杂交瘤细胞的保存

作者：佚名实验频道来源：本站原创点击数：351 更新时间：2004-12-20 【我要评论】【字体：小大】

（一）保存

当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。另外在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭。所以必须冷藏保存一部分。保存方法如下：

1．材料

(1) 细胞：取对数生长期的细胞。

(2) 10％二甲基亚砜保护液（二甲基亚砜能损坏滤器，而又被高压所破坏，所以不能过滤或高压消毒。其本身就是毒品，无菌）：含10％二甲基亚砜、20％灭活胎牛血清，70％RPMI —1640液。

(3) 20％FCS—1640培养液：含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。

(4) 灭菌的2ml安瓶等

2．操作方法

(1) 去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10％FCS—1640液，使细胞悬浮。

(3) 1 000r/min离心10min，去上清。细胞沉淀用10％二甲基亚砜保护液制成悬液，使成1.0×107细胞／ml。

(3) 取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95％以上。

(4) 用注射器将细胞分装安瓶，每瓶0.5ml～1.0ml，熔封安瓶。

(5) 放4℃2h。

(6) 放液氮罐气态部分（-70℃）15h。

(7) 转入液氮部分。

（二）复苏

1．从液氮罐中取出安瓶立即放37℃水浴中速溶。

2．无菌操作打开安瓶，取出细胞悬液，转入组织培养瓶。

3．逐滴缓慢加入20％FCS－1640培养液3.5ml，这个过程延续3min。

4．5％CO2饱和湿度，37℃培养。

5．4h后弃去培养液上清，加入新鲜的20％FCS－1640培养液。

6．继续培养，换液，以至形成单层。

杂交瘤细胞制备

杂交瘤细胞的制备 1. 骨髓瘤细胞的准备选择生长状态良好的细胞，浑圆透亮，大小均一，边缘清晰，排列整齐，呈半致密分布。弃上清，以不完全培养基洗涤一次后，用10mL不完全培养基将骨髓瘤细胞（SP2/0）轻轻吹下。 2. 脾淋巴细胞的准备 a、取加强免疫后3天的小鼠，摘除眼球采血供分离阳性血清。 b、颈脱位将小鼠致死，用75%酒精消毒体表5min，随即放入超净台内小鼠解剖板上，左侧卧位，用7号针头固定四肢。 c、无菌打开腹腔取出脾脏，用基础培养基洗涤，并仔细去掉周围附着的结缔组织。 d、随后将脾脏转移到另一个盛有DMEM的平皿中。以弯头针头压住脾脏，用小针头在脾脏上插孔，并用镊子挤压，使脾细胞充分释放，制成脾细胞悬液。 3. 饲养细胞的制备取一只健康的ICR小鼠，摘眼球采血，颈脱臼处死，体表消毒和固定后，从大腿上剪开皮肤，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜。用10mL注射器，12#针头，注射5-10mL HAT培养基到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部，抽回腹腔内液体，注入已准备好的容器中。 4. 细胞融合 a、将上述制备的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于一支50mL的带盖的离心管中，1000rpm离心10min，上清要充分吸净，以免影响PEG的作用。 b、将融合管置于手掌中，轻轻振荡底部，务使两种细胞充分混匀。 c、用1mL吸管将预热的PEG在45~60s内缓慢加到融合管中，边加边轻轻摇匀。 d、立即滴加37℃预热的DMEM，使PEG稀释而失去作用，具体加法是用吸管在第一分钟内加1mL预热的不完全培养基，第二分钟内加2mL，第三分钟加8mL （遵照先慢后快的原则），37℃静置10min，1000rpm离心10min，弃上清。 e、加入5mL的HAT培养基，轻轻悬浮沉淀细胞，再加入适量的腹腔巨噬细胞，最后补加HAT至50mL左右。 f、分装于96孔细胞培养板，然后将培养板置37℃，5%CO2培养箱内培养。 g、5d后用HAT培养基换出一半培养基。 h、观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取适量细胞上清进行抗体检测。

