患病黄额闭壳龟中产酸克雷伯菌的分离与鉴定
第42卷第3期Vol.42No.3
淡水渔业Freshwater Fisheries
2012年5月May 2012
收稿日期：2012－02－28；修订日期：2012－03－26资助项目：公益性行业（农业）科研专项（201203086）第一作者简介：周
勇（1984－
），男，湖北荆州人，硕士，主要从事水产养殖病害研究。E-mail ：zhouyong125@https://www.360docs.net/doc/7e9590243.html,
通讯作者：曾令兵。E-
mai ：zenglingbing@https://www.360docs.net/doc/7e9590243.html, 患病黄额闭壳龟中产酸克雷伯菌的分离与鉴定
周勇1，曾令兵
1，2，3
，李瑞伟2，高正勇3，孙建滨3，范玉顶1（1.中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉430223；
2.上海海洋大学水产与生命学院，上海201306；
3.华中农业大学水产学院，武汉430070）
摘要：从患病黄额闭壳龟（Cuora galbinifrons ）肝脏中分离到一株致病菌HE01，经人工感染健康巴西龟，可复制与自然发病相同的症状，且从人工感染病龟体内再次分离到相同的病原菌。经Biolog 微生物自动鉴定系统的鉴定，以及进一步的16S rDNA 基因序列和系统发育分析都表明，此致病菌为产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca ）。药物敏感性试验表明，该菌株对头孢噻肟、头孢曲松、头孢哌酮等10种药物高度敏感。
关键词：黄额闭壳龟（Cuora galbinifrons ）；产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca ）；分离鉴定；药敏试验中图分类号：S943
文献标识码：A
文章编号：1000-
6907-（2012）03-0038-06Isolation and identification of Klebsiella oxytoca from diseased
Cuora galbinifrons
ZHOU Yong 1，ZENG Ling-bing 1，2，3
，LI Rui-wei 2，GAO Zheng-yong 3，
SUN Jian-bin 3，FAN Yu-ding 1
（1.Yangtze River Fisheries Research Institute ，Chinese Academy of Fishery Sciences ，Wuhan 430223，China ；
2.College of Fisheries and Life Science ，Shanghai Ocean University ，Shanghai 201306，China ；
3.College of Fisheries ，Huazhong Agricultural University ，Wuhan 430070，China ）
Abstract ：A bacterial strain HE01was isolated and identified from diseased Cuora galbinifron .Infection with the bacterial suspension to healthy red －ear slider could reproduce the diseased symptoms as occurred naturally and the same bacterium could be recovered from these infected C .galbinifron .Identification by the Biolog Microbial Identification System ，and fur-ther 16S rDNA sequence and phylogenetic analysis demonstrated that the bacterium isolated from diseased C .galbinifron was Klebsiella oxytoca .The susceptibility test to antibiotics demonstrated that the bacterial strain HE01was highly suscepti-ble to cefotamine ，ceftriaxone ，cefobid ，and so on.
Key words ：Cuora galbinifrons ；Klebsiella oxytoca ；isolation and identification ；antibiotic susceptibility test
黄额闭壳龟（Cuora galbinifrons ）又叫“黄额盒
龟”
，隶属于龟科（Emydidae ）闭壳属（Cuora ），国内主要分布于广东、广西以及海南，国外分布在越
南、老挝等地
［1－2］
。中国是黄额闭壳龟主要的消费国，大量黄额闭壳龟被食用或药用。黄额闭壳龟的
人工饲养十分困难，主要是因为该龟种适应环境能力欠佳，在养殖过程中容易患病死亡。目前，关于黄额闭壳龟的研究主要集中在形态分类、地理分布、人工饲养及贸易等方面
［3－4］
，有关黄额闭壳龟
的病害防治技术研究鲜有报道。
2012年，武汉某养殖户处于冬眠状态的黄额闭壳龟发病，患病龟从冬眠状态苏醒，体质消瘦，舌部发白，加温饲养发现病龟拒食、活动少、精神不振，几天后死亡。解剖后发现体腔及肠道内大量胀气、少量腹水、消化道粘膜充血，其他器官未发现明显的病变。于无菌条件下从病龟肝脏组织中分离培养出细菌一株，对健康巴西龟进行人工感染试验可复制与自然发病黄额闭壳龟相同的症状，确定
其致病性。经Biolog微生物自动鉴定系统的鉴定和分子生物学检测确定，该致病菌为产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）。药物敏感性试验显示，该菌对头孢类抗生素高度敏感。本项研究为龟类细菌性疾病的防控技术研究奠定了一定的基础。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验动物
患病黄额闭壳龟采集于武汉某养殖户，腹甲长10cm。用于感染试验的健康巴西龟购于武汉堤角花鸟大世界，平均体重为（20?1.0）g，暂养在60cm?40cm?20cm塑料箱内，养殖用水为充分曝气的自来水，一周后用于感染试验，试验控制水温（25?1）?。
1.1.2主要试剂和仪器
BHI（BD，Becto TM Brain Heart Infusion），PCR 产物纯化试剂盒（Promega，Wizard Sv Gel and PCR Clean up System），药敏试剂盒（杭州天和微生物试剂有限公司），全自动微生物鉴定仪（Biolog，Bi-olog GENⅢ，USA），生物安全柜（ESCO，ClassⅡBSC，Singapore），离心机（SiGMA，3K15，Germa-ny），化学发光成像与分析系统（BiO－RAD，ChemiDoc TM XRS+，USA），PCR仪（Biometra，T －professional，Germany），生化培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司，Spx－250BS－Ⅱ），透射电子显微镜（Hitachi，H－7650，Japan）。
1.2致病菌分离与培养
取濒死黄额闭壳龟，用70%酒精消毒体表，在生物安全柜中无菌操作取肝脏于BHI琼脂平板上划线接种，置30?培养，24h后挑取形态特征一致的优势菌落在相同的条件下作纯培养，并挑取菌株通过负染法于电镜下观察其形态［5］。纯培养物接种BHI液体培养基扩大培养，培养菌液分装到冻存管中加甘油（终浓度25%）于－80?保存备用。菌株编号为HE01。
