生物工程下游技术复习题及解答

一、名词解释

1、连续培养反应器：不断地往反应器中加入营养物，利用罐中的菌体增殖得到产物，并不断采出。在良好的控制下，罐内菌体的增殖速度可以与采出速度相同而达到稳态。

2、菌体比生长速率（μ）：单位浓度菌体在一定条件下引起的反应速率, 其值反映了培养菌体增长的能力, 受菌株及各种物理化学环境的影响. 表示为μ=dx/x.dt

3、得率系数：两种物质得失之间的计量比。Yx/s,Yp/s

4、贴壁培养: 贴壁依赖性细胞在培养中要贴附于壁上才能迅速铺展,开始有丝分裂并迅速进入对数生长期,这种培养方式就叫贴壁培养.多数动物细胞的培养都采取这种方式.

5、蛋白质的复性：包含体蛋白质溶解于变性剂溶液中，呈变性状态，所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质复性。

6、浓差极化：指在分离过程中，料液中的溶剂在压力驱动下透过膜，溶质被截留，于是在膜表面与临近膜面区域浓度越来越高。在浓度梯度作用下，溶质由膜面向本体溶液扩散，形成边界层，使流体阻力与局部渗透压增加，从而导致溶剂透过量下降。溶剂向膜面流动引起溶质向膜面的流动，这种流动如果与浓度梯度所驱动的溶质向本体溶液扩散的速度平衡时，在膜面附近就形成一个稳定的浓度梯度区，这一区域就称为浓度极化边界层，这一现象称为浓差极化。浓差极化是一个可逆的过程；

7、膜污染：物料中的微粒、胶体粒子或溶质大分子由于与膜存在物理化学相互作用或机械作用而引起的在膜表面或膜孔内吸、沉积造成膜孔径变小或堵塞，使膜产生透过流量与分离特性的不可逆变化的现象。

8、排阻色谱（Size exclusion chromatography，SEC）：又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离。

9、分配色谱：是利用溶液中被分离物质在两相中分配系数不同，以使组分分离。其中一相为液体，涂布或使之键合在固体载体上，称固定相；另一相为液体或气体，称流动相。

10、有效柱长（有效迁移距离）：溶质从开始迁移至其迁移速度等于流动相速度时，溶质在色谱柱上迁移的距离称为有效迁移距离，也称为有效柱长。

11、吸附等温线：指在一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系。

12、切向流过滤：就是一种维持恒压下高过滤速度的技术，其原理就是：使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用液体的剪切作用将介质表面的固体移走，当移走固体与固体沉积速率相同时，过滤速度就保持恒定，控制不同的切向流速度就可以得到不同的过滤速度。（实际是维持了Ｒc).目前几乎所有的膜固液分离都采用切向流方式

13、包含体: 存在于基因工程细胞中，主要由蛋白质构成，其中大部分是克隆表达的产物，一级结构正确，立体结构错误，没生物学活性。难溶于水，只有在变性剂溶液中才能溶解。

15、双水相萃取：利用被提取物在二相中的分配不同而实现分离的目的；由于蛋白质在有机相中容易失活，因此采用的二相均为亲水相，如PEG/葡聚糖、ＰＥＧ／无机盐等，称为双水相，两相密度不同，轻相富含一种高分子，重相可能富含另一高分子，细胞碎片和蛋白质在二相间的分配系数不同，从而实现分离的目的。

16、反渗透：在高于溶液渗透压的压力作用下，只有溶液中的水透过膜，而所有溶液中的大分子、小分子有机物及无机盐全被截留。理想的反渗透膜应被认为是无孔的，它分离的原理是溶解扩散（或毛细孔流学说）。

17、分配系数一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系数，用K 表示

18、色谱曲线基线：无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。

19、保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间。

20、死时间（tM）：不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间。

调整保留时间（tR ＇）：tR＇= tR－tM

21、容量因子k：平衡时，组分在各相中总的质量比

23、排阻色谱：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；

中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。

24、亲和色谱：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。

25、正相色谱法：亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，极性柱也称正相柱。

26、反相色谱：若流动相的极性大于固定液的极性，非极性柱也称为反相柱。

27、非线性色谱:Cm与Cs不存在线性关系的色谱.

28、吸附等温线：一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系。

29、全交换容量:每克干介质或每毫升湿介质具有的功能基含量.是一个定值.

30、工作容量:每克干介质或每毫升湿介质在一定的操作条件下的交换吸附蛋白质的实际容量.是一个变值.

