形成复合物沉淀，再用适当方法使待分离酶溶解出来（选择性抽提），从而除去沉淀剂
选择性变性沉淀法：调控温度、表面活性剂等使杂质蛋白变性沉淀
酶的纯化
依据分子大小：离心分离、膜分离、凝胶层析依据电荷性质：离子交换层析、电泳
依据疏水作用：疏水层析依据生物亲和作用：亲和层析
游离酶的不足点
游离酶的稳定性差，容易变性失活；酶在反应结束后，难于回收利用；酶在反应后成为杂质，给产物的分离纯化带来困难。
固定化酶(immobilized enzyme)：被固定在载体或被束缚在一定的空间范围内进行催化反应的酶
固定化酶的特点：具有生物催化剂的功能，又具有固相催化剂的特性
固定化酶的制备原则
固定化不改变酶的催化活性及专一性；固定化应有利于生产自动化、连续化；固定化酶应有尽可能小的空间位阻；酶与载体应结合牢固；固定化酶应有尽可能高的稳定性；固定化成本应适中，以利于工业使用。
酶的固定化方法与制备技术将酶与水不溶性载体结合，制备固定化酶的过程称为酶的固定化
物理吸附法
物理吸附法：是通过非特异性物理吸附作用将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。包括范德华力、疏水相互作用、氢键等
优缺点：条件温和、工艺简单；载体选择范围大；既可实现酶的固定化又可以达到纯化的目的；载体可再生；吸附后酶的构象变化较小，对酶的催化活性影响较小；酶与载体结合力弱，容易脱落污染产物
物理吸附法常用的载体：
有机载体：纤维素、胶原、淀粉等
无机载体：活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等
离子结合法
离子结合法：是酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上的固定化方法
优缺点：离子吸附法具有操作简便、条件温和、活性中心不易被破坏，酶活力不易丧失等优点；结合力较弱，容易受pH、离子强度的影响
离子吸附法常用的载体：
阴离子交换剂：DEAE-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素等
阳离子交换剂：羧甲基(CM)-纤维素、纤维素柠檬酸盐、Dowex-50等
其吸附容量一般大于物理吸附剂
共价结合法
共价结合法：酶以共价键结合于载体上的固定化方法，也就是使酶分子上非活性部位功能团与载体表面活泼基团之间发生化学反应而形成共价键的连接方法
常用共价结合反应有数十种，例如重氮化、叠氮化、酸酐活化法、酰氯法、异硫氰酸酯法、缩合剂法、溴化氰活化法、烷基化及硅烷化法等。
优缺点：结合牢固，稳定性及重复使用性好；操作复杂，活性损失严重
酶蛋白N端的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基
酶蛋白C端的α-羧基、天门冬氨酸残基的β-羧基和谷氨酸残基的γ-羧基。
苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环
半胱氨酸残基的巯基；丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基；组氨酸残基的咪唑基；色氨酸残基的吲哚基
交联法
交联法（cross-linking）：是使用双功能或多功能交联试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法，不适用载体
常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、异氰酸衍生物等
戊二醛和酶蛋白中的游离氨基发生Schiff反应，形成席夫碱，从而使酶分子之间相互交联形成水不溶性的固定化酶
包埋法
包埋法（entrapment）：是将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中或高分子半透膜内的固定化方法
凝胶包埋法：将聚合物的单体与酶溶液混合，借助聚合促进剂（包括引发剂、交联剂等）的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中呈网格状
凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇等