1.3人工感染试验
取保存的菌种接种于BHI培养液中，培养24h 后4000g离心集菌，所得菌体用无菌PBS离心洗涤3次，McFarland比浊法结合平板菌落计数法测定细菌浓度，并调整细菌浓度为1?109CFU/mL，10倍梯度稀释得到1?108CFU/mL、1?107CFU/ mL和1?106CFU/mL，共4个浓度梯度用于健康龟的注射感染试验。巴西龟的注射感染试验：取暂养1周后的健康巴西龟随机分成5组，每组30只，4个试验组以0.2mL/只的剂量分别腹腔注射4种浓度的菌悬液，对照组以0.2mL/只的剂量腹腔注射PBS。每天观察记录死亡情况。取人工感染死亡的巴西龟进行细菌的分离和鉴定，以确定所分离的病菌的致病性。
1.4微生物鉴定
取经过纯培养BHI固体培养基纯培养的HE01菌株采用单菌落划线接种于BUG鉴定平板上，30?培养16 24h，待菌落大小适宜时，取Biolog 细菌鉴定试剂盒IF－A接种液，将管外壁擦拭干净，置于Biolog浊度仪中，调整其读数为100%T；用无菌棉签蘸取适量的单菌落至接种液中，使浊度仪读数在92% 98%T之间，用8孔排枪将混合液转移至GENⅢ鉴定板中，每孔100μL，将鉴定板装载于Biolog系统中培养，系统自动读数并输出鉴定结果。
1.516S rDNA序列的扩增和测定
取保存的菌种接种BHI液体培养基，30?培养24h离心集菌。参照GenElute Bacterial Genomic DNA Kit使用说明书提取细菌总DNA。用于16S rDNA序列扩增的引物为细菌的通用引物，上游引物为：CACGGA TCC AGA GTT TGA T（C/T）（A/C）TGG CTC AG，下游引物为：GTG AAG CTT AGG G （C/T）T ACC TTG TTA CGA CTT。采用50μL反应体系进行PCR扩增：10?PCR Buffer5μL，dNTP （10mmol/L）1μL，Primers（F/R，10μmol/L）各1μL，r Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，DNA模板为1μL，ddH2O补足至50μL。PCR扩增程序为：95?预变性5min；95?变性1min，55?退火1min，72?延伸2min，30个循环；72?延伸10min。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收试剂盒回收，送上海生工生物工程有限公司测序。
1.6序列同源性分析及系统发育树的构建
将测得菌株的16S r DNA序列通过NCBI的Blast检索系统进行序列同源性分析。检索出相似较高的序列采用Clustal X（1.83）进行多序列匹配排列（Multiple Alignments）。参照文献［6］使用MEGA4.0软件，采用邻接法（Neighbor－joining method）构建系统发育树，并通过1000次的自举分析（boos trap）进行置信度检测。
1.2.6药敏试验
采用纸片扩散法（K－B法）进行药敏性试验。
93
第3期周勇等：患病黄额闭壳龟中产酸克雷伯菌的分离与鉴定
取100μL 新鲜菌悬液（浓度约1?107
CFU /mL ）均匀涂布于BHI 固体培养基上，用无菌镊子将35种药敏纸片均匀贴在平板上，30?培养24h 后测量
抑菌圈直径。
2
结果
2.1
致病菌分离镜检结果
从患病黄额闭壳龟的肝脏中分离到一株优势菌。该菌株在BHI 培养基上30?培养24h
后出现
图1负染法观察菌株
菌落大小为1 2mm ，圆形，边缘整齐，半透明，乳白色或淡黄色，有光泽菌落。负染染后电镜观察，该菌株呈杆状，周身鞭毛（图1）。2.2人工感染试验结果
人工感染试验结果见表1。由表可知，菌液浓
度为1?106CFU /mL 和1?107
CFU /mL 组注射巴
西龟，在染毒后7d 内没有出现死亡；1?108
CFU /mL 组巴西龟在8d 内累积死亡率达到15%；
1?109CFU /mL 组巴西龟在8d 累积死亡率达到55%，说明该菌株对巴西龟具有一定的致病性。人工感染死亡的巴西龟解剖后，腹腔有少量腹水，体腔及肠道内有胀气，消化道粘膜有轻微充血。2.3
Biolog 全自动微生物鉴定仪的鉴定结果从患病黄额闭壳龟、人工感染死亡的巴西龟中分离的细菌经Biolog 全自动微生物鉴定系统鉴定为同一种细菌。菌株HE01的鉴定结果表明，该菌株为产酸克雷伯菌的可能性达85%。各项参数为：
PROB =0.85；SIM =0.525；DIST =4.807。具体的反应项目及结果见表2。
表1HE01对巴西龟人工感染试验结果
Tab.1
Results of artificial infection of HE01in red －ear slider
组浓度/（CFU /mL ）实验龟数量
/只注射剂量/mL 不同时间死亡数4d 5d 6d 7d
8d 死亡率
/%11?109200.23620055.021?108200.20210015.031?107200.2000000.041?106200.2000000.0对照
PBS
20
0.2
0.0
表2HE01菌株的Biolog 鉴定结果
04淡水渔业2012年
注阳性阴性正失配负失配临界值少于对照组
2.416S rDNA序列分析及系统发育树的构建
用细菌16S rDNA通用引物PCR扩增获得该
菌株的16S rDNA基因片段（图2），对此片段进行
回收、测序，得到1449bp的序列。将测序所得序
列输入到NCBI进行Blast检索，发现HE01菌株与
克雷伯菌属（Klebsiella）细菌的16S rDNA序列自然
聚类。在最相近的100个序列中，克雷伯菌属细菌
占60%，肠杆菌属细菌占40%，HE01与它们的同
源性为99% 100%，从中选择同源性较高的克雷
伯菌属以及其他属细菌的16S rDNA基因序列，并
以假单胞菌属细菌（Pseudomonas sp）为外群，进行
分子系统发育分析。结果如图3所示，菌株HE01与Klebsiella oxytoca（HE650838.1）和Klebsiella pneu-moniae（AB680619.1）聚合，且置信度高达100%。
图2菌株16S rDNA基因PCR扩增
Fig.2PCR product of16S rDNA gene of strain HE01 M：DNA Marker DL2000；1：阴性对照；
2：菌株16S rDNA基因PCR扩增产物
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第3期周勇等：患病黄额闭壳龟中产酸克雷伯菌的分离与鉴定
图3以菌株HE01的16S rDNA基因序列构建
的系统发育树
Fig.3Phylogenetic tree of K.oxytoca based on16S r DNA gene sequence of strain HE01.2.5药敏试验结果
药敏试验结果见表3。药物敏感试验表明，该菌株对头孢噻肟、头孢曲松、头孢哌酮等10种药物敏感；对头孢呋肟、哌拉西林、阿米卡星、氯霉素等8种药物中度敏感；对四环素、克林霉素、红霉素、克拉霉素等17种药物不敏感。与已报道的其它动物分离出的产酸克雷伯菌的药敏试验进行了对比，发现虽然同为产酸克雷伯菌，但不同生物来源的菌株对药物的敏感性不尽相同，但是不同来源的菌株均对庆大霉素敏感（表4）。
表3药物敏感性试验结果
表4本研究与其他药敏试验结果比较
Tab.4Comparison of antibiotic sensitivity test results of this study and others
来源产酸克雷伯菌孔雀［7］鸡［8］人［9］
阿米卡星I－－S
卡那霉素I S S S