单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理

单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（用选择培养基），第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。第一次筛选的原理和方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA合成油两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。第二次筛选的原理和方法：在单克隆抗体的生产过程中，由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，

杂交瘤细胞培养及其注意事项

杂交瘤细胞培养及其注意事项单克隆抗体的应用是一项迅速发展的技术。本文阐述了单克隆抗体制备前杂交瘤细胞的培养条件和应用，包括细胞的培养、培养基的选择，融合时期的选择，从而指导和优化实验室中杂交瘤的培养，促进融合细胞的融合率和后继单克隆抗体筛选实验的顺利进行。标签：杂交瘤；细胞培养；单克隆抗体随着杂交瘤细胞株不断的建立和生产单克隆抗体的日益广泛应用，杂交瘤细胞的培养和优化不断得到改善，但是国内实验室设备和条件有限，多数的单克隆抗体的筛选还是应用基础的免疫抗原包被，结合Elisa方法联合有限稀释法来筛选单克隆抗体。为了获得特异性较强的杂交瘤细胞株，融合前后细胞的培养以及杂交瘤的培养和储存，仍是基础实验室中必须注意和重视的技术。 1杂交瘤的起源和生产 1.1杂交瘤所用的骨髓瘤细胞系1966年Petingel等在体外培养小鼠浆细胞成功。Milstein等1972年由P3中用20μg 8-氮杂鸟嘌呤（8-azaguanine）筛选出缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）的新细胞系，称之为P3-X63-Ag8。由于X63本身分泌IgG1，形成的杂交瘤除分泌B细胞的特异性抗体外，同时分泌X63产生的抗体，因其抗体不纯，现多改用不分泌型骨髓瘤细胞系。国内现已引进NS-1，SP2/0，FO，X63-Ag8-653等小鼠骨髓瘤细胞系。最常使用的是SP2/0及NS-1[1]。 1.2人骨髓瘤细胞系为产生稳定的人免疫球蛋白的杂交瘤，需要人的缺某种酶的骨髓瘤细胞系。国外已筛选了一些人骨髓瘤细胞，但融合率不高，还没有推广使用。目前人一人杂交瘤技术仍存在着杂交瘤在不同培养基中的生长速度问题。细胞生长缓慢，抗体分泌力弱及效价较低，且难于克隆化等困难[2]，限制了人骨髓瘤细胞的应用。 1.3淋巴细胞和骨髓瘤细胞的关系B淋巴细胞容易与浆细胞瘤融合，而T细胞则需要同胸腺淋巴肉瘤融合（Kohler，et al. 1977；Schwaber，1977）。脾脏是大量T或B细胞的来源，与小鼠骨髓瘤细胞融合时，最常用的是小鼠的脾细胞。按照Burnet的细胞系选择学说，一个B淋巴细胞只能产生一种抗体，其”后代”也只能产生此种抗体，因为抗体是由DNA上的基因所决定，基因是可以遗传的。在正常情况下，小鼠脾中含有能产生各种不同抗体的B细胞，一只纯种小鼠体内可有（1～5）×107种不同的抗体，即有（1～5）×107种不同的B细胞。为了提高获得某种杂交瘤的机会，就需要设法增加小鼠体内分泌该种抗体的B细胞的数量。最常用的方法是用特定抗原多次免疫小鼠，使之产生特异性抗体。通过将免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞的融合，然后经过多次筛选，从而得到特异性的杂交瘤细胞。这样所获得的特异性的杂交瘤细胞在既具有脾细胞分泌抗体的能力的同时，又具有小鼠骨髓瘤细胞永生的特性，从而可以无限制地提供