微胶囊包埋法：将酶包埋在各种高聚物制成的半透膜微胶囊内的方法，使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性
常用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素等
固定化酶的酶活力
固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，其原因可能是：
酶活性中心的重要氨基酸残基被载体结合，高级结构和空间构象的改变，空间位阻的影响，内扩散阻力，底物与活性中心的接近受阻，半透膜对大分子底物的隔离，个别情况下，酶经固定化后其活力升高
固定化酶的稳定性绝大多数酶固定化后，稳定性提高，有效寿命延长
固定化细胞的特点
固定化酶（细胞）活力
酶的活力：单位时间内，单位体积中的底物减少量或产物增加量
固定化酶的活力单位：每毫克干重固定化酶（细胞）每分钟转化底物（或生成产物）的量，μmol/(min·mg)
偶联率及相对活力
活力回收率：固定化后固定化酶（细胞）所显示的活力占被固定的等当量游离酶（细胞）总活力的百分数
偶联率＝（加入酶活力－上清液酶活力）/加入酶总活力×100％
活力回收率＝固定化酶总活力/加入酶的总活力×100％
相对活力＝固定化酶总活力/（加入酶的总活力－上清液中未偶联酶活力）×100％
3.固定化酶的半衰期：t1/2
填充床式反应器流化床式反应器
膜反应器喷射式反应器
按操作方式区分分批式反应连续式反应
搅拌罐式反应器
最常用的一种传统形式的酶反应器。
结构组成：容器（反应罐）、搅拌器及保温装置。
按操作方式分为：
分批式搅拌罐式反应器：底物和游离酶一次性投入反应器，产物一次性取出；游离或固定化酶在反应结束后经过滤回收，转入下一批反应
连续流式搅拌罐式反应器：向反应器中投入固定化酶和底物溶液，不断搅拌，反应平衡后，以恒定流速连续流入底物，以相同流速输出产物
搅拌罐式反应器优缺点
优点：结构简单，易操作；酶与底物混合充分均匀；传质速度快，反应能迅速达到稳态；能处理胶体状底物、不溶性底物。
缺点：反应效率低，搅拌动力消耗；由于搅拌剪切力，固定化载体易被破坏、游离酶易发生泡沫化活性下降，反复回收固定化酶过程中易造成酶的失活损失。
膜反应器
膜反应器（membrane reactor,MR）是将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器可以用于游离酶的催化反应，也可以用于固定化酶的催化反应。
用于固定化酶催化反应的膜反应器是将酶固定在具有一定孔径的多孔薄膜中，而制成的一种生物反应器
膜反应器可以制成平板型、螺旋型、管型、中空纤维型、转盘型等多种形状。常用的是中空纤维反应器
填充床反应器
填充床反应器Packed Bed Reactor,PBR：又称固定床反应器，是固定化酶常用的一种反应器
结构：将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的柱床，然后，底物溶液从反应器以一定方向通过固定化酶柱床，通过酶催化生成产物，并连续收集输出的转化液（含产物）
操作特点：底物按一定方向以恒定速度通过固定化酶床层，通过底物溶液的流动实现物质的传递与混合
填充床反应器优缺点
适用性：广泛适用于固定化酶
优点：高效率（单位体积催化剂负荷量高）、剪切力小、结构简单等，特别适合于存在底物、产物抑制的催化反应，应用最为普遍
缺点：温度和pH难以控制；底物和产物会产生轴向分布，相应酶失活程度呈轴向分布；清洗和更换固定化酶麻烦；传质传热性能较差，柱内有自压缩倾向，易堵塞（不宜采用黏度大的底物），固定化酶受到的压力大（引起破碎）
改进：在固定床中间用托板分隔，减少底层固定化酶所受压力
流化床反应器
结构：流化床反应器（Fluidized Bed Reactor,FBR）是一种装有较小颗粒的垂直塔式反应器，反应器形状可为柱形或锥形等
操作特点：底物以一定速度由下向上流过，使固定化酶颗粒在悬浮状态下进行催化反应。注意控制反应液的流动速度
适用性：适用于固定化酶进行连续催化反应
流化床反应器优缺点
优点：不断旋转翻动，混合均匀，具有良好的传质及传热性能，不易堵塞，适用于处理粘度高的液体；
pH、温度控制及气体的供给比较容易；即使细小颗粒的固定化酶，压力也不会很高。
缺点：需保持一定的流速，运转成本高，难于放大；由于颗粒酶处于流动状态，易导致粒子的机械破损；由于流化床的空隙体积大，酶的浓度不高