氟哌酸R I－－
环丙沙星S I－S
庆大霉素S S I S
氯霉素I R S S
四环素R R R－
先锋V R－－S
链霉素R R－－
氨苄青霉素R－－R
青霉素G R R R－
红霉素R－R－
注：S为敏感；I为中度敏感；R为耐药；“－”本试验使用的抗生素他人未使用。
24淡水渔业2012年
3讨论
产酸克雷伯菌是革兰氏阴性短杆菌，需氧或兼性厌氧，属于肠杆菌科，电镜下观察两端钝圆、无芽孢、外有荚膜包围。克雷伯菌属包括5个种，即肺炎克雷伯菌（含3个亚种：肺炎亚种、鼻臭亚种、鼻硬结亚种）、产酸克雷伯菌、土生克雷伯菌、植生克雷伯菌及变形克雷伯菌。后3个种是新近发现的，致病力低［10］。据报道，在多种动物体内分离到该菌属的细菌，如肺炎克雷伯菌引起鸭［11］、仔猪［12］、竹鼠［13］、鸡［14］以及大熊猫［15］等发病，产酸克雷伯菌可引起抗生素相关性出血性结肠炎（antibiotics－associated hemorrhagic colitis，AHC）［16］，引发乌骨鸡和孔雀患病，但该菌引发龟发病还属首例报道。本次试验中分离到产酸克雷伯菌可导致腹腔有少量腹水，体腔及肠道内有胀气，消化道粘膜有轻微充血等症状，人工感染试验证明其对巴西龟有一定的致病性。
借助Biolog全自动微生物鉴定系统进行生化检测，进一步确定分离得到的菌株就是产酸克雷伯菌。Biolog全自动微生物鉴定系统（Omilog GEN Ⅲ）鉴定结果具有准确、迅速、不依赖手工操作等特点，显著优于常规的生理生化鉴定方法［17］。在Biolog鉴定结果中，DIST和SIM是最重要的两个值。DIST值表示鉴定结果与数据库相应的数据条的匹配程度，DIST≤5.0时匹配良好。在获得良好鉴定结果时，SIM值在培养4－6h时应≥0.75，培养16－24h时SIM值应≥0.50。在本项研究的细菌鉴定中，DIST值为4.807，SIM值为0.525，表明鉴定结果准确。而与产酸克雷伯菌同属的肺炎克雷伯菌在鉴定结果中的数值分别是，DIST值为8.830，SIM值为0.017。系统计算出该菌为产酸克雷伯菌的可能性是85%，而肺炎克雷伯菌的可能性为3.7%。结合16S rDNA基因序列比对结果和Biolog全自动微生物鉴定系统结果确定该菌为产酸克雷伯菌。
药物敏感性试验结果对黄额闭壳龟的产酸克雷伯菌感染症的防治提供了一些科学依据。而黄额闭壳龟产酸克雷伯菌与其它水产生物来源的产酸克雷伯菌的药敏结果不尽相同，在本实验中我们还发现，所选35种药物中有17种对该菌株不敏感，这可能与生物体不同有关系，也可能与滥用药物导致菌株抗药性改变有关，这无疑给该菌的药物防治带来了困难。针对不同生物来源的菌株进行针对性的药物筛选试验，选择最有效的药物进行治疗或预防，可防止细菌抗药性的产生。
黄额闭壳龟养殖业的规模在不断地发展，然而对其病害的研究很少，而采用先进仪器设备以及分子鉴定的方法对黄额闭壳龟细菌性病原进行系统研究的结果更是缺乏。本试验首次从黄额闭壳龟中分离到了产酸克雷伯菌，并确定了其致病性，为黄额闭壳龟病害防治提供了科学依据。
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第3期周勇等：患病黄额闭壳龟中产酸克雷伯菌的分离与鉴定
(推荐)植物病原菌的接种
实验五植物病原物的接种 一、实验目的 人工使病原物与寄主植物感病部位接触，创造条件使病原物侵入并诱致寄主发病叫接种，接种是证病过程的重要步骤，在研究寄生现象发病规律，测定品种抗病性，药剂防病效果时都需要接种。因此，接种是植病工作者必须掌握的基本技术环节。 植物病害人工接种方法，是根据病害的传染方式和侵染途径设计的，植物病害的种类很多、其传染方式和侵染途径各异。因此接种方法也不相同。本次实验以玉米大斑病，小麦根腐病，小麦秆锈病，梨褐腐病等为内容学习常用的接种方法。 二、内容、材料和方法 (一)拌土法(小麦根腐病) 拌土法适于土壤传染的病害，方法是将消毒的土壤分别装入两个小花盆中，其中一盆表层覆以一厘米厚的菌土，菌土是用玉米砂培养菌1份加消毒土5份混合而成，另一盆不接种(不覆菌土)作为对照。将经0.1%升汞表面消毒3分钟并用无菌水洗3次的小麦种子，分别播种在两个花盆内，插上标牌，注明接种日期，方法病害名称及接种人姓名，花盆放在室温下，浇水保湿，遮阴管理，待幼苗出土展开叶子后(大约一周)，观察并记载根腐病发生情况。 (二)喷雾法(玉米大斑病) 气流及雨水传播的病害常用此法接种，将培养好的玉米大斑病的斜面
菌种一支，用移植钩刮于装有100毫升无菌水的三角瓶中，用力振荡，待孢子洗下后，以纱布过滤，并于滤液中加入
0.1克中性肥皂，即成孢子菌丝悬液，用卫生喷雾器均匀喷布在麦苗上。同时设一不喷菌液而喷无菌水的作对照，用塑料罩保湿48小时，揭布后正常管理，7天后作发病调查。 (三)涂抹法(小麦秆锈病) 这也是气流传播的病害常用的接种方法，用于禾本科锈病接种。方法是用姆指沾锈菌夏孢子悬液自下向上轻轻涂欲接种的小麦叶片，也可先用手指沾水摩擦叶片，使叶表有一层水膜，然后将夏孢子粉抹在上面，以不涂抹孢子悬液或孢子粉的作为对照。塑料罩保湿48小时后揭布，正常管理，7天后作发病调查。 (四)创伤接种法(白菜软腐病及梨褐腐病) 创伤接种法是伤口侵入的弱寄生菌常用的接种方法。 1.白菜软腐病：取切成适当大小的白菜帮两块、经水洗，待水稍干后，以10%漂白粉溶液作表面消毒，分放在两个灭过菌的上下铺有吸水纸的培养皿中，用酒精擦过的玻璃棒顺着白菜帮打三排不穿透的孔穴。将培养好的白菜软腐病菌斜面菌种的菌苔以无菌水洗下作成菌悬液。然后，先以灭过菌的兽用注射器吸取无菌水滴于菜帮的第一排内孔作为对照，再用该注射器吸菌液滴于第二、三排孔内。注意无论无菌水、还是菌液都不要滴的过多。以免流出孔穴，另一培养皿的菜帮以同法处理作为重复。盖好皿盖，置于26—28℃的温箱中，24小时后检查发病情况。 2.梨褐腐病：取白梨以酒精火焰表面消毒后，用炽热的解剖刀，在其上切成小手指粗的孔穴3
几种真菌的分离与鉴定教学文案
常见真菌的分离与鉴定 病原真菌的一般特性 真菌（Fungi）是微生物中的一个大类，是一群数目庞大的细胞生物，估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的子实体小者用显微镜才能见到，大者可达数十厘米，它们共同特征是具有真正的细胞核，产生孢子和不含叶绿素，以寄生或腐生等方式吸取养料，仅少数类群为单细胞，其他都有分支或不分支的丝状体，能进行有性或无性繁殖，具有纤维素（或其他葡聚糖）或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。对人类和动物致病的真菌大约100余种，属于病原真菌。 一、基本性状 （一）形态结构 真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类，前者属于酵母菌（yeast）一般呈球形或卵圆形，后者称为霉菌（mold）或丝状真菌，呈丝状分枝，菌丝交织象绒球状，另有一些真菌可因寄生环境及培养条件（养料、温度、氧气等）的不同可交替出现两种形态，即在室温中呈霉菌型，在37℃或体内呈单细胞的酵母型，这类真菌有双相性，所以称之为双态真菌或二相真菌。 真菌的细胞结构与一般植物细胞相似，有定型的细胞核及完善的细胞器，但胞壁与细菌胞壁不同，不含粘肽而是由角质及葡聚糖组成，也含有脂多糖蛋白质，其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖，不生长真菌丝，革兰氏染色呈阳性，丝状真菌分菌丝及孢子两部分，形态多种多样，分述如下。 1．菌丝（Hypha）真菌在合适的环境中，由孢子生出嫩芽，称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状，称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝，增殖的菌丝交织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生的物体或培养基中吸取养料，称为营养菌丝体。另一部分菌丝向空间生长，称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子者称为生殖菌丝体。菌丝中各个细胞间有明显分隔者，称为有隔菌丝。主要见于病原性真菌。很多非病原真菌的菌丝无明显分隔，称为无隔菌丝。有些菌丝可呈各种特殊形式，如球拍状、破梳状、螺旋状、结节状、关节状、鹿角状、假菌丝。 2．孢子生成孢子是真菌扩大繁殖的一种方式。真菌孢子的抵抗力、形态及作用等均与细菌芽胞不同，分为无性孢子及有性孢子两大类。不经过两性细胞的结合而形成的孢子叫无性孢子，这一繁殖过程称为无性繁殖。常见的无性孢子有5种：关节孢子、厚壁孢子、孢子囊孢子、芽孢和分生孢子。病原真菌属于不完全菌纲，很少产生有性孢子，大多数是无性孢子。 （1）厚壁孢子：当真菌在不利环境中，由菌丝内胞浆缩浓和胞壁增厚而成，呈圆形。当环境好转时可生成芽管成长为菌丝。