杂交瘤细胞的培养,保存和复苏

杂交瘤细胞培养冻存与复苏杂交瘤细胞适用于无血清的培养基，无血清培养的基础培养基和添加物质杂交瘤细胞的无血清培养基通常是在标准的基础培养基中添加小分子和大分子物质，以代替血清的各种功能。不同基础培养基对细胞的无血清培养有一定的影响。不同细胞系对基础培养基也有选择性。最常用的基础培养基有RPMI 1640，F12，IMDM，DMEM+F12,DMEM+F12+RPMI 1640。形成的无血清培养基常能支持杂交瘤细胞在分批培养中生长到1×106细胞/ml以上，最终的单抗浓度可达10 μg/ml~100 μg/ml。基本上你说的那两种都有可能，你可以参考以下操作：【转贴】细胞融合和杂交瘤细胞培养用试剂的配制 ①RPMI-1640基础培养液，1 000ml RPMI-1640粉 10.4g 丙酮酸钠 0.11g 用900ml三蒸水(或无离子水再经过双蒸)，通CO2搅拌溶解。称取1.8g NaHCO3，用少量三蒸水溶解，边搅拌边加入1640液中。补足1 000ml，通过0.22μm滤膜正压过滤除菌(用CO2钢瓶加压)，分装，置30℃，菌检48小时4℃存放。效期不超过三个月。 ②RPMI-1640完全培养液，100ml 双抗(青、链霉素) 0.1ml 3％L-谷氨酰胺 2.5ml 犊牛血清 15.0ml 1640基础培养液 81.5ml 用时现配，4℃下存放不超过一周，用于细胞融合和克隆化培养的全培养液，可将小牛血清增至20％。 ③200mmol/L(3％)L-谷氨酰胺溶液 L-谷氨酰胺 5.846g 三蒸水 200ml 加热至50℃使全溶，0.22μm膜滤除菌，按每管4ml分装，-20℃保存。 ④双抗溶液青霉素(钠盐) 100万iu 链霉素(硫酸盐) 1g 溶于100ml灭菌三蒸水中，小量分装，-20℃冻存。杂交瘤细胞的保存当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。另外在长期的培养过程中，难免

【CN110423276A】一株杂交瘤细胞制备及其应用【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910167483.7 (22)申请日 2019.03.06 (83)生物保藏信息 CCTCC NO：C201929 2019.03.05 (71)申请人思格（苏州）生物科技有限公司地址 215000 江苏省苏州市工业园区金鸡湖大道99号苏州纳米城西北区20幢 403-17 (72)发明人任宝永　沈飞　 (74)专利代理机构苏州翔远专利代理事务所 (普通合伙) 32251 代理人王鑫 (51)Int.Cl. C07K 16/28(2006.01) C12N 5/20(2006.01) G01N 33/68(2006.01)G01N 33/577(2006.01) (54)发明名称一株杂交瘤细胞制备及其应用 (57)摘要本发明涉及一种分泌抗人PD -1分子单克隆抗体杂交瘤细胞的制备方法，以及根据该方法获得的杂交瘤细胞株、抗体及其应用。本发明所述单克隆抗体杂交瘤细胞保藏编号为CCTCC NO： C201929。所述方法包括小鼠免疫、细胞融合与、抗人PD -1抗体检测、杂交瘤细胞克隆。本发明的分泌高效价抗人PD -1分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株能够持续性地产生抗人PD -1分子单克隆抗体，为检测癌症病人PD -1分子表达提供了抗体源。权利要求书1页说明书5页序列表2页附图4页CN 110423276 A 2019.11.08 C N 110423276 A

权　利　要　求　书1/1页CN 110423276 A 1.鼠抗人PD-1单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：C201929。 2.鼠抗人PD-1单克隆抗体，其特征在于该抗体由保藏编号为CCTCC NO：C201929的杂交瘤细胞分泌产生。 3.保藏编号为CCTCC NO：C201929的杂交瘤细胞分泌产生的抗PD-1 单克隆抗体在流式免疫荧光检测细胞表面PD-1抗原表达中的应用。 2

