Rh血型系统的多态性研究进展_杨波

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(2006-09-04收稿,2007-01-21修回)

本文编辑:刘晓明

#综述#

Rh血型系统的多态性研究进展

杨波1米豫飞2孙先玲1张艳艳1李哲1肖鲲1丁琪1刘兴3兰炯采1

(1.洛阳市中心血站,河南洛阳471000;2.洛阳正骨医院;3.辽宁省锦州市中心血站)

关键词:Rh血型;等位基因;R h蛋白多态性

中图分类号:R45711+1Q347文献标识码:A文章编号:1004-549X(2007)04-0355-04

人类红细胞Rh血型发现于20世纪40年代,是人类红细胞血型系统中最具多态性者。先后共发现了几十种Rh 血型蛋白抗原,临床相关的主要抗原为D、C、c、E和e等5种。Rh血型具有较强的免疫源性,仅次于A BO血型系统而具有重要临床意义。近10年来,Rh血型系统的研究取得了很大进展,编码R h蛋白的RH D和RH CE基因已被克隆、测序,很多R h抗原的分子机理也已经明确。现将Rh血型系统基因多态性研究进展介绍如下。

1RH基因

Rh血型抗原由位于1号染色体短臂1P34.3-1P36.1上2个紧密连锁高度同源的RH D和RH CE基因编码,2个基因序列同源性高达93.8%,都含有10个外显子和9个内含子,长分别为57932bp和58575bp,都编码417个氨基酸[1]。RH D基因和RH CE基因的开放阅读框架(O RF)在RH基因座位上方向相反,3.末端相对,相距约30000bp,包括约20000bp的小膜蛋白1(SMP l)基因和下游R h盒(Rhesus box)。SM P1基因散布在2个RH基因之间[2]。下游Rh盒起于距RH D基因终止密码子3'端104bp处,长9 145bp;此外,在距RH D基因起始密码子5.端约4900bp处还存在1个9142bp的上游Rh盒。2基因中,最大的内含子约11.8kb(2基因的内含子1),最小的内含子有426bp (RH D基因的内含子4),外显子长度在20-200bp内。2基因差异最大的区域位于外显子3、4、5、7、9及内含子4,与RH CE基因相比,RH D基因内含子4中有1个651bp的缺失。RH CE基因含有10个外显子分布在长度为75kb的碱基上,外显子4-8由不同的RN A对碘氧基苯甲醚选择性拼接而成。转录的起始位点位于起始密码子上游的83bp 处。RH D基因的祖先基因是Rh相关糖蛋白基因(RH A G基因),RH A G基因首先复制形成RH ce基因;RH ce基因第2次复制发生在同一染色体短臂,形成/RH ce复制体0,随后RH ce基因和其复制体分别沿不同的途径进化,最终/RH ce 复制体0形成现今人类的RH D基因。

2R h蛋白

RH D基因编码RhD蛋白,RH CE基因编码RhC/c和RhE/e蛋白,Rh蛋白是疏水性、非糖基化的红细胞膜脂蛋白[3]。RhD和RhCE蛋白结构相似,都为417个氨基酸残基,二者仅35个氨基酸不同,都有12个跨膜结构域,形成6个细胞外环,Rh抗原位点就位于这6个环上,C末端和N末端均在胞浆内,因此Rh蛋白可分为胞外区、跨膜区和胞内区3部分[4]。种系研究和试验证据表明这些蛋白属于铵/甲基铵透明质酸酶A mt/M ep/Rh蛋白超家族,但是也有观点认为R h蛋白具有CO2气体通道功能。Callebaut等[5]基于一种改良排列法和细菌氨载体A mtB(属于A mt/M ep/Rh蛋白超家族),提出了人类R h蛋白的亚型和低聚体结构模型。以往认为通过选择性剪接或外显子跳跃机制,RH CE基因编码的RhC/c和R hE/e蛋白表达在不同的多肽链上[6], RH Cc转录本缺乏外显子5,该外显子编码RhE/e抗原必需的氨基酸残基,而全长的RH CE转录本才表达全长的RhE/ e多肽[7]。但有些研究否定了这种假设,Smy the等[6]利用细胞转染技术,把1条全长的RhcE转录本转染K562细胞,结果该细胞同时表达Rhc和RhE抗原。另外,免疫纯化的RhCc蛋白包含全长的,而不是截短的多肽链;此外,至今未在红细胞表面找到R hC/c和RhE/e在不同多肽链上的蛋白结构,这些发现证实R hC/c和R hE/e表达在同一条多肽链上,即RH CE基因只编码1条RhCE多肽链[7]。RHD外显子3和6的所有多态性位点出现在跨膜和细胞内部分,因此对RhD免疫反应性不会影响太大,反之,细胞外环3、4和6的多态性氨基酸分别由外显子4、5和7决定[8]。