植物病原菌分离方法
病原菌分离方法 一、实验原理： 植物患病组织内的真丝菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除了个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养，重染病植物组织中将病原真菌与其他杂菌相分开并从寄主植物中分离出来，再将分离得到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病原的分离培养。 二、实验用具： 酒精灯、手术剪、镊子、75%酒精、3%~5%次氯酸钠、灭菌水、培养皿、封口膜、乳酸等 三、实验前的准备工作： 1、煮培养基（PDA）：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂粉(AGAR)20g（10:1:1）水1000ml （1）将去皮称量好的马铃薯切片后加水煮沸15~20min（水可以适量多加200ml 左右，因为在煮的过程中会蒸发一些），待土豆煮软即可。 （2）三层纱布滤去马铃薯后将过滤的水倒入洗净的锅中，加琼脂粉搅拌充分后再加热煮沸，小火使其充分融化。 （3）加入葡萄糖并不断搅拌，待其完全融化后双层纱布过滤，定容到1000ml，分装到500ml的玻璃瓶内，每个玻璃瓶最多装300ml，121℃湿热灭菌 30min。 2、培养皿干热灭菌170℃1h;蒸馏水、枪头等湿热灭菌121℃30min。 四、实验步骤： 1、用75%酒精擦拭超净工作台，所有器具用紫外灯灭菌30min,分离室要保持清洁。 2、取样，病斑大小约20个（含病缘线） 3、分装培养基：（1）融PDA，松盖在微波炉中加热约3min（看量多少而定） （2）待冷却至50℃后在超净工作台指示灯显绿灯时分装 (3) 分装时滴入一管乳酸约20滴（每10ml培养基中加3滴乳酸） （4）左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基 约15m1(300ml一瓶的培养基倒20多个平板)，加盖后轻轻摇动培 养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝
植物病原菌分离方法
第四章植物病原菌分 离与纯化 植物病原菌 一、植物病原菌分离流程 二、分离的准备 ?分离的准备工作 无菌室操作前保持清洁无菌 接种工作准备 培养基的准备 ?分离材料选择 以收获的材料从病健交界处采样 果实腐烂从开始腐烂处分离 根腐和枯萎层可能从离土较远处分离
有些枯萎如野火病被固定在局部，从病斑边缘分不到等 有些材料污染严重时可先接种再分离：即将病组织接种到健康材料等 发病后分离 ?组织表面消毒 ⑴升汞：1‰ ◆升汞1g HCl(浓)25ml 水1000ml ◆升汞先溶于盐酸中，加水后稀释，也 可用NaCl 5g/L 代替盐酸，但易沉淀 ◆作用：盐酸，NaCl增加溶解度，HCl 能增强杀菌能力。 ◆处理时间：30’S-30min不等，常3 －5min；所需时间因材料不同而异， 消毒后灭菌水3－5次 附在组织表皮的气泡，含使消毒剂不能与寄生表面直接通气影响消毒 效果，除气泡抽气、70％酒精浸2 －3秒
⑵漂白粉 ◆常用表面消毒剂适用于病组织表面消 毒，也可处理种子 ◆成分：漂白粉10g，水140ml，过滤后使 用。 ◆最好现配现用，放久失效，有效成分 CaClO次氯酸钙 ◆好的消毒液易使有色纸褪色，且产生氯 气有强烈臭味。 ◆一般3－5min，时间长短因材料不同而 不同。处理种子5－10min，长的可达20 －30min。 优点：杀菌能力强，具有挥发性，不会遗留在组织上影响分离结果，其杀菌能力小于升汞。 （3）酒精：70％，浸很短时间（几秒到1min）灭菌水洗。 ◆较大的材料在酒精中浸或棉花 擦，然后在火焰烧去。 ◆幼嫩的病组织，表面用药剂消毒 时可能会同时杀死其中的病原真
痢疾杆菌分离与鉴定培训
痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。 据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国
宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容： 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据； 缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍； 志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大； 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化； 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分
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实验十三植物病原真菌的分离培养 一、实验原理 植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。 二、实验目的： 植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。 三、实验材料及准备： 1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。 2．分离用具（每小组为单位）
酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿 （Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。 四、实验方法及步骤： （一）、分离前的准备工作： 1．工作环境的清洁和消毒 分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。工作前擦净桌面，最好铺上湿纱布。将所需用的物品按次序放在工作台上，避免工作时走动，工作人员最好穿上灭菌后的工作服，带上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或%新洁尔灭擦手。 2．分离用具的消毒 凡是和分离材料接触的器皿（刀、剪、镊、针等）都要随时（至少在使用时）保持无菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3次（刀、剪、镊等不宜在灯焰上烧时过长，以防退火）。再次使
植物病原真菌的分离培养
