VD 补阳还五汤对血管性痴呆大鼠学习记忆功能及海马组织ERK2与CaMK_蛋白表达的影
［文章编号］1000－4718（2010）09－1722－06
［收稿日期］2010－02－28［修回日期］2010－05－06
*［基金项目］国家自然科学基金资助项目（No．30772873）；河北省中医药管理局资助项目（No．2007003）；河北省卫
生厅计划资助项目（No．08393）
△通讯作者Tell ：0311－85110168；E －mail ：gwj6088@163．com
补阳还五汤对血管性痴呆大鼠学习记忆功能及海马
组织ERK2与CaMK Ⅱβ蛋白表达的影响
*
唐敬龙，高维娟△，李玉明，钱
涛，张泓波，李
君，谢
志
（承德医学院病理生理学教研室，河北承德067000）
［摘
要］目的：观察补阳还五汤对血管性痴呆（VD ）大鼠学习记忆功能及其相关蛋白ERK2与CaMK Ⅱβ
表达的影响。方法：采用Pulsinelli ’s 4血管阻断法制备VD 动物模型，设假手术组、模型组、补阳还五汤组、尼莫地平组，
在术后第7d 、14d 、28d ，利用水迷宫试验对各组大鼠进行行为学检测；术后第30d ，采用HE 染色方法观察海马CA1区形态学变化并进行神经元计数；采用Western blotting 方法观察大鼠CA1区海马组织ERK2与CaMK Ⅱβ蛋白表达变化。结果：与假手术组比较，模型组大鼠学习与记忆成绩明显下降（P ＜0.05）；海马CA1区神经元排列紊乱，出现凝固性坏死，细胞脱失明显；ERK2与CaMK Ⅱβ蛋白表达显著降低（P ＜0.05）。与模型组比较，补阳还五汤组、尼莫地平组大鼠学习和记忆成绩均明显好转（P ＜0.05）；海马CA1区神经元排列整齐，细胞形态正常，脱失不明显，接近假手术组；ERK2与CaMK Ⅱβ蛋白表达显著增多（P ＜0.05）。结论：补阳还五汤可能通过促进VD 大鼠ERK2蛋白和CaMK Ⅱβ蛋白的表达，从而促进突触构建和学习记忆功能的恢复。
［关键词］补阳还五汤；痴呆，血管性；海马；Morris 水迷宫；细胞外信号调节激酶2；钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱβ
［中图分类号］R743
［文献标识码］A
doi ：10．3969/j．issn．1000－4718．2010．09．013
Effect of Buyanghuanwu decoction on the expression of ERK2and CaMK
Ⅱβin hippocampus tissue and on ability of learning and memory in vas-cular dementia rats
TANG Jing －long ，GAO Wei －juan ，LI Yu －ming ，QIAN Tao ，ZHANG Hong －bo ，LI Jun ，XIE Zhi
（Department of Pathophysiology ，Chengde Medical College ，Chengde 067000，China．E －mail ：gwj 6088@163．com ）
［ABSTRACT ］AIM ：To investigate the effect of Buyanghuanwu decoction ，a Chinese medicine ，on the ability of learning and memory in the rats with vascular dementia （VD ）and on the protein expression of extracellular signal －regula-ted kinase 2（ERK2）and calcium /calmodulin －dependent protein kinase Ⅱβ（CaMK Ⅱβ）in hippocampus CA1area．METHODS ：The rats were divided into 4groups ：sham group ，VD group ，VD +Buyanghuanwu decoction group and VD +nimodipine group．The VD rat model was prepared by Pulsinelli's four －vessel occlusion．At 7th day ，14th day or 28th day after operation ，