3Rh抗原

Rh抗原是由多个亚单位组成的1个复合体,复合体核心由2个Rh和2个RhA G亚单位形成的四聚体组成,辅助性的CD47糖蛋白、L W糖蛋白、Duffy糖蛋白和血型糖蛋白B等通过非共价键与四聚体相连,以共分子的形式存在[9]。

3.1D抗原D抗原是1个嵌合体结构,至少有9个表位(epD1-epD9)[10]。D多肽表达所有的D表位,有12个跨膜域,形成6个膜外区域,即6个细胞外环。D表位的表达至少与这6个膜外区域的表位簇一致,大多涉及第3、4、6细胞外环的重叠区域[11]。位于1个多通道转移膜蛋白上的变异可能影响其膜的整合。与大多数膜蛋白不同,D抗原的表达通常由单个等位基因决定,因为它经常以半合子的形式发生,大于正常D抗原密度可能通常由2种D编码的等位基因决定,而D抗原的弱表达总是与变异的RH D等位基因联系在一起[12]。

3.2CcEe抗原与D抗原不同,CcEe抗原是2种抗原被1种蛋白质(RhCE蛋白)所表达。RhCE蛋白也有6个细胞外环,C/c抗原涉及第2个细胞外环,E/e抗原涉及第4个细胞外环[13,14]。C/c多态性与第103位氨基酸的替代有关,即:在C中第103位氨基酸是Ser(丝氨酸),而在c中第103位氨基酸是Pr o(脯氨酸)。对于E/e的多态性,则与第226位氨基酸的替代有关,即:E中第226位的Pro在e中被A la (丙氨酸)替代[15]。RhD与二者相比较,其第103位氨基酸为Ser,第226位氨基酸为A la。

4RH等位基因

4.1RH D等位基因以抗原性和表型的临床特征分类,目前已发现了150多种RH D等位基因。

4.1.1RhD阴性在D阴性表型中存在非功能性RH D等位基因和正常的RH CE基因。有研究表明RhD阴性单倍体是由上下游Rh盒触发的不等交换引起,并且确定RH D 基因缺失的903bp断裂点区就位于该区域[16]。在亚洲人群中,RH D基因缺失、RH D-CE-D杂交和1227G>A突变是引起D阴性的主要机制[17,18]。碱基突变为错义突变或无义突变,碱基插人和缺失引起框移突变,导致终止密码子提前产生,最终的结果是红细胞表面R h蛋白表达缺失。约有30%RhD阴性的亚洲人群实际上为D EL,即含有弱D抗原,仅能通过吸收放散试验证实,而约有1

5.8%真实D阴性中国人携带RH D等位基因[19]。

4.1.2部分D这些变异体的形成机理有2种:一种机理是基因转换,即RH D基因的特异性片段与RH CE基因的对应片段发生替换,形成D-CE-D杂种基因,编码产物只获得D表位中的一部分,形成部分D,大多数部分D由这种机理产生。另一种机理是碱基突变,即在RH D基因中发生碱基突变,导致部分D产生。在所有的DV中,改变的RhD 蛋白片段与第4个细胞外环毗邻,构成了D抗原中最具致免疫的部分之一[20]。DT I表型缺乏D1、D2.1(部分)、D2.2、D5、D6(部分)和D8表位。DT I多肽显示在D多肽在存在7个氨基酸替换:F223V、A226P、E233Q、V238M、V245L、G263R和K267M[21]。DW I在RH D外显子7上存在1个单核苷酸替换(1073T>C)。通过对表位进行基因定位研究揭示,只有少量D抗原存在减弱改变,但没有缺失D1.1、D9.1和D16.1表位[22]。DV I是临床上最重要最常见的部分D,是由于RH D基因的2、3或4外显子被相应的RH CE 基因的外显子所置换,分别为DV Ia、D VIb和DV Ic。

4.1.3Del等位基因主要存在于亚洲人群中,大约2

5.5%相对RhD阴性的中国大陆人实际为Del表型,也可以认为是一种特殊的弱D类型[23],在台湾省人群中这个比例则约为30%[24]。目前已报道6种Del等位基因[25-29]:RH D1 227A、RH D885T、RH D(I VS3+1g>a)、RH Ddel1013b p、RH D(X418L)和RH D(I VS5-38del4)。其中RH D(I VS3+1g>a)和RH D885T引起mR N A剪接点改变;RH D1227A是由于在外显子9末端发生沉默突变引起的;与正常的RH D基因相比,RH D(I V S5-38del4)仅在内含子5上缺失4个核苷酸;RH D(X418L)是因为外显子10上第1252和1253位核苷酸上插入一个T,引起框移突变,造成原来RH D基因终止密码子由T A A(X)变成T T A(L),导致编码的RhD蛋白从417个氨基酸变成488个氨基酸。