实验十三植物病原真菌的分离培养 一、实验原理 植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。 二、实验目的： 植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。 三、实验材料及准备： 1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。 2．分离用具（每小组为单位） 酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）0.1%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。 四、实验方法及步骤： （一）、分离前的准备工作： 1．工作环境的清洁和消毒 分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。工作前擦净桌面，最好铺上湿纱布。将所需用的物品按次序放在工作台上，避免工作时走动，工作人员最好穿上灭菌后的工作服，带上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新洁尔灭擦手。 2．分离用具的消毒 凡是和分离材料接触的器皿（刀、剪、镊、针等）都要随时（至少在使用时）保持无菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3次（刀、剪、镊等不宜在灯焰上烧时过长，以防退火）。再次使用时必须重复灭菌。培养皿、试验等要
病原菌的分离培养和纯化
普通植物病理学 实验十七、病原菌的分离培养和纯化 一、目的要求 (1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。 (2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。 (3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。 二、基本原理植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。 三、材料、仪器与用具 1．材料(依当地情况进行选择，下列材料供参考) (1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyricularia orycae)。 (2)玉米大斑病叶(exserohilum turcicum)。 (3)玉米弯孢菌叶斑病叶(curvularia lunata)。 (4)玉米小斑病叶(bipolaris maydis)。 (5)番茄灰霉病果(botrytis cinefca)。
(6)黄瓜菌核病果(sclerotinia sclerotiorum)。 (7)黄瓜细菌性角斑病叶(pseudomonas syringaepv．1achrymans)。 (8)水稻白叶枯病叶(xanthomonas campestms pv.oryeue)。 (9)大豆细菌性斑点病叶(pseudomonas syringaepv．glycinea)。 (10)白菜软腐病叶(erudnia carotovora subsp．carotovora)。 2．培养基pda培养基；肉膏蛋白胨培养基；加寄主组织煎汁的培养基等。 3．仪器与用品超镜工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、接种环(铒)、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、铝锅等。0．1％升汞溶液配制：升汞1e 浓盐酸2．5ml 蒸馏水1000ml。先将升汞溶于盐酸中，待充分溶解后，再加水稀释。升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心。 四、实验操作 (一)病原真菌的分离 1．组织分离法按照以下步骤进行： (1)取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名。提示：为了保证无菌操作，应注意下面几点：工作前最好将所需的物品都放在超净工作台内，工作中临时去取容易带来杂菌；保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；工作中，特别在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。 (2)用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1--2滴(可减少细菌污染)，然后将融化而冷至60c 左右的pda培养基倒人培养皿中，每皿倒10--15ml，轻轻摇动使之成平面。凝固后即成平板培养基。提示：加入25％乳酸1～2滴，可基本保证平板上不出现污染细菌苗落。除乳酸外，在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长，也是常用的方法。加青霉素(20μg／ml)可以抑制g+细菌生长；加多黏霉素b(5．0μg／ml)可以抑制g—细菌生长；加链霉素(40μg ／ml)或氯霉素(50μg／ml)可以抑制大部分细菌的生长。除了氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45c左右(以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)’时
病原菌的分离鉴定及其疫苗的制备
一、实验目的 熟悉水产细菌性病原的分离、培养、纯化与鉴定的基本方法，了解所分离细菌性病原的形态特征及培养特点，了解细菌性灭活疫苗制备的基本过程。 二、实验材料 患白内障病虎纹蛙（或其他患细菌性疾病的水产动物）、健康虎纹蛙、脑膜炎败血黄杆菌（虎纹蛙白内障病的病原） 三、实验药品、用具 2216E 琼脂平板、 2216E 琼脂斜面、福尔马林、无菌蒸馏水、生理盐水、磷酸缓冲液、接种环、解剖刀、剪刀、镊子、滴管、纱布、白瓷盘、酒精棉球、灭菌试管、 96 孔板、注射器、酒精灯、离心机（包括离心管）、水族箱、记号笔 四、实验操作程序 （一）病原菌的分离与鉴定 1 ．培养基的制备 （ 1 ）普通肉汤培养基： 按以下剂量称取各种试剂（先称取盐类再称蛋白胨及牛肉膏），置于铝锅或搪瓷缸中。 牛肉膏 5g 磷酸氢二钾 1g 蛋白胨 10g 蒸馏水 1000ml 氯化钠 5g pH 7 . 4 ～ 7 . 6 初配好的培养基呈酸性故要用 NaOH 调整。将 pH 测定后的肉汤培养基用滤纸过滤，将过滤好的肉汤分装试管、盐水瓶、三角烧瓶等容器，待灭菌。 （ 2 ）普通营养琼脂培养基 普通肉汤 1000ml
琼脂 20g 琼脂是由海藻中提取得一种多糖类物质，对病原性细菌无营养作用，但在水中加温可融化，冷却后可凝固。在液体培养基中加入琼脂 1 . 5 ～ 2 ％即可固定培养基，如加入 0 . 3 ～ 0 . 5 ％则成半固体培养基。 将称好的琼脂加到普容肉汤中，加热煮沸，待琼脂完全融化后，将 pH 调至 7 . 4 ～ 7 . 6 。琼脂融化过程中需不断搅拌，并控制火力，不使培养基溢出或烧焦，并注意补充蒸发掉的水份。 加热溶解好的培养基可用滤纸进行过滤，固体培养基要用 4 层纱布趁热过滤（切勿使培养基凝固在纱布上），之后按实验要求，将配制好的培养基分装入试管或三角瓶中，包扎好待灭菌，将培养基置于高压蒸汽锅内，121 ℃ 灭菌 15 ～ 30min ，趁热将试管口一端搁在玻棒上，使之有一定斜度，凝固后即成普通琼脂斜面，也可直立，凝固后即成高层琼脂。 盐水瓶中的普通琼脂以手掌感触，若将瓶紧握手中觉得烫手，但仍能握持者，此即为倾倒平皿的合适温度（ 50 ～60 ℃ ），每只灭菌培养皿倒入约 15 ～ 20ml ，将皿盖盖上，并将培养皿于桌面上轻轻回转，使培养基平铺于皿底，即成普通琼脂平板。 培养基中的某种成分，如血清、糖类、尿素、氨基酸等在高温下易于分解、变性，故应过滤除菌，再按规定的量加入培养基中。 2 ．病原菌的分离与培养 分离病原菌的材料要求是具有典型患病症状的活的或刚死不久的患病生物，病原菌的分离方法如下。 体表分离：先将病灶部位表面用 70% 酒精酒精棉球擦拭消毒或取病灶部分小片或用经酒精灯灼烧的解剖刀烫烧消毒，再用接种环刮取病灶深部组织或直接挑取部分深部患病组织，接种于普通肉汤培养基增菌或直接在普通琼脂平板上划线分离。 内部组织器官：用 70 ％酒精浸过的纱布覆盖体表或用酒精棉球擦拭，进行体表消毒，无菌打开病鱼的腹腔，以肝、肠、心脏等脏器为材料，先将拟分离病原的部位表面用 70% 酒精棉球擦拭或用经火焰上灼烧