the behaviors of the rats were tested by Morris water maze．The morphological changes of the neurons in hippocampus CA1area were observed by HE staining 30d after operation．Western blotting was used to observe the protein expression of ERK2and CaMK Ⅱβin the brain tissues of hippocampal CA1area of the VD rats．RESULTS ：Compared with sham group ，the pathological changes such as irregular arrangement ，coagulation necrosis and obvious deletion in the neurons of hippocampus CA1area in VD group appeared significantly．The obstacle of learning and memory ability was ob-served and the protein expression of ERK2and CaMK Ⅱβin hippocampal CA1area was significantly decreased （P ＜0.05）．Compared with VD group ，the neurons in hippocampal CA1area of VD +Buyanghuanwu decoction group and VD +nimodipine group were in eumorphism ，lined up in order ，and the structure was close to that in sham group．The ability of learning and memory also significantly improved （P ＜0.05）．The protein expression of ERK2and CaMK Ⅱβin hippocam-pal CA1area significantly increased （P ＜0.05）．CONCLUSION ：Buyanghuanwu decoction promotes the protein expres-·2271·中国病理生理杂志Chinese Journal of Pathophysiology 2010，26（9）：1722－1727
sion of ERK2and CaMKⅡβin hippocampus CA1area to protect the neurons from injury，builds up the synapses and pro-motes the ability of learning and memory in VD rats．
［KEY WORDS］Buyanghuanwu decoction；Dementia，vascular；Hippocampus；Morris water maze；Extracellular signal－regulated kinase2；Calcium/calmodulin－dependent protein kinaseⅡβ
大脑对缺血缺氧十分敏感，其中反复脑缺血再灌注损伤和长期慢性低灌流是引发血管性痴呆（vas-cular dementia，VD）的主要原因。而海马CA1区被认为是学习记忆等高级神经活动的重要部位，是脑缺血最敏感的区域之一，故脑海马CA1区常被用来作为缺血缺氧损伤研究的模型［1］。在缺血性脑血管疾病的发生发展过程中，细胞外信号调节激酶2（ex-tracellular signal－regulated kinase，ERK2）能调控海马神经元的生长、发育、分化，参与海马神经元的可塑性；钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱβ（calcium/ calmodulin－dependent protein kinaseⅡβ，CaMKⅡβ）蛋白则参与突触构建过程，增强长时程增强效应（long－term potentiation，LTP），促进学习记忆的恢复。益气活血中药补阳还五汤是中医治疗脑缺血再灌注损伤的经典方剂，已经证实其有显著的抗VD作用［2］，但其分子机制尚未阐明，本实验通过观察补阳还五汤对VD大鼠CA1区ERK2与CaMKⅡβ蛋白表达的影响，探讨补阳还五汤对VD大鼠学习记忆的影响及其对海马神经元保护的分子机制。
材料和方法
1材料
1．1试剂仪器补阳还五汤（由黄芪、当归尾、芍药、川芎、桃仁、红花、地龙组成）由北京同仁堂医药公司承德分公司提供；戊巴比妥钠为进口分装；兔来源ERK2、兔来源CaMKⅡβ购自Cell Signaling Tech-nology；兔来源β－actin购自Santa Cruz Biotechnolo-gy；羊抗兔IgG购自Proteintech；发光液购自Thermo；Morris水迷宫（Morris Water Maze，MWM）由中国医学科学院生产。
1．2实验动物与分组成年SD雄性大鼠60只，体重220g?20g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号为SCXK（京）2007－0001，SPF级。通过水迷宫试验筛选出智力水平相当的大鼠，并随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组和尼莫地平组（阳性药物对照），每组15只。