酶反应器的选择依据：酶的应用形式底物或产物的理化性质酶反应动力学特性
酶反应器的性能评价：空时、空速转化率生产强度
酶的应用形式
游离酶：酶与底物一起溶解在反应溶液中，相互混合进行催化反应。可根据具体情况选择搅拌罐式反应器、鼓泡式反应器、膜反应器、喷射式反应器
固定化酶：可根据固定化酶的性状、颗粒大小及对机械强度的承受能力等不同情况选择搅拌罐式反应器、填充床反应器、鼓泡式反应器、流化床反应器、膜反应器
形状：颗粒状适用于搅拌罐式、填充床、流化床、鼓泡；平板状、直管状、螺旋管状等则适合采用膜反应器
颗粒大小：小颗粒适用于流化床，不宜采用填充床式，易造成酶的流失
稳定性：搅拌式剪切力较大；流化床的酶颗粒需承受较大压力
底物或产物的理化性质
理化性质：溶解性、分子量、黏度、挥发性等
溶解度：可溶性底物适于各类反应器；难溶底物易堵塞柱床，适于运用流化床反应器，使底物一直维持混悬状态
分子量：分子量较小时可选择膜反应器
物态：底物或产物为气体时，适用于鼓泡式反应器，产物能及时被分离
酶反应动力学特性
酶与底物的混合程度：充分混合可增加有效碰撞，利于提高催化效率
搅拌混合作用强的搅拌罐式、鼓泡式、流化床式反应器能使酶具有较好的混合效果；膜反应器和填充床式则由于酶较为固定，混合效果较差
底物浓度：有的酶促反应体系，底物浓度过高时酶催化反应会被抑制，需始终维持在较低的浓度，故膜反应器和连续流操作较为适合
产物对酶的反馈抑制作用：产物浓度过高时会对酶催化产生抑制，反应产物会及时流出的膜反应器较为适合
酶反应器的操作
酶反应器操作条件的确定
底物浓度酶浓度反应温度pH 值搅拌速度流动速度
实现酶反应的高效进行，必须考虑以下三方面：
选择恰当的酶（高质量）应用形式；选择和设计合适的酶反应器；确定合理的反应操作条件酶反应器的注意事项
1.酶反应器的操作稳定性：
酶的变性或中毒失活；固定化酶的脱落；载体破碎或溶解造成酶的损失
温度变化时及时调节，采用缓冲液或者加快搅拌来调节pH ；所用试剂和水不含毒物；
连续添加、更换酶；
有些载体会随使用时间的延长而溶解；克服办法是用金属氧化物包裹。
连续搅拌罐或流化床反应器中载体磨损；可采用电磁场搅拌固定在磁性载体中的酶
2.防止酶的变性失活：温度、pH 重金属离子、剪切力等
3.防止微生物污染
定点突变技术：有目的性地在已知DNA 序列中取代、插入或缺
失一定的核苷酸片段，可以有目的或针对性的改变DNA 序列中
的碱基次序
定点突变改造酶：又称理性分子设计，已知酶的结构与功能的基
础上，有目的地改变酶的某一活性基团，产生新性状的酶
寡核苷酸引物突变寡核苷酸盒式诱变PCR 介导的定点
突变
寡核苷酸定点突变基本原理
合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，使其与目的基因完全互
补
合成的寡核苷酸引物除短的错配区外，与目的基因完全互补
然后用DNA 聚合酶使寡核苷酸引物延伸，完成单链DNA 的复制
由此产生的双链DNA ，一条链为野生型亲代链，另一条为突
变型子代链;将获得的双联分子通过转导入宿主细胞，筛选
出突变体，其中基因已被定向修改
盒式突变：用一段人工合成具有突变序列的DNA 片段，取代
野生型基因中的相应序列，从而达到定点突变的目的。实施
盒式诱变时，要求靶DNA 插入点两侧有合适的限制酶切点；
重组质粒全部是突变体
PCR 介导的定点突变
重叠延伸突变
大引物诱变
PCR 的基本原理
类似于DNA 的体内复制。首先待扩增DNA
模板加热变性解链；
随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火；再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复
抗体酶
抗体酶：也称催化抗体（Catalytic antibody），是一种新型人工酶制剂，是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物
本质上是一类具有催化活性的免疫球蛋白，在可变区赋予了酶的属性
抗体（antibody）：是B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一种蛋白质，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能；主要存在于血清等体液中，是介导体液免疫的重要的免疫效应分子Pauling指出酶和抗体的根本不同在于前者选择性的结合一个化学反应的过渡态，而抗体则是结合一个基态分子