病原菌分离培养总结
病原菌的分离培养方法 一、基本原理 植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。 植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。 为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。 二．病原真菌的分离培养（花生褐斑病为例） 1.分离的准备工作 （1）分离材料准备：花生褐斑病叶片：病斑圆形或近圆形暗褐色、黑褐色，淡黄色晕圈。背面有许多黑色小点，呈同心轮纹状排列。 （2）培养基的准备: PDA培养基,加热熔化，紫外灭菌后倒板； （3）分离工作仪器与用品：超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等。（升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心）。 2.组织分离法 （1）工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。 （2）酒精灯放入中间合适位置，点燃后不要在移动，保证火焰周围无菌环境； （3）取花生褐斑病的症状典型病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块病组织数块。 （选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。 腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑 点病害应在临近健全组织的部分分离。）
病原菌分离培养总结
病原菌得分离培养方法 一、基本原理 植物病原菌得分离培养，就是植物病理实验室工作中得基本技能。为了获得某微生物得纯培养,一般就是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同,而供给它们适宜得生活条件,即让病原菌生活在适宜得培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长,而抑制其她菌生长得环境,从而得到纯菌株. 植物病原真菌得分离方法主要有组织分离法与稀释分离法两种.最常用得方法就是组织分离法,而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子得病原真菌得分离。 为了获得分离菌得纯培养,必须要进行分离菌得纯化，纯化得方法类似于分离工作中采用得稀释分离法或划线分离法。 二．病原真菌得分离培养（花生褐斑病为例) 1.分离得准备工作 （１)分离材料准备:花生褐斑病叶片：病斑圆形或近圆形暗褐色、黑褐色,淡黄色晕圈。背面有许多黑色小点,呈同心轮纹状排列。 (2)培养基得准备：PDA培养基,加热熔化,紫外灭菌后倒板； （３)分离工作仪器与用品:超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针）、７0％酒精、0。1%升汞、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等。（升汞就是剧毒药物,在操作时应特别小心)。 2.组织分离法 （1）工作前用肥皂洗手,无菌操作前还要用７0%酒精擦拭双手;在使用无菌操作间时，呼吸要轻,不要说话。 （2）酒精灯放入中间合适位置,点燃后不要在移动,保证火焰周围无菌环境; （3）取花生褐斑病得症状典型病叶(或其她分离材料），选择典型得单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块病组织数块。 (选择新患病得组织作为分离得材料,可以减少腐生菌混入得机会。腐 生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败得部分滋生,因此，一般斑点 病害应在临近健全组织得部分分离。)
植物病原菌分离方法
第四章植物病原菌分离与纯化 植物病原菌 一、植物病原菌分离流程 二、分离的准备 ?分离的准备工作 无菌室操作前保持清洁无菌 接种工作准备 培养基的准备 ?分离材料选择 以收获的材料从病健交界处采样 果实腐烂从开始腐烂处分离 根腐和枯萎层可能从离土较远处分离 有些枯萎如野火病被固定在局部，从病斑边缘分不到等 有些材料污染严重时可先接种再分离：即将病组织接种到健康材料等发病后分离 ?组织表面消毒 ⑴升汞：1‰ ◆升汞1g HCl(浓)25ml 水1000ml ◆升汞先溶于盐酸中，加水后稀释，也可用NaCl 5g/L 代替盐酸， 但易沉淀 ◆作用：盐酸，NaCl增加溶解度，HCl能增强杀菌能力。 ◆处理时间：30’S-30min不等，常3－5min；所需时间因材料 不同而异，消毒后灭菌水3－5次 附在组织表皮的气泡，含使消毒剂不能与寄生表面直接通气影响消毒效果，除气泡抽气、70％酒精浸2－3秒 ⑵漂白粉 ◆常用表面消毒剂适用于病组织表面消毒，也可处理种子 ◆成分：漂白粉10g，水140ml，过滤后使用。
◆最好现配现用，放久失效，有效成分CaClO次氯酸钙 ◆好的消毒液易使有色纸褪色，且产生氯气有强烈臭味。 ◆一般3－5min，时间长短因材料不同而不同。处理种子5－10min， 长的可达20－30min。 优点：杀菌能力强，具有挥发性，不会遗留在组织上影响分离结果，其杀菌能力小于升汞。 （3）酒精：70％，浸很短时间（几秒到1min）灭菌水洗。 ◆较大的材料在酒精中浸或棉花擦，然后在火焰烧去。 ◆幼嫩的病组织，表面用药剂消毒时可能会同时杀死其中的病原真 菌，消毒时间应尽量缩短。比较安全的方法是不用药剂消毒，而以 灭菌水换洗八九次。 ?培养基的准备 ●分离失败的原因，有时是由于培养基不适宜。 寄生性细菌对培养基的要求要比腐生性细菌严格。 一种适宜于纯培养的培养基不一定适宜于分离（杂菌太多） ●有时分离失败的原因不是培养基的成分不适宜，而是由于培养基的酸度不适当 或存放的时间太长。 ●植物病原菌的分离培养基，可以分为通用培养基和选择性培养基。 通用培养基不加特殊抑制杂菌生长的物质；选择性培养基一般都要加制 止杂菌生长的物质。 ◆植物病原细菌分离时，要避免使用选择性培养基，因为抑制杂菌 的物质一般并不杀死杂菌，而是抑制杂菌的生长，因此，从分离单 个菌落繁殖得到的菌株仍可能有杂菌。 三、植物病原细菌的分离技术 ●植物病原细菌一般用稀释分离方法。 因为在病组织中病原细菌数量巨大，分离材料中所带的杂菌又大多是细菌，用稀释培养的方法就可以使病原细菌与杂菌分开，形成分散的菌
动物检验检疫学 实验一 动物病原细菌的分离与鉴定