2方法
2．1VD动物模型制备采用改良的Pulsinelli’s4血管阻断（four－vessel occlusion，4VO）方法制备VD动物模型［3］：大鼠于术前12h禁食，4h禁水，戊巴比妥钠（45－50mg/kg）腹腔注射麻醉。将大鼠伏卧固定于固定台上，行背侧颈正中切口，逐层钝性分离暴露双侧第1颈椎横突翼小孔，用直径0.5mm的电凝针烧灼双侧翼小孔内的椎动脉，造成永久性闭塞。24h后再将大鼠麻醉，仰卧固定，行腹侧颈正中切口，钝性分离双侧颈总动脉，以“4”号丝线穿线牵拉颈总动脉，用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉5min，共夹闭3次，每次间隔1h。假手术组只做皮肤切口和组织分离处理，不进行椎动脉烧灼和颈总动脉夹闭，皮肤缝合后正常饲养。模型组大鼠造模后自然饲养；补阳还五汤组和尼莫地平组大鼠按上述方法造模后分别灌服补阳还五汤（50g·kg－1·d－1）和尼莫地平（20mg·kg－1·d－1），持续灌服30d。
2．2大鼠行为学检测采用Morris水迷宫法进行大鼠学习记忆功能的测定。（1）定位航行实验（place navigation）分别在术后7d、14d、28d将大鼠从标记的4个入水点依次朝向池壁轻轻放入水中，记录其在90s内寻找到并爬上平台的搜索持续时间即逃避潜伏期（escape latency，EL）。若大鼠90s内尚未找到平台，则将其引导至平台停留15s，放回笼中。取3d的平均成绩作为测试的成绩。（2）空间探索实验（space navigation）定位航行结束后撤除平台，让大鼠在水池中游90s来寻找平台，记录大鼠90s内跨越平台次数，取3d的平均成绩作为测试的成绩。2．3取材、固定、HE染色术后第30d，水迷宫实验结束后，每组取5只大鼠用戊巴比妥钠（45－50 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后仰卧固定，快速开胸，暴露心脏，直视下左心室插管入升主动脉，剪开右心耳，以生理盐水约500mL经升主动脉灌注冲洗后，再灌注4%多聚甲醛溶液（pH7.4）500mL，持续2h 后开颅取脑，并将脑组织置于4?4%多聚甲醛中浸置4－6h后，截取视交叉至大脑横裂的部分，PBS 漂洗3次，每次1h，4?冰箱过夜，将固定好的脑组织予以常规脱水，透明，浸蜡，包埋，连续冠状切片，片厚4μm，用于HE染色。染色方法：石蜡切片常规用二甲苯脱蜡，经逐级乙醇脱水后，苏木素、伊红染色，中性树胶封片。
2．4海马CA1区神经元计数HE切片采用Mivnt 图像分析软件系统进行拍照。显微镜观察海马CA1区神经元并进行计数，每张切片选6个不同子午线方向视野行各层细胞计数，取其平均值。
2．5ERK2与CaMKⅡβ蛋白的检测术后第30d，
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水迷宫实验结束后，每组取10只大鼠用戊巴比妥钠（45－50mg/kg）麻醉，取海马放入液氮，于立体镜下切除CA1之后转存到－70?冰箱中。待所有标本收集完毕后将样品立即放到4?预冷的匀浆器中，先用PBS匀浆至清澈，弃上清，加裂解缓冲液中，裂解40min。之后12000r/min离心15min取上清液分装。用BCA试剂盒测定蛋白质含量。将提取蛋白样品加入等体积的2?loading buffer混匀，在100?沸水中煮3min，变性，－80?保存，备用。以12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，ERK2蛋白按每孔蛋白上样量为30μg，CaMKⅡβ蛋白按每孔蛋白上样量为50μg按积层胶80V，分离胶120 V条件（恒压）进行电泳，直至溴酚蓝移动至胶底部终止电泳。转膜前先用甲醇激活PVDF膜（1min），按阴极近胶、阳极近膜的位置准备好转膜装置，4?条件下300mA（恒流）转膜2.5h，将凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上。转膜结束后，用5%TBST脱脂奶粉封闭液封闭PVDF膜2h，后加入兔抗ERK2多克隆抗体（1?1000稀释）、CaMKⅡβ多克隆抗体（1?1000稀释）、β－actin（1?600稀释）4?过夜。TBST洗3次，15min?1次，10min?2次，Ⅱ抗用生物素标记羊抗兔IgG（1?2000稀释）孵育1h，TBST 洗3次，5min?3次，经ECL发光试剂盒显影，X射线底片曝光。以β－actin为内参照。实验重复6次。将蛋白印迹显影图像扫描。用Quantity One分析软件进行半定量分析，将ERK2与CaMKⅡβ蛋白灰度值与内参照β－actin灰度值比较，所得比值表示各组样品ERK2与CaMKⅡβ蛋白的表达水平。
3统计学处理
数据用均数?标准差（珋x?s）表示，各组数据用SPSS11.5统计软件进行方差检验分析，方差齐者组间比较用LSD检验，方差不齐者用Games－Howell 检验。
结果