杂交瘤技术制备单克隆抗体

杂交瘤技术制备单克隆抗体来源：https://www.360docs.net/doc/7e9451444.html, 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较单克隆抗体制备的一般流程如下:

单克隆抗体的制备方法如下。（一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后

杂交瘤细胞的复苏与冻存

杂交瘤细胞的复苏与冻存一．杂交瘤细胞的复苏杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存，若无意外情况时，可保存数年至数十年。复苏时融解细胞速度要快，使之迅速通过最易受损的-5℃—0℃，以防细胞内形成冰晶引起细胞死亡。通常情况下，冻存时细胞数量多，生长状态好的杂交瘤细胞系以及其他细胞的复苏可采用以下方法，这也是各个实验室普遍采用的程序。不过，冻存的细胞并不都能100%复苏成功，其原因较多，如冻存时细胞数量少或生长状态不良，或复苏时培养条件改变或方法不当，也可能细胞受细菌或支原体污染，以及液氮罐保管不善等。在出现上述情况时，可采用一些补救方法复苏这些细胞，如小鼠皮下形成实体瘤法，脾内接种法，小鼠腹腔诱生腹水和实体瘤法，以及96孔板培养法等。二杂交瘤细胞的冻存细胞冻存的原理是细胞在加血清和二甲基亚砜的培养基中以一定的缓慢速度下降温度（0℃- -20℃，每分钟下降1℃；-20℃--40℃每分钟下降2℃），可在-196℃液氮或液氮蒸气中长期保存。下面的细胞冻存方法，细胞复苏存活率均在80%以上。 1.材料：带盖吸管筒一只（铝质或洋铁皮制），内壁（包括筒底和盖）衬1-2层石棉纸或石棉布；含10-20%血清、5-10% DMSO 的HT 培养基，冰浴降温至0℃左右（用作冻存液）；灭菌安瓶或带盖小瓶；-70℃冰箱；液氮及液氮罐；处于对数生长中期、健康而活力好的杂交瘤细胞。方法：复苏时，从液氮中取出安瓶，立即在37℃水浴融化，待最后一点冰块快要融化时，从水浴中取出，置冰浴上。用5-10ml HT 培养基稀释，1000r/min 10分钟，弃上清，再悬浮于适量HT 培养基中，转入培养瓶或24孔板，置37℃，7.5% CO2培养。如果细胞存活力不高，死细胞太多，可加104-105/ml 小鼠腹腔细胞进行培养。 2、方法：（1）. 将杂交瘤细胞（或其他细胞）离心，重新悬浮于预冷的冻存液中，浓度为106-107左右/ml ，分装安瓶，每瓶1ml ，置冰浴上；安瓶上标明细胞名称、冻存日期、批号等。（2）安瓶封口后仍置冰浴上。（3）将安瓶放入一带收口绳的小布袋内，布袋上标明冻存号、细胞名称等，立即将布袋放入吸管筒内，置-70℃冰箱。（4）2-4小时后或过夜后从-70℃冰箱取出吸管筒，将盛有细胞的布袋移入液氮罐；在布袋的线绳上作好标记或代码；最后在液氮冻存簿上作详细记录。（5）液氮罐应定期补充液氮（最好是专人管理）；补充液氮及存取细胞时应带保护眼镜

如何筛选杂交瘤细胞-华采豆

如何筛选杂交瘤细胞在单克隆抗体制备过程中，有两次的筛选过程，第一次是筛选出杂交瘤细胞（用选择性培养基），第二次是进一步选出能生产我们需要的抗体的杂交瘤细胞。利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理是：根据以下三个原则： ①一种淋巴细胞克隆只产生一种抗体； ②细胞荣恶化技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性； ③利用代谢缺陷补救机理筛选出杂交瘤细胞，并进行克隆化，然后大量培养增殖，制备所需的单克隆抗体。单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S 途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D 途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂

单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理

单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT

单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（用选择培养基），第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。第一次筛选的原理和方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT 选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA合成油两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D 途径。另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B 细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。

杂交瘤技术制备单克隆抗体

杂交瘤技术制备单克隆抗体 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较单克隆抗体制备的一般流程如下:

单克隆抗体的制备方法如下。（一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后取脾融合

淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术

淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术 1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。一、细胞融合前准备 (一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 1. 颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案: 初次免疫1×10７／ ip (腹腔内注射) ↓2～3周后第二次免疫1×10７／ ip ↓3周后加强免疫(融合前三天) 1×10７／ ip或iv(静脉内注射) ↓ 取脾融合 2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放

一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。初次免疫 Ag 1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射 │(一般～1ml ／点) ↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip │(ip剂量不宜超过 ↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip │ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果) ↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv ↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。 (二) 饲养细胞在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。小鼠腹腔巨噬细胞的制备

HAT培养基筛选杂交瘤细胞的原理

创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* HAT培养基筛选杂交瘤细胞的原理 HAT培养基是指含有次黄嘌呤（hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）三种物质的细胞培养基。 1.细胞内合成DNA原料的核苷酸形成的途径（1）起始合成途径（de novo pathway）：由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程。（2）中间合成途径（salvage pa-thway）：利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸。 2.利用HAT培养基筛选杂交瘤细胞（1）经融合后细胞将以多种形式出现：融合的脾细胞—瘤细胞、融合的脾细胞—脾细胞、融合的瘤细胞—瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养基中存活仅5～7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。（2）融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的中间合成途径缺失株（例如嘌呤的中间合成途径缺失株和嘧啶的中间合成途径缺失株），即只有起始合成途径。效应B细胞虽不增殖，但有两条DNA合成途径。（3）氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻碍起始合成途径。HAT培养基中含有氨基蝶呤时，细胞只有中间合成途径，所以必须供给核苷酸。杂交瘤细胞的起始合成途径被氨基喋呤阻断，但可通过中间合成途径利用以培养

基中次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷为原料进行合成。而缺失中间合成途径的瘤细胞，失去增殖能力。从而选择出杂交瘤细胞。创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王*

杂交瘤细胞培养过程的问题、原因及解决方法

杂交瘤细胞培养过程中遇到的问题、产生的原因及解决办法 1.杂交瘤细胞初次培养及复苏效果不佳，如何解决此问题？解析：杂交瘤细胞系种类繁多，并不是所有的细胞系都能直接适应无血清培养基，如无法适应请先按照购买公司驯化适应程序进行细胞驯化，驯化后的细胞即可完全适应本公司的无血培养基。复苏问题：如冻存的杂交瘤细胞活率较低，复苏时可加5%胎牛血清于无血清培养基中，可修复受损细胞的状态，细胞复苏时接种密度要求大于1x105cells/mL，可保证更好的复苏率。 2.杂交瘤细胞传代最低接种密度是多少？最佳的接种密度是多少？解析：经过我们反复测试，最低接种密度极限值,1x104cells/mL，此密度仍可正常培养杂交瘤细胞，但细胞生长周期较长，6-7天达到峰值。最佳接种密度为1-2x105cells/mL，3-4天可达到峰值，细胞生长周期短，适合工业客户。 3.无血清培养杂交瘤细胞最大生长支持密度多少？怎么我养的几种杂交瘤细胞差距很大？解析：由于杂交瘤细胞系种类繁多，不同的细胞系最大生长密度也不一致，目前我们测试的细胞株最高的密度可到3x106cells/mL，最低的密度在1.6x106cells/mL。这取决于所培养的细胞株本身的特性。