31、疏水性色谱:填料表面具有弱疏水性,蛋白质的疏水基团与填料表面之间产生弱的疏水性相互作用.高浓度的盐条件下,蛋白质与疏水固定相的吸附能力高,随着盐浓度的下降,吸附能力下降.当淋洗液离子强度逐渐降低时,蛋白质样品按其疏水性的不同依次被洗脱. 32、径向流色谱技术：即样品和流动相沿径向流动,可从色谱柱的周围流向圆心,也可从圆心流向柱的周围.通常采用从柱的周围流向圆心的方式.

33、泳动度(迁移率):带电质点在单位强度电场下的泳动速度即:U=V/E=(d/t)/(V/L)

34、变性胶：胶电脉在蛋白质变性的状态下进行，主要指SDS变性条件下进生

45、非变性胶：电泳在蛋白质保持天然状态下进行，不加变性剂

37、线性色谱:样品的浓度流动相中与固定相中之间是线性关系

38、生物过程动力学:定量地描述过程的速率以及影响过程速率的诸多因素.包括细胞生长速率、各种基质消耗的速率、代谢产物的生成速率。

39、悬浮培养：是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程.主要用于非贴壁依赖性细胞培养,如杂交瘤细胞等。

40、固定化培养：利用吸附或包埋等固定化的方式将细胞限制在一定的空间内,然后以固定化的颗粒进行悬浮培养.该方法对贴壁性和非贴壁依赖性细胞都是适合的。

41、膜分离技术：以半透膜为选择障碍层，允许某些组分透过而保留混合物中的其他组分，从而达到分离目的的技术。

42、离子交换法：通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法。主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离。

43、肽谱：指蛋白质被酶解或化学降解后肽段的分离分析或制备。

二、填空题

1、超声波破碎细胞的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等因素有关。

2、目前用于固液分离的膜过滤法主要有以下三种: 微孔过滤(微滤)、超滤、反渗透。

3、在生物工程下游技术领域，色谱和电泳是目前所知最好的两种分离蛋白的方法。

4、在生物物质分离中，可以依据一次进样量多少，将色谱分为：分析色谱、半制备色谱（中等规模制备色谱）、制备色谱和工业生产规模色谱 4大类。

5、无论是什么类型的液相或气相色谱,其色谱装臵均应包括: 流动相供给、进样、色谱柱、检测器等四大部分。

6、在色谱过程中，有两种将目标产品从色谱柱上洗脱下来的方法：一种是维持流动相热力学参数不变的等梯度洗脱法，另一种叫梯度洗脱法。

7、径向色谱填料主要有：离子交换树脂和亲和色谱填料两种。

8、评价HPLC色谱填料性能的主要表征指标包括：

保留值，选择性，柱效率，填充柱的总空隙度和穿透性，分离度。

11、羟基磷灰石在原理上一般被认为是一种无机基质高效色谱。

请列举二种测量蛋白质含量的方法：双缩脲法，考马斯蓝法。

12、常见的无机色谱填料主要包括：多孔硅胶、可控孔径玻璃、氧化铝、氧化钛、羟基磷灰石以及碳和石墨等基质。

13、无机HPLC填料最常见的是以多孔大硅胶为基本材料的填料；含硼的Na2O-B2O3-SiO2系玻璃经过热处理引起相分离，生成可溶于酸的Na2O-B2O3相及不溶于酸的高硅相。将酸可溶相浸析出来后剩下的另一相就制成了可控孔径玻璃，可控孔径玻璃的主要化学成份就是SiO2。

17、根据离子交换树脂官能团的性质，将其分为（强酸型）、（弱酸型）、（强碱型）、（弱碱型）、（鳌合型）、（两性）及（氧化还原）等 7 类。

18．指出三种交联葡聚糖的微载体：Cyto dex1微载体；Cytodex 2微载体；Cytodex 3微载体

19．指出蛋白质复性的三种方法：稀释法，透析法，液相色谱法等

20．固液分离的主要方式包括：离心法，微孔膜过滤法，双水相萃取，泡沫分离法。21．膜的孔径一般为微米级，依据其孔径的不同（或称为截留分子量），可将膜分为微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜

22 色谱的保留值可以用保留时间也可以用保留体积来表示。

23．色谱的峰宽可以用半峰宽、峰底宽、标准偏差表示。

24．指出下列情况下色谱系统对容质的柱效和分配系统差的关系：

①柱效较高，△K较大,完全分离；

②柱效较高，△K不是很大峰较窄，基本上完全分离；

③柱效较低，△K较大,但分离的不好；

④柱效低，△K 小，分离效果更差。

25．线性色谱的吸附等温线是直线，非线性色谱的吸附等温线的形状常见的有：凸形、凹形、S形、H形、阶梯形。从吸附等温线的形状可以预见色谱曲线的形状，一般凸形的吸附等温线代表色谱图是拖尾的，凹形吸附等温线代表的色谱图是吐舌头形状、S形的色谱图是波浪形的。