1补阳还五汤对大鼠水迷宫逃避潜伏期的影响假手术组大鼠在术后7d、14d、28d的逃逸潜伏期分别为（26.65?1.23）s、（12.96?1.13）s、（8.44?1.10）s；与之比较，模型组大鼠在各个时点的逃逸潜伏期［（63.57?2.14）s、（59.45?2.01）s、（54.25?1.83）s］均明显延长（P＜0.05）；与模型组相比，补阳还五汤组［（38.62?2.07）s、（21.36?1.23）s、（12.91?1.31）s］和尼莫地平组［（40.11?2.04）s、（22.58?1.65）s、（13.63?1.46）s］在术后第7d、14 d、28d逃避潜伏期均显著缩短（P＜0.05）；补阳还五汤组和尼莫地平组相比，大鼠在术后各个时点逃避潜伏期均无明显区别（P＞0.05），见图1
。
Figure1．The effect of Buyinghuanwu decoction on the escape latency of rats in Morris water maze at different time
points．珋x?s．n=15．*P＜0.05vs sham group；#P
＜0.05vs VD group．
图1补阳还五汤对大鼠水迷宫逃避潜伏期的影响
2补阳还五汤对大鼠水迷宫跨越平台次数的影响假手术组大鼠在术后第7d、14d、28d跨越平台次数在90s内分别为（7.94?0.72）次、（12.83?0.80）次、（15.89?0.82）次；与之相比，模型组大鼠在各个时点的跨越平台次数［（3.13?0.28）次、（5.62?0.33）次、（6.33?0.48）次］均显著减少（P＜0.05）；与模型组相比，补阳还五汤组［（6.75?0.61）次、（11.55?0.69）次、（14.92?0.72）次］和尼莫地平组［（6.42?0.58）次、（10.63?0.69）次、（13.71?0.70）次］在术后第7d、14d、28d跨越平台次数均显著增多（P＜0.05）；补阳还五汤组和尼莫地平组相比，大鼠在术后各个时点跨越平台次数均无明显区别（P＞0.05），见图2
。
Figure2．The effect of Buyanghuanwu decoction on times of stri-ding over platform of rats in Morris water maze at dif-
ferent time points．珋x?s．n=15．*P＜0.05vs sham
group；#P＜0．05vs VD group．
图2补阳还五汤对大鼠水迷宫跨越平台次数的影响
3补阳还五汤对大鼠海马CA1区神经元形态的影响术后30d，假手术组表现为正常组织形态，海马CA1区神经元排列整齐，均匀，细胞结构完整，见图
·
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·
3A；而模型组CA1区海马神经细胞排列欠规则，界限不清楚，正常细胞结构消失，胞核区域浓染，出现凝固性坏死，细胞脱失明显，见图3B；补阳还五汤组及尼莫地平组大部分海马神经元细胞接近正常，核膜轮廓清晰，核仁清楚，排列规则，见图3C、D
。
Figure3．The effect of Buyanghuanwu decoction on morphological changes in hippocampal CA1of rats30d after operation（?400）．A：sham group，the neurons were in neat rows，integral structure；B：model group，cells showed irregular arrangement，coagu-lation necrosis and obvious deletion；C：VD+Buyanghuanwu decoction group，the neurons were in neat rows，integral struc-ture and close to those in sham group；D：VD+nimodipine group，the neurons were in neat rows，integral structure and close to those in sham group．
图3术后30d补阳还五汤对大鼠海马CA1区形态学的影响
4补阳还五汤对大鼠海马CA1区神经元数目的影响
术后30d，进行细胞计数显示：与假手术组
（48.56?3.23）比较，模型组大鼠海马神经元数目
（16.33?1.08）明显减少（P＜0.05）；补阳还五汤组
（45.92?3.06）和尼莫地平组（43.19?2.87）大鼠海马
神经元数目明显多于模型组（P＜0.05）；补阳还五汤
组与尼莫地平组比较无明显差别（P＞0.05），见图4。
5补阳还五汤对大鼠海马组织神经元胞浆蛋白
ERK2表达的影响
术后30d，对蛋白条带平均灰度值进行分析结
果显示：与假手术组（1.01?0.09）比较，模型组
（0.53?0.07）大鼠海马ERK2蛋白在术后28d表达
显著减少（P＜0.05），而补阳还五汤组（0.99?