4.我培养的杂交瘤细胞抗体表达量总是很低，有办法进一步提高抗体表达量吗？解析：北京友康公司在杂交瘤细胞培养方面，引入了全新的培养袋法，IgG 表达量可从300~400mg/L提高到480~520mg/L，我们可提供相关技术支持。 5.贵公司无血清培养杂交瘤细胞抗体表达一般在什么水平？目前我公司测试的两株细胞系，IgG抗体最高表达量在480~520mg/L，国外培养基IgG抗体最高表达水平在400~500mg/L，我公司的产品在抗体表达量上有明显的优势。友康恒业生物科技（北京）有限公司渠道部

杂交瘤技术的单克隆抗体的制备方法

杂交瘤技术的单克隆抗体的制备方法 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

杂交瘤技术的单克隆抗体的制备方法冉继平摘要：本文主要介绍了单克隆抗体、杂交瘤技术以及运用杂交瘤技术制备单克隆抗体的步骤。还对三种（包括人促甲状腺激素单克隆抗体、绵阳早孕因子单克隆抗体、阿莫西林单克隆抗体）不同的单克隆抗体的制备方法和临床运用做了简单的介绍。关键词：单克隆、抗体、杂交瘤技术。 1.0 杂交瘤单克隆抗体的简介抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。杂交瘤单克隆抗体的原理是: B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂; 而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。杂交瘤技术产生单克隆抗体的步骤一.提取合成专一性抗体的单个B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。二.应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，得到杂交瘤细胞。这种细胞既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性三.对杂交瘤细胞进行细胞培养，选出所需要的细胞群，体外或体内培养，从培养液或动物腹水中提取单克隆抗体 2.0 单克隆抗体的实例单克隆抗体用于临床诊断和治疗，目前研究的单克隆抗体非常的多，下文就会介绍几种单克隆抗体的的应用实例： 2．1 人促甲状腺激素单克隆抗体人促甲状腺激素是脑垂体分泌的促进甲状腺生长和机能的糖蛋白激素。血液中人促甲状腺激素含量的异常变化会起机体产生一系列甲状腺疾病例如原发性甲状腺功能减退，甲状腺肿瘤及新生儿呆小症等。给社会和家庭带来了巨大伤害。因此，临床上将血清人促甲状腺激素含量作为评估甲状腺功能是否正常的首选指标。所以建立快速精确的人促甲状腺激素检测方法成为了预防甲状腺疾病的关键。目前检测人血清人促甲状腺激素常用方法均为免疫分析法：包括兔疫放射分析和酶联兔疫等。无论哪一种方法制备特性强灵敏度高的单克隆抗体才是实现精确检测的前提。采用杂交瘤技术取经兔疫的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经多轮阳性筛选和亚克隆得到能稳定高效分泌抗人促甲状腺激素单克隆抗体的杂交瘤细胞株