27．Shephadex G100是一种凝胶排阻色谱，主要用于蛋白质的纯化。

28．DEAE-Shaphdex A25是一种离子交换层析介质。

29．CM-纤维素是一种弱阳离子交换介质。

30．离子交换层析一般是通过梯度一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。

一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH值。

31．QAE-葡聚糖是强碱阴离子交换剂，SP—是强酸阳离子交换剂。

33．蛋白质含量和纯度测定方法。含量测定:克氏定氮法，TCA比浊度法、双缩脲法、福林-

酚法和紫外线法，考马斯兰法（Bradford法）。

纯度衡量:电泳法，层析法，质谱法等。一般应采用二种以上方法，而且同一原理的方法不应该采用二次。

34．细胞破碎法包括：机械力和非机械力破碎方法；机械方式又包括：液体剪切力和固体剪切力方法，液体剪切力包括：高压匀浆法和超声破碎法；

固体剪切力包括：高速珠磨法和压榨法。

35．高压匀浆法的主要困难包括：温控和堵塞问题

26．高压匀浆法的破碎率决定于：匀浆阀的结构，操作压力，破碎次数。

34．蛋白质的分子量测定：超离心法、光散射方法、凝胶过滤法、SDS-PAG电泳法。

三、判断题

3.絮凝剂须有长链的线性结构，越长越好（×）。

4.细胞壁破碎的主要阻力是连接细胞壁网状结构的共价键（√）

6.离子交换的推动力是离子浓度差。（√）

9.凝胶过滤操作中，通常上样量越小，分辨率越高。×

16.层析过程中,有效柱长是随层析条件的变化而变化的. ∨

17.层析过程中,可以通过改变洗脱剂的浓度变化梯度改变有效柱长和最短柱长. ∨

23.HPLC填料的颗粒粒度的分布应该是越小越好的，最好是能实现颗粒的单分散。∨

28.葡聚糖凝胶排阻色谱中，上样量越大，分辨率越高。×

29.同一蛋白质在不同种类的缓冲液中，只要缓冲液的pH值相同，则30.蛋白质所带的电荷数量也相同。×

37.为了减小样品在洗脱过程的轴向扩散，可采取增大进样浓度减少进样量的方式。∨40.动物细胞培养微戴体的密度应略大于培养基。×

42.一般讲，亲水性膜及膜材料电荷与溶质相同的膜较耐污染。∨

43.色谱过程中试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础。∨

44.色谱过程一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢。∨

47.色谱柱效高说明该色谱对物质的分离度高。×

51.分离度由色谱柱的柱效率和物质间的分配系数的差异共同决定。∨

53.在凝胶排阻层析中，流动相的速度越慢越有利于色谱分离和分析。∨

55.两性的生物大分子所带电荷的性质和数量由其等电点及溶液环境(pH值)所决定。∨

56.聚丙烯酰胺浓缩胶的原理包括其pH值=6.9为甘氨酸的等电点。∨

59.样品溶解不好容易造成拖尾。∨

60.Monod常数随菌体的浓度的变化而变化。×

61.Monod常数是细胞培养过程中的一个对菌体性质的特征性常数。×

62.色谱柱效可从峰宽得到，色谱峰越宽，柱效越低，峰宽相同，柱效相同。×

63.决定柱效的因素是分配系数。×

64.决定柱效的因素是容量因子。×

66.可以说“A柱子的柱效高于B柱子。×67.分配系数与柱效没有关系。×

68.容量因子与柱效有关系。∨

69.柱效不能表示被分离组分的实际分离效果。∨

70.用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。∨

72.发酵反应器设计要求有尽量高的传氧系数。∨

73.生物放大器的常用控制方法是反馈调节。∨

75.动物细胞培养就操作而言，深层培养可分为批式、流加式，半连续式、连续式和灌注式5种。∨

80.明胶涂覆的多孔微载体适应于一切的细胞系。∨

86.产物提纯过程包括初级分离阶段和纯化精制阶段两个阶段。∨

93．溶液pH对蛋白质在水中溶解性，荷电性及构型有很大影响。∨

94.膜分离技术中清洗过程中主要考虑膜的化学特性和污染物的特性二个因素。∨

96.气液色谱的固定液在常温下不一定为液体，但在使用温度下一定呈液体状态。∨

98.用来衡量色谱峰宽度的参数有标准偏差( )、半峰宽(Y1/2)和峰底宽(Wb)三种表示法。

∨

99.气相色谱中容量因子越大，保留时间越长。∨

100.离子交换色谱对于大分子和小分子的保留机理基本相同。∨

101．示差折光检测器是除紫外检测器之外应用最多的检测器，此检测器灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱。∨