实验一动物病原细菌的分离与鉴定 一、实验目的 了解动物病原细菌的分离、鉴定的常规程序与基本方法 二、实验原理 初步分离鉴定：利用细菌在特定的选择培养基上的生长特性，观察细菌培养特征； 确定细菌的血清型、毒力因子：血清学检测或PCR检测技术 大肠杆菌的培养特征：37℃,培养24h,各种培养基生长特征： 普通营养琼脂平板：白色圆形，隆起，中等大小 麦康凯琼脂：红色、圆形、隆起、光滑、湿润、边缘整齐、中等大小 糖铁琼脂斜面培养基：底层变黄，产酸产气 伊红美蓝培养基：黑色、金属光泽 革兰氏染色：革兰氏阴性、分散或成对排列、两端钝圆的短杆菌 血清学鉴定：玻片凝集实验：颗粒性抗原与相应抗体结合出现凝集沉淀。大肠杆菌中，为了避免K抗原对O抗原凝集的抑制作用，利用O抗原的耐热性高于K抗原，实验前进行、高压或煮沸处理。 三、实验材料 1）材料：可疑病料，需提前三天提供小鼠 2）菌株：致病性大肠杆菌菌株 3）试剂：营养肉汤、营养琼脂、CT-SMAC琼脂、TSI琼脂、伊红美蓝琼脂培养基、IMViC、大肠杆菌O157标准血清、生理盐水、吉姆萨染色液、酒精或棉球。 4）仪器：显微镜、37℃恒温培养箱、酒精灯、接种棒、剪刀、镊子、载玻片、记号笔、口罩、手套。 四、操作步骤 1.分离培养 第一天： 1.）处死小鼠，无菌解剖 2.）观察各脏器是否出现肉眼病理变化； 3.）无菌采集内脏病料，通过无菌操作划线接种于普通琼脂平板、改良山梨醇麦康凯（CT-MAC)琼脂平板各一块，37℃培养24h； 4.）同时无菌挑取一小块病料，直接涂片，吉姆萨染色，油镜观察组织中的细菌特征； 第二天 5.）挑取CT-SMAC典型单个菌落分别接种于TSI琼脂斜面、伊红美蓝琼脂和营养肉汤，37℃培养24h。挑取普通培养基上的菌落进行糖类发酵和IMViC生化实验。 糖（醇）类发酵实验：接种两只葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基，麦芽糖发酵培养基，一支接种，一支对照；接好后置于37℃温箱中培养24h。 吲哚（Indol）试验：接种到胰蛋白胨水（含色氨酸）培养基中，37℃培养24-48h。 甲基红（Methyl red)试验：将菌接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃培养48h。 VP(PVoges-Proskauer)试验：将菌种接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃培养48h。 硫化氢试验：将菌以接种针穿刺接种到醋酸铅或柠檬酸铁氨培养基中，37℃培养24h。 柠檬酸盐试验（Citrate utilization）：取少量菌种接种到柠檬酸盐培养基上，37℃培养24h。 第三天 １.观察现象，滴定检验
植物病原菌的分离
植物病原菌的分离 一、实验原理 植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。 二、实验目的 植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。 三、实验材料及准备 1.分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。 2.分离用具：酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）0.1%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。 四、实验方法及步骤 （一）分离前的准备工作： 1.工作环境的清洁和消毒 分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。工作前擦净桌面，最好铺上湿纱布。将所需用的物品按次序放在工作台上，避免工作时走动，工作人员最好穿上灭菌后的工作服，带上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新洁尔灭擦手。 2.分离用具的消毒 凡是和分离材料接触的器皿（刀、剪、镊、针等）都要随时（至少在使用时）保持无菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3次（刀、剪、镊等不宜
病原细菌的分离与鉴定
病原细菌的分离与鉴定.txt24生活如海，宽容作舟，泛舟于海，方知海之宽阔；生活如山，宽容为径，循径登山，方知山之高大；生活如歌，宽容是曲，和曲而歌，方知歌之动听。病原细菌的分离与鉴定 发布日期：2009-05-09 浏览次数：827 字号：[ 大中小 ] 一、实验目的 系统学习兽医临床病原细菌的分离与鉴定技术，促进学生系统掌握各类病原细菌的基本特性与实验诊断技术，增强学生应用所学知识解决生产实践过程中的传染病的诊断和防控问题的能力，为预防、控制和消灭畜禽病原微生物，保障畜牧业生产的健康发展服务。 二、知识背景 细菌分离是细菌学检验中的极其重要的环节。正确的分离有助于很快得到可疑的致病菌，对疫病的诊断与防控至关重要。在细菌分离时应注意的事项： 1．病料采集 （1）病料的种类主要决定于疫病的性质，一般方法为： ①全身感染→血液及内脏； ②局部感染→病患部位； ③特殊病例→特殊处理。特殊情况的正确处理与操作者的专业知识有很大关系。无论全身或局部感染，均应采含菌最多或病变明显的组织 （2）病料的采集时间也应特别注意： ①活体病料→应考虑病原在疾病发展过程中部位的变化； ②患畜死后→应立即采集病料，越早越好。 2．无菌操作 无菌操作是指在微生物研究过程中，既要避免各种外界的微生物进入操作对象又要杜绝操作对象污染周围环境的操作技术。 无菌操作是对微生物学工作者最基本的要求，必须经过严格训练才能形成无菌操作素养。不论何种情况下，头脑中都应该有这个概念。 无菌操作贯穿于整个分离过程，例如：病料的采集、器材的准备、具体的操作。所用器械及物品均应事先灭菌备用，金属器具包装后高压灭菌或煮沸30min，玻璃器皿可高压灭菌也可
细菌分离及鉴定的实验方案
从土壤里分离及鉴定细菌的实验方案 1实验材料：新鲜土壤。 a)培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；高氏一号培养基；马铃薯蔗糖培养基； 细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培 养基；LB培养基 b)试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95% 乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等 c)仪器：有玻璃珠100ml三角瓶（1）、培养皿（50套）、试管（20支）、移液 管（3支）、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U 型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无 菌操作台、灭菌锅、纱布，电子天平、记号笔，火材等 相关培养基的配方:
1.1实验总流程 1土壤取样：
2制备土壤稀释液： 2.1. 称取土壤1g，放入99mL无菌水的三角瓶中，振荡20min，即为稀释10-2的土壤悬液。 2.2. 另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔分别编上10-3、10-－4、10-5、10-6。取已稀释成10-2的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10-3的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10-3土壤稀释液。同法依次连续稀释至10-4、10-5 、10-6,10-7土壤稀释液。 在土壤稀释过程中，需换用不同的吸管（或枪头） 3倒平板富集培养 3.1 按照配方分别在三种培养基上富集培养，每一个稀释梯度每一个培养做三个平行实验。 3.2吸取稀释液 取一吸管，以无菌操作法分别吸取10-4、10-5、10-6,10-7土壤稀释液0.1mL，加在已制好的平板培养基上。 3.3涂板 用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，倒置于恒温箱培养。 3.4计算出每克土壤中细菌的数量。 细菌数=某一培养皿内真菌的菌落数×该培养皿接种液的稀释倍数即得 4分离 4.1配置LB培养基