4.1.4弱D(D u)目前所发现的弱D等位基因的分子基础都是点突变,突变位点编码的氨基酸残基通常集中在R hD 蛋白的2-13、149、179-225和269-397位氨基酸残基等4个区域,位于RhD蛋白的胞质区或跨膜区,因此可以影响该蛋白有效插入红细胞膜,导致红细胞膜上RhD蛋白表达量的降低[30]。其中台湾人群中主要存在4种弱D类型,分别是:密码子10上CGG突变成CAG,密码子174上GT G突变成A T G,密码子270上GT G突变成G A G和密码子282上G GT突变成GA T[31]。中欧人群中常见的弱D类型为弱D1,2,3,4.0和4.1[32]。W agner等[33]提出一个RhD抗原密度400个/细胞的临界值标准(该临界值用目前的Ig M抗-D 试剂和方法能检测出来),并认为在白种人中R hD抗原密度大于此临界值的弱D者输RhD阳性血是安全的,应用这个标准,97%弱D表型的白种人可输RhD阳性血。

4.2RH CE等位基因与RH D等位基因相似,RH CE等位基因也存在许多变异体。RH ce等位基因经过突变或与RH D基因交换形成R H cE、RH Ce和RH CE等位基因,这些基因进一步发生基因缺失、碱基变异或与RH D基因发生基因交换而产生众多的RH CE等位基因。已报道的RH ce等位基因有8种[34-39]:c eEK、ceBI、c eA R、c eMO、c eRT、c eSL、ceCF、ceR A。其中,ceEK(外显子1上48G>C、712A>G、787A> G、外显子5上800T>A),ceBI(外显子1上48G>C、外显子5上712A>G、外显子6上818C>T、外显子8上1132C >G),ceA R(外显子1上48G>C、712A>G、733C>G、787A>G、外显子5上800T>A、外显子6上916A>G);

c eRT和ceS L是2种不需要特异性D氨基酸就能表达D抗原的RH CE等位基因;ceRA是在Rh多肽的膜内区域的外显子1上有1个G48C突变和外显子4上有1个G538C突变,这2个突变各自有1个T r p16Cy s替换和1个Gly180A r g替换;ceM O是RH ce基因外显子5上多了1个G667T突变,同时缺少hrS抗原表达。St robel等[40]对罕见的Rh抗原Ew进行分析,其分子基础为RH CE基因外显子4上T500A单个点突变。No izat-Pir enne等[34]认为cEM I 等位基因相当于1个在外显子3上有9个核苷酸缺失的一个沉默的RH E等位基因,用PCR对RH E进行基因分型, cEM I等位基因显示假阳性结果,因为有这些等位基因的细胞血清学表型为E阴性。

4.3Rh null其特征是红细胞膜缺乏所有Rh抗原和Rh复合体,或其它膜成分的缺失或严重减少。在这种表型的红细胞上,包括R h蛋白和RhA G蛋白在内,许多其它糖蛋白,如CD47、L W、D uffy和血型糖蛋白B缺乏或严重减少。大多数情况下,Rh null红细胞上缺乏R h蛋白与RH A G基因突变有关。通过对Rh null个体进行分子分析,显示仅在Rh蛋白和RH A G位点发生异常,而不存在编码CD47、L W和血型糖蛋白B基因之间的交替[41]。Rh null可分为调控型和等位基因无效型。调控型最常见,由1个常染色体上隐性抑制基因的纯合引起,这种抑制基因遗传上不受Rh位点支配;等位基因无效型罕见,是产生于R h位点的1个沉默基因的纯合[42]。在等位基因无效型中,含有1个2个核苷酸不相邻的缺失,即A T T(ile322)至A T和CA C(his323)至CC;还含有一个T到C的转换,即AT T(ile322)至A T C,和1个二核苷酸的缺失,即CA C(his323)至C。它们导致在开放阅读框中出现了相同的替换,从而编码1个含398个氨基酸的蛋白。

总之,Rh血型系统具有丰富而又复杂的基因多态性,我们只是对目前的研究做了简短总结,Rh基因结构的许多谜还未揭示,RH基因的多态性还需进行更深入的研究。

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(2006-11-17收稿,2007-02-19修回)

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