0.08）和尼莫地平组（0.93?0.08）ERK2蛋白的表
达则明显高于模型组（P＜0.05），且补阳还五汤组和
尼莫地平组相比，蛋白表达无显著差异（P＞0.05），
见图5
。
Figure4．The effect of Buyanghuanwu decoction on the numbers
of hippocampal CA1neurons of rats30d after opera-
tion．珋x?s．n=5．*P＜0.05vs sham group；#P＜
0.05vs VD group．
图4术后30d补阳还五汤对大鼠海马CA1区神经元数目
的影响
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Figure5．The effect of Buyanghuanwu decoction on the expres-sion of ERK2in hippocampal CA1neurons of rats30d
after operation．A：VD group；B：VD+nimodipine
group；C：VD+Buyanghuanwu decoction；D：sham
group．珋x?s．n=10．*P＜0.05vs sham group；#P＜
0.05vs VD group．
图5术后30d补阳还五汤对大鼠海马组织神经元ERK2蛋白表达的影响
6补阳还五汤对大鼠海马组织神经元CaMKⅡβ蛋白表达的影响
术后30d，对蛋白条带平均灰度值进行分析结果显示：与假手术组（1.12?0.04）比较，模型组（0.56?0.03）大鼠海马CaMKⅡβ蛋白在术后28d 表达显著减少（P＜0.05），而补阳还五汤组（1.01?0.04）和尼莫地平组（1.00?0.05）CaMKⅡβ蛋白的表达则明显高于模型组（P＜0.05），补阳还五汤组和尼莫地平组相比，CaMKⅡβ蛋白表达无显著差异（P ＞0.05），见图6。
讨论
VD是由脑血管疾病所致的智能及认知功能障碍临床综合征。最终导致神经细胞损伤、学习记忆能力下降。ERK2是细胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，调控神经细胞的生长、分化和损伤修复［4］，保护受损神经元。VD还与CaMKⅡβ密切相关，Okamoto 等［5］发现CaMKⅡβ亚基的285－542和344－542氨基酸位点突变导致其蛋白激酶活性丧失，从而影响信号通路转导，造成突触构建障碍。
近年来，国内进行了大量的实验研究，证实益气活血中药有显著的抗VD作用［6－9］。而补阳还五汤是益气活血中药中的经典方剂，由黄芪、当归尾、芍药、川芎、桃仁、红花、地龙组成，本方重用黄芪，补益元气，瘀去络通，为君药。实验证实黄芪有扩张血管、改善微循环等作用［10］。
当归尾活血通络而不伤Figure6．The effect of Buyanghuanwu decoction on the expres-sion of CaMKⅡβin hippocampal CA1neurons of rats
30d after operation．A：VD group；B：VD+nimodipine
group：C：VD+Buyanghuanwu decoction；D：sham
group．珋x?s．n=10．*P＜0.05vs sham group；#P＜
0.05vs VD group．
图6术后30d补阳还五汤对大鼠海马组织神经元CaMK Ⅱβ蛋白表达的影响