病原菌的分离鉴定
竭诚为您提供优质文档/双击可除 病原菌的分离鉴定 篇一：常见病原菌采样分离过程 金黄色葡萄球菌采样分离过程 1、样本采集及初步分离 （1）奶样的采集： 采集有乳房炎和隐形乳房炎症状较明显的奶牛，消毒挤奶人手、奶牛乳头，弃2-3把乳，以乳样收集管无菌收集每个乳区乳样10-30mL，编好编号，4个乳区按：左前LF、左后Lh、右前RF、右后Rh编号，采集后尽快返回实验室，如不能尽快返回，应放在低温环境中带回。 （2）乳房皮肤拭子 用0.5mL肉汤润湿的消毒棉球拭子从乳房皮肤檫拭到乳头顶端，如果乳房土较多的话先檫掉土。拭子放入5mL离心管中，再放入冰盒中，迅速带回实验室处理。 （3）鼻腔拭子 用消毒棉球拭子插入动物鼻腔中，取出后放到盛有 0.5mL肉汤的5mL离心管中，放入冰盒中，迅速带回实验室
处理。 菌种的初步分离 首次分离时，用接种环蘸取样品在科玛嘉金黄色葡萄球菌显色平板上涂布接种，37℃，16-18小时培养后，从显色平板上挑取红色的单菌落，用脑心浸液（bhI）肉汤35℃培养18小时左右。 需要注意的是金葡菌初次分离时，接种显色培养基后培养时间最好不超过18h进行观察，因为超过24h后所有的葡萄球菌属细菌皆会导致显色培养基变色，进而出现假阳性。 2、菌种的保存 2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油，-80℃（长期）或-20℃（临时）冻存。 3、菌种的复苏 如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在显色平板或哥伦比亚血琼脂平板上划线培养，或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。 肠球菌采样分离过程 1、样本采集及初步分离 （1）肛门拭子 以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅
肠道致病菌的分离与鉴定
肠道致病菌得分离与鉴定 一、实验目得 （1）掌握肠道致病菌得分离、鉴定得主要步骤 （2）掌握平板划线分离法 （3）掌握玻片凝集试验得操作方法以及实际意义 二、实验材料 （1）实验仪器：试管、玻片、酒精灯、接种针、接种环、试管架、（2）实验试剂：生理盐水、细菌培养基、伤寒诊断血清、伊红美蓝培养基（EMB）、克氏双糖铁培养基（KIA）、葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、甘露醇发酵管、尿素培养基、蛋白胨水、半固体培养基 三、实验流程 （1）肠道致病菌得分离 ①待测标本得制作：把接种环放置于点燃得酒精灯火焰处对其进行灭菌，用已灭菌得接种环在细菌培养基中取少量待测细菌于盛有5ml生理盐水得试管中，混匀。 ②细菌得分离接种：用接种环取适量配置好得细菌悬液，在酒精灯附近进行划线分离法接种细菌于EMB培养基。将培养基置于37℃培养18~24小时。 （2）肠道致病菌得纯化 ①单菌落接种：从已培养待测细菌得EMB培养基上用已灭菌得接种针挑取某单个菌落接种到KIA培养基上，一部分直接深入培养基中底部，一部分直接涂抹于斜面处，置于37℃培养18~24小时。 ②待测细菌得初步判断：取出已纯化培养待测细菌得KIA培养基，观察现象，初步断定该细菌就是致病菌或就是非致病菌。
（3）肠道致病菌得鉴定 ①生化鉴定：分别取葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵管各一只（注意管内得小倒管则应充满液体，不含气泡），用已灭菌得接种针取已培养得KIA培养基上得培养物接种于各发酵管，将各发酵管于37℃培养18~24小时。取出并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌） ②动力检查：用已灭菌得接种针取KIA培养基上得培养物分别接种于蛋白胨水、尿素培养基、半固体培养基中，将各个培养基于37℃培养18~24小时。取出后将靛基质（吲哚）加入到蛋白胨水培养基中，并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌） ③血清学鉴定：取洁净玻片一张，将其用蜡笔分为两格，两边各取生理盐水一滴，再用已灭菌得接种环分别取KIA培养基上得培养物加入两格中，与生理盐水混匀不摊开。（注意每次使用接种环前都应用酒精灯火焰进行灭菌）然后在第二格中滴入一滴伤寒诊断血清，混匀不摊开，轻轻摇动玻片，经1~2min观察两格中有无凝集现象。注：本实验涉及细菌接种都应在无菌条件下进行，由于条件有限，因而可在燃烧得酒精灯附近进行实验操作。 四、实验结果与分析 （1）EMB培养基现象与分析： ①培养基下部呈现黑色现象，上部培养基仍为红色，培养基斜面有细菌明显蔓延生长。 ②分析：培养基下部出现黑色现象，说明该细菌能够分解培养基中得物质并产出硫化氢气体，由于培养基中含铁，因而硫化氢能够与
植物病原菌的分离和培养
实验三植物病原菌的分离和培养 一、实验目的 在研究病原菌的形态、生理、生态以及病原菌对寄主植物的致病性等多种试验中，常常需要病原菌的纯培养物。然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其他基物中将病原菌单独分选出来，叫作分离。分离和培养是植病实验室最基本的操作技术之一。通过本次实验学习植物病原菌分离培养的原理和常用的方法。 二、内容、材料和方法 (一)分离材料的选择 分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响，因为在感病植物受害部位的内外，要有多种腐生菌，为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。 (二)分离方法 病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。 1.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离，此法又分为小块组织分离和大块组织分离两种方法。分别以玉米大斑病、小麦根腐病和梨褐腐病为试材进行。 (1)叶斑病类病原菌的分离（玉米大斑病病菌的分离）
取玉米大斑病病叶，在病、健交界处剪取2—3毫米长的病组织。用10%漂白粉（次氯酸钙）溶液消毒（漂白粉溶液现用现配）3-5min，时间长短依病组织不同而异，然后直接移至PSA平板培养基上(为防止细菌污染，可在培养基中加入1000ppm链霉素10毫升)，倒臵于20—25℃室温下，待菌落长出后挑取前缘菌丝，回接于PSA斜面培养基上，在25℃温箱中培养，待菌落颜色变深后，在无菌条件下镜检是否是玉米大斑病菌，弱仅有玉米大斑病菌的孢子，则说明已获得了纯培养，否则，则需要继续转至斜面培养基上进行纯化，直至获得纯培养。 (2)种子内部病原菌的分离（小麦根腐病菌的分离） 选择典型的小麦黑胚粒3—4个，在70%的酒精中浸2—3秒钟后，以镊子夹住投入0.1%升汞溶液中表面消毒2—3分钟（处理时间可自30秒至30分钟不等），然后取出小麦粒，以灭菌水冲洗3次，再移至已倒好的马铃薯琼脂平板培养基上，注意要以小麦的黑胚部位着靠在培养基上，倒臵在25℃温箱中培养，待菌落长出后，挑取前缘菌丝于马铃薯斜面培养基上培养，培养3-4天后，无菌条件下镜检是否获得纯培养。 (3)病组织内部病原菌的分离（梨褐腐病菌的分离） 取梨褐腐病病果沾取95%酒精，用酒精火焰三次消毒后，以在灯焰灭过菌的解剖刀在果面病、健交界处切开，挑取豆粒大小的病组织放到马铃薯琼脂平板培养基上，每皿放3—4块，倒臵于25℃温箱中培养2—3天。菌丝长出后转至马铃薯琼脂斜面培养基上，培养3-4