抗体酶的催化特征
与天然酶相比抗体酶的特点
能催化一些天然酶不能催化的反应；有更强的专一性和稳定性；催化作用机制不同
增强酶天然构象的稳定性与耐热性：修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联，使酶的天然构象产生“刚性”结构
保护酶活性部位与抗抑制剂：大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位
维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶
大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子；“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏酶分子上许多敏感基团交联修饰剂后，减少了蛋白水解酶破坏的可能性
酶化学修饰的方法
1.酶的表面化学修饰：大分子修饰；小分子修饰；交联修饰；固定化修饰
2.酶分子内部修饰
3.定点突变修饰
非水相酶反应的特点
提高非极性底物和产物的溶解度：相似相容
可催化水解反应的逆反应：在有机介质中，由于水的含量极微，导致酶促水解反应逆向进行，如蛋白酶在水相中催化肽链水解，在有机相中催化肽链合成；有利于反应后酶与产物的分离；解除或减少某些产物对酶的抑制作用；提高酶的稳定性；可抑制有水参与的副反应；无微生物污染
第七章发酵工程制药
发酵（fermentation）的定义
生化/生理学意义上：指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式（发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应）
发酵类型
微生物菌体发酵
是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的的产品的发酵工业，包括用于面包业的酵母发酵、用于食品的微生物菌体蛋白发酵、冬虫夏草、灵芝、茯苓、酵母菌片、乳酸菌制剂等、苏云金杆菌等微生物杀虫剂
特点：细胞的生长与产物积累相平行，生长稳定期产量最高
微生物酶发酵
早期酶的生产以动植物为原料,目前工业应用的酶多数来源于微生物发酵
医用酶制剂的生产快速发展：青霉素酰化酶、用于抗癌的天冬酰胺酶、用于溶栓的纳豆激酶酶的特点：易于工业化生产，便于改善工艺提高产量
酶的生物合成特点：受到微生物的严格调节控制，需要诱导作用，或遭受阻遏、抑制等调控作用的影响，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意
微生物代谢产物发酵
包括初级代谢产物和次级代谢产物两种类型
对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物
次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期即稳定期所产生的，如抗生素、生物碱、酶抑制剂等，经济价值高
微生物转化发酵
是利用微生物代谢过程中的某一种酶或酶系对一些化合物某一特定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似但含有特殊功能基团具有更多经济价值的产物
最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的
微生物转化优点：立体专一性强、转化条件温和、转化效率高，无污染
优良菌种的选育
工业化发酵菌种应符合的要求
1.遗传性能要相对稳定
2.生长速度快，不易感染其它种类的微生物或噬菌体
3.目标产物产量尽可能接近理论转化率
4.目标产物最好分泌到胞外
5.尽可能减少类似物的产量
6.培养基成分简单、价格低廉
菌种选育方法
自然选育诱变育种杂交育种原生质体融合基因重组
自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9
自然选育：不经人工处理利用微生物在一定条件下的自然突变进行育种的过程
定向培育：一定情况下，长期处理微生物并不断移种，累积和选择合适的自发突变体
诱变育种:利用物理、化学等因素，诱发基因突变，并从中筛选出具有某一优良性状的突变体