杂交瘤细胞培养上清液的浓1

-一、单克隆抗体免疫球蛋白类别及亚类的鉴定双向免疫扩散法鉴定McAb Ig类别及亚类：本方法最为准确，也较简便。被检的McAb样品一般均为杂交瘤细胞上清液，由于其中McAb的浓度较低，应先将其浓缩10倍左右再检测。小鼠腹水中的McAb（特异性Ig类）浓度虽然很高，但同时也含有小鼠本身的各类Ig，它们也会与相应抗血清发生反应，从而与特异性Ig相混淆，使鉴定结果出现混乱，即使将腹水稀释后再检测也不能完全避免上述情况的发生，因此一般不用含的腹水作为被检样品。杂交瘤细胞培养上清液的浓缩：先将杂交瘤细胞培养上清液离心，去除细胞及其碎品，然后选用下列方法进行浓缩。硫酸铵沉淀浓缩法：取5ml杂交瘤细胞培养上清也加入离心管中，逐滴加入饱和硫酸铵5ml,边加边摇，室温静置30min后，3000rpm离心15min，弃去上清液，假如0.5ml 0.01M pH7.4的PBS是沉淀溶解，并对该PBS透析除铵，-20℃冻存备用。双向免疫扩散： 1）将1%琼脂糖凝胶置沸水浴中溶化，铺制琼脂板 2）待琼脂凝固后，用孔径3mm的打孔器在琼脂板打出梅花形的小孔（中间1空，周围6孔），然后通过火焰数次（封底） 3）加样：有两种方式，一种是将被检样品加入中心孔，周围空中分别加入鼠各类或亚类的抗血清；另一种方式使将抗血清加入中心孔，而在周围空中加入各份被检样品。 4）加样后将琼脂板放入湿盒，置37℃水浴箱中12-24小时后观察结果。注意事项： 1）若在琼脂糖凝胶中加入分子量为6000的PEG（最终浓度为3%），可使沉淀线更为清晰。2）要获得清晰满意的沉淀线，关键还在于抗原与抗体（杂交瘤细胞培养上清液）的比例要合适，因此检测是要摸索抗原抗体加样浓度的比例，或者同时采用几种不同浓度的抗原和抗体进行鉴定。 3）每孔加样量以加满孔而又不溢出为宜，若有溢出，应立即用率只吸干，一面与其他孔的样品混淆。二、单克隆抗体亲和力的测定抗体亲和力是指抗体与抗原或半抗原结合的强度，其高低主要是有抗体和抗原分子的大小、抗体分子结合簇和抗原决定簇之间的立体构型的合适程度决定的。亲和力通常以平均内在结合常数（K）表示。在McAb的特性鉴定中，亲和力的测定是十分重要的，她可谓正确选择不同用途的McAb提供依据。例如在免疫学测定及建立各种检测犯法时，应选用亲和力高的McAb，以提高敏感性和特异性，并可节省试剂；但在亲和层析中作为免疫吸附剂时，则应选用亲和力适中的McAb，亲和力过低不易吸附，亲和力过高则不易洗脱。

单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的

单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（用选择培养基），第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。第一次筛选的原理和方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA合成油两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D 途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有S 途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。第二次筛选的原理和方法：在单克隆抗体的生产过程中，由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT 培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，是

单克隆抗体制备中杂交瘤细胞的两次筛选

单克隆抗体制备中杂交瘤细胞的两次筛选(资料) 单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d 左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S 途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这

杂交瘤细胞生产抗体技术细胞筛选

杂交瘤细胞生产抗体技术细胞筛选杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体检测。抗体检测的方法很多，通常根据所研究的抗原和实验室的条件而定。但作为杂交瘤筛选的抗体检测方法必须具有快速、准备、简便，便于一次处理大量样品等特点。因为往往有几百个样品需要在短短几个小时就报告结果，以便决定杂交瘤细胞的取舍。所以选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力。一般说来，在融合之前就必须建立好抗体检测方法，并克服可能存在的问题。另一个重要问题是抗体检测方法所需要的“动力学范围”，即检出背景以上的最强与最弱信号之比，依所用的检测抗原是否纯净而定。如杂交瘤抗体是针对纯化的蛋白质抗原的，100%的抗原参与反应，一个阳性/阴性判别系统就够了。另一方面，如果杂交瘤抗体是针对细胞表面微量的蛋白抗原，检测系统可能需要能测出微弱信号，则动力学范围至少应为10：1，最好为100：1。另外，检测方法的选择还受所需杂交瘤抗体的类型和预定的用途的影响。结合补体的抗体可以用基于细胞毒性反应的检测方法来选出。如需结合A蛋白的杂交瘤抗体，就要用结合蛋白A的检测方法。杂交瘤细胞的冻存与复苏（1）杂交瘤细胞的冻存在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故，如停电、污染、培养箱的温度或CO2控制器失灵等给正在建立中的杂交瘤带来灾难，通常尽可能早地冻存一部分细胞作为种子，以免遭到不测。在杂交瘤细胞建立以后，更需要冻存一大批，以备今后随时取用。细胞冻存的原理是细胞在加血清和二甲基亚砜的培养基中以一定的缓慢速度下降温度（0℃—— -20℃，每分钟下降1℃；-20℃—— -40℃每分钟下降2℃），可在-196℃液氮或液氮蒸气中长期保存。下面介绍我们实验室的细胞冻存方法，经几年来对多种细胞的使用，细胞复苏存活率均在80%以上。 A、材料： a. 带盖吸管筒一只（铝质或洋铁皮制），内壁（包括筒底和盖）衬1-2层石棉纸或石棉布。 b. 含10-20%血清、5-10% DMSO的HT培养基，冰浴降温至0℃左右（用作冻存液）。 c. 灭菌安瓶或带盖小瓶。 d. -70℃冰箱。 e. 液氮及液氮罐。 f. 处于对数生长中期、健康而活力好的杂交瘤细胞。 B、方法： a. 将杂交瘤细胞（或其他细胞）离心，重新悬浮于预冷的冻存液中，浓度为106-107左右