血，用为臣药。赤芍、川芎、桃仁、红花协同当归尾以活血化瘀，地龙通经活络，力专善走，周行全身，以行药力，亦为佐药［11］。此外补阳还五汤干预后明显减低VD大鼠钙离子通道的开放时间和开放率［12］，减轻钙超载对神经细胞的损伤，改善微循环。尼莫地平是二氢吡啶类钙离子通道阻滞剂，有解除脑血管痉挛，改善微循环等作用。临床上可用于治疗轻重度VD［13］。本实验以尼莫地平为阳性对照药物。
本实验给予补阳还五汤干预治疗后，Morris水迷宫实验显示：随时间的延长各组大鼠的EL均有不同程度的缩短，垮台次数有不同程度的增多，这与水迷宫训练次数的增加促进大鼠的学习记忆有关系。但是假手术组大鼠的EL缩短和跨越平台次数增多较模型组显著，表明正常大鼠学习、记忆功能较模型组好。此外，VD大鼠的EL缩短幅度与垮台次数增加幅度小，表明其学习记忆能力随时间的延长而降低，提示脑损害逐渐加重。HE染色及细胞计数均证实，补阳还五汤对VD大鼠的缺血再灌注损伤有一定的保护作用，改善学习记忆。Western blotting实验证实，模型组大鼠海马CA1区ERK2蛋白表达下调，使ERK2与下游转录因子（如CREB）结合能力下降，影响下游基因的转录、翻译、合成等水平，使ERK2蛋白总量减少，导致受损细胞因不能被修复而死亡［4］。CaMKⅡβ蛋白表达下调，降低AMPA受体的电导作用，使LTP难以维持［14］，同时CaMKⅡβ向突触后膜移动减少，使突触构建能力下降，无法激活细胞核内
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基因表达及新突触的形成
［15］
，从而使PSD 间隙变
宽，信息传递时间延长，减弱学习记忆能力。
综上所述，应用促进ERK2与CaMK Ⅱβ蛋白表达的药物可能成为治疗VD 的有效方法之一。本实验给予补阳还五汤治疗30d 后能显著上调ERK2与CaMK Ⅱβ蛋白的表达（P ＜0.05），显著改善大鼠学习记忆能力，这为治疗血管性痴呆提供了新选择。
［参
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535－548．
促炎因子通过NF －κB 信号通路以及新的前馈调节机制诱导RIP2激酶产生
转录因子NF －κB 是细胞内炎症与凋亡反应的中心介质。蛋白激酶RIP2是CARD 蛋白家族的成员（有半胱天冬氨酸酶活性和募集结构域，也称CARD3，RIPK2，CARDIAK ，RICK 和CCK ）并且是NF －κB 的激活剂。本研究通过转录分析（tran-scriptional profiling ）及蛋白表达分析证明内皮细胞内的炎症细胞因子TNF －α，IL －1β以及INF －γ可诱导RIP2转录和翻译。通过运用两种不同机制的NF －κB 信号抑制剂柳氮磺吡啶（NF －κB 抑制剂）和WY －1464（PPAR α过氧化质体增殖物激活受体激动剂）干扰转录因子RELA （p65），抑制TNF －α诱导的RIP2基因表达，提示细胞因子诱导的RIP2基因转录激活与表达和NF －κB 信号相关。多个NF －κB 反应元件都位于人、鼠RIP2基因的上游区域。RIP2与IKK 复合物的一个元件IKK γ（I κB 激酶）结合后可上调NF －κB 。所有的结果都支持NF －κB 调节有一个正性前馈调节机制，参与NF －κB 依赖的炎症细胞因子诱导的RIP2转录并增加RIP2蛋白水平。增加的RIP2蛋白与IKK γ相互作用后又能加强NF －κB 功能。
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