苯胺蓝黑与人血清白蛋白的相互作用及对其构象的影响

收稿日期:2010205204;修订日期:2010207201

基金项目:中央高校基本科研业务费专项(2009B18214)资金资助作者简介:李　颖(1978-),女,讲师;E 2mail:hj6688@hhu .edu .cn

李　颖

(河海大学环境学院,浅水湖泊综合治理与资源开发教育部重点实验室,南京210098)

摘　要:利用荧光光谱和同步荧光光谱研究了不同温度下苯胺蓝黑与人血清白蛋

白相互作用时的荧光猝灭及构象的变化情况。实验结果表明,苯胺蓝黑与人血清白蛋白之间可以发生相互作用,而且有较强的结合。同步荧光光谱研究了人血清白蛋白与苯胺蓝黑的相互作用中人血清白蛋白构象的变化,结果显示二者结合改变了蛋白质的微环境。热力学参数说明小分子与蛋白质的作用以疏水作用为主。关键词:苯胺蓝黑;人血清白蛋白;荧光光谱;相互作用

中图分类号:O65713 文献标识码:A 文章编号:100020720(2010)112091203

偶氮染料是偶氮基两端连接芳基的一类有机

化合物,按分子中所含偶氮基数目可分为单偶氮、双偶氮、三偶氮和多偶氮染料,随着偶氮基数目的增加,染料的颜色加深。在特殊条件下,它能分解产生20多种致癌芳香胺,经过活化作用改变人体的DNA 结构引起病变和诱发癌症。苯胺蓝黑是偶氮类有机化合物中的一种,用于羊毛、蚕丝、锦纶及其混纺织物的染色和直接印花。

人血清白蛋白(HS A )能和许多内源及外源化合物结合,起到存储和转运作用[1]

。人血清白蛋白具有许多重要的生理功能,能够和氨基酸、激素、

药物[2～4]、有毒污染物分子[5]

等许多物质结合。以它作模型蛋白质研究其与小分子的相互作用,有助于了解小分子在体内的转运和代谢、蛋白质结构与功能的关系。本研究在生理条件下,采用光谱学方法研究苯胺蓝黑对蛋白质结构影响,从分子水平上认识苯胺蓝黑与血清白蛋白的结合方式,对了解偶氮类化合物在体内的代谢过程及生物效应,对研究其中毒机制及指导解毒等方面都具有重要的价值。1　实验部分111　仪器与试剂

LS 250B 型荧光分光光度计(PERKI N 2EL MER 公司);苯胺蓝黑(上海标本模型厂),储备液(110

×10-3

mol/L )用无水乙醇配制;人血清白蛋白(Sig ma 2A ldrich 生物技术公司),用pH 7140Tris 2

HCl 缓冲溶液配制,储备液(115×10-5

mol/L )保存于4℃冰箱内;三羟基甲基氨基甲烷2盐酸(Tris 2HCl )缓冲溶液(pH 7140)用0110mol/L 的Tris 和0110mol/L HCl 配制;110mol/L NaCl 溶液。实验

用水为超纯水,其它试剂均为分析纯。112　实验方法

11211　荧光光谱　LS 250B 荧光分光光度计记录

样品荧光光谱和荧光强度,使用狭缝宽度为5n m /5n m 。以280nm 为激发波长,扫描300～500nm 范围的荧光光谱。实验过程中用循环恒温水浴控制样品温度。

11212　荧光滴定实验　在3mL 含有HS A 的溶液

中,以微量注射器逐次加入不同体积的苯胺蓝黑储备液,为使反应完全设定反应时间为2m in 。以280n m /344n m 为激发波长、发射波长,记录体系在不同温度下的荧光强度值。所得数据利用Scatchard 方程计算结合常数。2　结果与讨论

211　苯胺蓝黑与HS A 结合的荧光光谱和结合常数

图1为HS A 与苯胺蓝黑作用前后荧光光谱,从图中看出苯胺蓝黑的加入使HS A 荧光强度明显

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图1　苯胺蓝黑2HSA 体系荧光光谱

F i g 11　The fluorescence e m issi on spectra of

an ili n e blue bl ack 2HSA system

1-310×10-6

mol/L -1

HS A;(2～7)-310×10-6

mol/L HS A +1164×10

-5

3123×10-5 4176×10-5 6125×10

-5

7169×10

-5

9109×10-5

mol/L 苯胺蓝黑;

8-1164×10-5

mol/L 苯胺蓝黑。T =296K,pH714,λex

=280n m

降低。随着苯胺蓝黑浓度不断增大,生色团分子荧

光强度逐渐降低,因此可以看出苯胺蓝黑对HS A 的荧光有猝灭作用,说明苯胺蓝黑与HS A 之间可以发生相互作用。

通过Scatchard 方程[6]

定量的分析了苯胺蓝黑

与HS A 的结合常数大小。计算公式为r

D f

=n K -r K ,其中r 是每摩尔蛋白结合的小分子摩尔数,D f

是游离小分子浓度,K 与n 分别是结合常数与结合

位点数,结果列于表1。从表1中可以看出苯胺蓝黑与HS A 结合能力较强,在各个温度下的结合常

数均达110×104

L /mol 以上。212　苯胺蓝黑与HS A 的作用力类型蛋白质与配体结合过程中存在四种基本的非共价作用力分别为:氢键、范德华作用力、静电作用力和疏水作用力。不同结构的小分子与蛋白质的作

表1　苯胺蓝黑2HSA 体系结合常数和热力学参数

Tab 11　Ther m odynam i c param eters of an ili n e blue bl ack 2HSA i n teracti on a t pH 714pH