(精编资料推荐)单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理

……………………………………………………………专业资料推荐………………………………………………… 单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（用选择培养基），第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。第一次筛选的原理和方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA合成油两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。第二次筛选的原理和方法：在单克隆抗体的生产过程中，由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，是每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中的细胞分泌的抗体，上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，继续进行有限稀释，一般重复3-4次，直至确信每孔中增殖的细胞为单克隆细胞。第二次筛选也是鉴定的过程。 1

杂交瘤技术的单克隆抗体的制备方法

杂交瘤技术的单克隆抗体的制备方法冉继平摘要：本文主要介绍了单克隆抗体、杂交瘤技术以及运用杂交瘤技术制备单克隆抗体的步骤。还对三种（包括人促甲状腺激素单克隆抗体、绵阳早孕因子单克隆抗体、阿莫西林单克隆抗体）不同的单克隆抗体的制备方法和临床运用做了简单的介绍。关键词：单克隆、抗体、杂交瘤技术。 1.0 杂交瘤单克隆抗体的简介抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B 细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。杂交瘤单克隆抗体的原理是: B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂; 而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。杂交瘤技术产生单克隆抗体的步骤一.提取合成专一性抗体的单个B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。二.应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，得到杂交瘤细胞。这种细胞既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性三.对杂交瘤细胞进行细胞培养，选出所需要的细胞群，体外或体内培养，从培养液或动物腹水中提取单克隆抗体 2.0 单克隆抗体的实例单克隆抗体用于临床诊断和治疗，目前研究的单克隆抗体非常的多，下文就会介绍几种单克隆抗体的的应用实例： 2．1 人促甲状腺激素单克隆抗体人促甲状腺激素是脑垂体分泌的促进甲状腺生长和机能的糖蛋白激素。血液中人促甲状腺激素含量的异常变化会起机体产生一系列甲状腺疾病例如原发性甲状腺功能减退，甲状腺肿瘤及新生儿呆小症等。给社会和家庭带来了巨大伤害。因此，临床上将血清人促甲状腺激素含量作为评估甲状腺功能是否正常的首选指标。所以建立快速精确的人促甲状腺激素检测方法成为了预防甲状腺疾病的关键。目前检测人血清人促甲状腺激素常用方法均为免疫分析法：包括兔疫放射分析和酶联兔疫等。无论哪一种方法制备特性强灵敏度高的单克隆抗体才是实现精确检测的前提。采用杂交瘤技术取经兔疫的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经多轮阳性筛选和亚克隆得到能稳定高效分泌抗人促甲状腺激素单克隆抗体的杂交瘤细胞株由于人促甲状腺激素单克隆抗体的成功制备，成为了医学临床上检测甲状腺疾病的有效方法，是预防甲状腺疾病的关键。 2．2 绵阳早孕因子单克隆抗体在养殖生产中及时进行妊娠诊断,减少空怀发生,是提高生产效率的重要技术措施之一。目前,绵羊妊娠诊断周期长、效率低,需要探索一种快速、高效、简便的新方法。为此,制备