菌种保藏三要素
挑选典型菌种的优良纯种的休眠体进行保藏
创造有利于种子休眠的环境（低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养）；
尽可能采用多种不同的手段保藏同一菌株
菌种保藏的常用方法
甘油悬液保藏法：培养液与灭菌甘油（终浓度10-15%）混合-20℃0.5-1年，-70℃10年
冷冻真空干燥保藏法（冻干法）：5-15年，低温/干燥/缺氧/有保护剂
液氮超低温保藏法：-196℃，15年以上，最有效的长期保藏
宿主保藏法：病毒噬菌体
理想的菌种保藏方法应具备的条件
经长期保藏后菌种存活健在；
保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力
菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空
冷冻保藏
冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法
通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。
冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难
普通冷冻保藏技术(-20℃)
超低温冷冻保藏技术(-60~-80℃)
液氮冷冻保藏技术
菌种衰退的实质
菌种衰退是发生在细胞群体中的一个由量变到质变的演变过程
开始时，在一个大群体中仅个别细胞发生负变，这时如不及时发现并采取有效措施，而一味移种传代，则群体中这种负变个体的比例逐步增大，最后让它们占了优势，从而使整个群体表现出严重的衰退
所以，在开始时所谓“纯”的菌株，实际上其中已包含着一定程度的不纯因素；同样，到了后来，整个菌种虽已“衰退”了，但也是不纯的，即其中还有少数尚未衰退的个体存在着
复壮的概念
狭义的复壮仅是一种消极的措施，它指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的一种措施
广义的复壮则应是一项积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期菌种的生产性能逐步有所提高。所以，这实际上是一种利用自发突变（正变）不断从生产中进行选种的工作
微生物发酵方式
微生物发酵方式：
固体发酵：即曲法发酵，适合于传统发酵工艺及生产简单制品
液体发酵：液体深层发酵适于大规模工业化生产
液体深层发酵分类：分批发酵连续发酵补料分批发酵半连续发酵
第九章蛋白质药物的化学修饰
蛋白质药物化学修饰的意义
赋予蛋白质药物多种优良性能，有助于拓宽蛋白质药物的应用范围
循环半衰期延长；免疫原性降低或消失，毒副作用减小；物化性质和生物稳定性增强
蛋白质修饰策略
氨基修饰：非质子化的赖氨酸的ε-氨基是蛋白质分子中亲核反应活性很高的基团。氨基的烷基化、利用氰酸盐使氨基甲氨酞化是重要的赖氨酸修饰方法
巯基修饰：由于巯基具有很强的亲核性，巯基基团一般是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。烷基化试剂和其它一些卤代酸和卤代酞氨是重要的巯基修饰试剂
这种修饰的优点是容易做到定量定位修饰，可使修饰蛋白的生物活性全部保留，是人们最先研究的特异性修饰。但随着定位诱变的迅速发展，半胱氨酸的侧链基团的化学修饰有被取代的趋势
蛋白质一级结构
蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序，也是蛋白质最基本的结构
蛋白质二级结构
蛋白质的多肽链中有规则重复的构象（限于主链原子的局部空间排列，不包括与肽链其他区段的相互关系及侧链构象α-螺旋、β-折叠、β-转角）
二级结构是通过骨架上的羰基和酰胺基团之间形成的氢键维持的
蛋白质三级结构
蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲或折迭形成具有一定规律的三维空间结构，即分子中的各个侧链所形成的一定的构象
蛋白质四级结构
具有二条或二条以上独立三级结构的多肽链组成的蛋白质，其多肽链间通过次级键相互组合而形成的空间结构
每个具有独立三级结构的多肽链单位称为亚基(subunit)。四级结构实际上是指亚基的立体排布、相互作用及接触部位的布局