T /K

K /

(104L /mol )R △G 0/

(kJ /mol )△S 0/

(J /mol K )△H 0/

(kJ /mol )714

296

303310

619157150871854

019967019962019976

-27100-27184-28170

122178122178122178

913691369136

用类型不同,当反应温度变化不太大时,反应的焓变ΔH 可以看作一个常数。通过Van ’t Hoff 方程

可以得到反应过程中的热力学常数:ln K =-ΔH 0

R T

+ΔS 0R

,K 是不同温度下小分子与蛋白质结合常数,R 是气体常数。由式:ΔG 0=ΔH 0

-T

ΔS 0,计算出反应的自由能变化ΔG 0

。由于热力学函数的大小以及符号不同,有机化合物与蛋白质的作用力类型也不同。Ross [7]

等根据大量实验结果,总结了生物大分子与小分子作用力类型的热力学规律,ΔS >0可能是疏水和静电作用力;ΔH >0同时ΔS >0为疏水作用力;ΔH <0主要是静电作用力。由表1中热力学函数结果可知苯胺蓝黑与HSA 的相互作用均为自发过程(ΔG <0),且ΔH >0,ΔS >0,由此可见,苯胺蓝黑与HS A 的相互作用过程中以疏水作用为主,同时也存在静电作用力。213　苯胺蓝黑与人血清白蛋白同步荧光光谱研究

同步荧光是由L i ody 提出的[8]

,包括固定激发

和发射单色器的波长差,获得固定的△

λ。通过同步光谱可以得到关于生色团分子周围环境的信息。

根据M iller [9]

提出的理论,△

λ=60的同步荧光仅表现为色氨酸残基的特征光谱。图2为苯胺蓝黑2

HSA 体系的同步荧光光谱(△

λ=60),随着有机化合物的加入,HS A 的色氨酸残基的荧光强度逐渐降低,色氨酸残基的最大发射波长发生红移。这一结果表明,苯胺蓝黑的加入使HS A 的构象发生变化,色氨酸残基所处环境的疏水性降低。214　苯胺蓝黑与人血清白蛋白相互作用结合模式研究

HS A 三维晶体结构显示有3个结构域:Domain I (12195),Domain Ⅱ(1962383),Domain Ⅲ(3842585)。每个结构域又含有A 、B 两个亚结构域。研究发现,配体与血清的结合部位为亚结构

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图2　苯胺蓝黑2HSA体系同步荧光光谱

F i g12　The synchronous fluorescence spectra of

an ili n e blue bl ack2HSA system

1-310×10-6mol/L HS A;(2～)5-310×10-6mol/

L HS A+0166×10-5 1131×10-5 1196×10-5

2160×10-5mol/L苯胺蓝黑。T=296K,pH714,△λ

=60

域ⅡA和ⅢA的疏水穴里,对应于Sudl ow[10]所描述的Site I和SiteⅡ位,其中ⅢA的活性最高。Site I和SiteⅡ这两个区域都是由疏水性氨基酸残基构成疏水空腔,带有电荷的氨基酸残基形成了疏水空腔的入口。由于形成空腔的结构和电荷不同, Site I更有利于结合体积比较大、带负电和具有杂原子环的小分子,而SiteⅡ更趋于结合一些芳香酸类小分子[11]。苯胺蓝黑分子结构较大,在体系中主要以负电荷形式存在,故苯胺蓝黑结合在HS A 的Site I处的可能性较大。苯胺蓝黑分子与人血清白蛋白之间通过疏水作用力镶嵌在Site I的疏水腔内。而在已结合的苯胺蓝黑分子周围,电离的极性氨基酸残基会与带负电的分子之间形成静电作用力,这对结合的稳定性起了重要作用,阻止了酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Tr p)之间发生能量转移,从而导致HS A内源荧光猝灭。

参考文献

[1]　Carter D,Ho J X.Adv.Pr otein Che m.1994,45:153

[2]　孙艳涛,张玉璞,毕淑云,等.高等学校化学学报,

2009,30(6):1095

[3]　王?瑶,王东跃,郗国宏,等.分析试验室,2009,

28(4):73

[4]　吴秋华,王东跃,周　欣,等.光谱学与光谱分析,

2009,29:(7)1911

[5]　梁彦秋,臧树良,邓　斌,等.分析试验室,2009,

28(3):74

[6]　Scatchard G,Ann.NY Acad Sci,1949,51:660

[7]　Ross P D,Subra manian S.B i oche m,1981,20:3096

[8]　L l oyd J B F.Nature Phys Sci,1971,231:64

[9]　M iller J N.Pr oc Anal D iv Chem Soc,1979,16:203

[10]　Sudl ow G,B irkett D J,W ade D N.Mol Phar macol,

1976,12:1052

[11]　谢孟峡,徐晓云,王英典,等.化学学报,2005,

63(22):2055

Study on i n teracti on of of hu man seru m a lbu m i n an ili n e blue bl ack and the i r com for ma ti on changes

L I Ying(College of Envir on ment,Hohai University,M inistry of Educati on Key Laborat ory of I ntegrated Regulati on and Res ource Devel opment on Shall ow Lakes,NanJ ing210098),Fenxi Shiyanshi,2010,29 (11):91～93

Abstract:The interacti on of human seru m album in and aniline blue black was studied using fluorescence s pectr oscopy and synchr onous fluorescence s pectr oscopy in the pH714Tris2HC1buffer syste m at different te mperatures.The fluorescence s pectr oscop ic results show that the fluorescence intensity of HS A was significantly decreased in the p resence of aniline blue black.The binding constants were calculated by Scatchard’s equati on. And according t o the calculated ther modyna m ic para meters,the binding of HS A and aniline blue black is mainly attributed t o the hydr ophobic interacti on,partly static force.

Keywords:Aniline blue black;Human seru m albu m in;Fluorescence s pectr oscopy;I nteracti on

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