102.液-固吸附色谱中非线形等温吸附常引起峰的拖尾。∨

104.非线性色谱基本理论包括吸附平衡热力学、吸附平衡动力学和色谱基本特料平衡方程。∨

106.在非线性色谱中，峰高增加的速率随浓度的增加而逐渐降低，因而峰高不能作为定量分析的指标。×

109.凝胶过滤中进样体积和样品的浓度将明显地影响蛋白质的。∨

110.膨化的凝胶可以直接高温烘干。×

112.一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。∨113.离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。∨

115.Superdax是葡聚糖与交联琼脂糖的结合，而Superose是珠状琼脂糖经两次交联。∨116.反相色谱以硅胶基质的键合相填料为主，特别是键合C18，C8烷基以及苯基填料。∨117.不同填料的化学结构是通过对基质材料的化学改性而实现的。∨

118.疏水性相互作用色谱是为了适应活性生物大分子特别是蛋白质的分离而发展起来的种液相色谱方法。∨

120.作为分离材料的硅胶，其颗粒的形状与大小、孔的结构、孔径及其分布、总孔容、比表面积及机械强度等，均为重要的物理参数。∨

121.硅胶的化学修饰大致可以三种不同的方式进行，即整体修饰、通过表面硅羟基的化学修饰以及涂层法。∨

122.物理吸附水的去除是硅胶衍生反应中不可或缺的一步。∨

123.硅胶一般有耐受高压力,耐压能力随孔径及孔度而下降。∨

129.泳动度(迁移率)只取决于带电质点的性质。×

131.丙烯酰胺浓度和交联剂浓度决定胶的物理状态及分子筛的孔径的大小。∨

132.电泳中缓冲液的种类,浓度和其他电解质浓度影响蛋白质所带电荷的极性和数量,同时还影响蛋白质分子间的相互作用。∨

138.选择具高选择的填料可以克服径向色谱直径短的缺点,发挥径向色谱柱速度快,处理量大的优点。∨

四．单选题

12. 在理想状态下,下列哪种色谱对二种物质的分离度可以随柱长的延长而无限增加:

(A) 凝胶排阻色谱;(B) 离子交换色谱;

(C) 亲和色谱;(D) 分配色谱;

17. 聚合物型基质材料中，下列哪种是应用最为广泛的：

（A）交联聚苯乙烯树脂；

18．对于硅胶而言，其表面的硅羟基是进行化学修饰的基础，硅胶表面的硅羟基的主要存在形式是：

（A）硅三羟基；（B）硅二羟基；

（C）邻位硅羟基；（D）单硅羟基；

19．不经过化学修饰或改性的硅胶本身可以做为：

（A）正相色谱填料；（B）反相色谱填料；

（C）离子交换色谱填料；（D）亲和色谱填料；

29、目前细胞培养产物的收率很低，不及总蛋白的1%，主要原因不包括：

(A) 血清蛋白质的污染

(B) 细胞表达产物浓度低

(C) 产物在培养条件下不稳定

(D)分离技术限制

30、生化分离用离子交换剂的特点不包括

（A）粒径小，分布均匀

(B)疏水性

(C)生物相容性

(D)适当的电荷密度

31、微囊化使一下哪个受到消极影响

（A）抗剪切力

（B）细胞生长环境

（C）传质效率

（D）产物浓度

33、表征膜对某一大分子溶质的截留能力的是：。

A. 孔道特征

B. 水通量

C. 截留率σ

D. 截留分子量

35、无机盐对蛋白质盐析效果，下列选项错误的是。

A. 柠檬酸盐＞磷酸盐＞硫酸盐

B. 硫酸盐＞醋酸盐＞盐酸盐

C. 盐酸盐＜硝酸盐＜硫氰酸盐

D. 盐酸盐＞硝酸盐＞硫氰酸盐

38、可测定蛋白质亚基分子量以及未知蛋白质分子量的电泳技术有。

A. CE

B. HPLC

C. IEF

D. SDS-PAGE

39、可用于了解蛋白组成，蛋白分子和等电点的电泳技术是。

A. 凝胶电泳

B. 等电点聚焦电泳

C. 毛细管电泳

D. 双向电泳

41、强酸性阳离子交换树脂的功能基团是。

A. 一SO3H

B. 一PO(OH)2

C. －COOH

D. －OH

42、与离子交换树脂的总交换容量有关的是。

A. 树脂种类

B. 溶液的pH

C. 溶液的溶质浓度

D. 溶液中溶质的电荷数

45、在采用离子交换技术时，对弱酸性树脂pH应选择。

A. pH＞pK产物＞pK树脂

B. pK产物＞pH＞pK树脂

C. pK产物＞pK树脂＞pH

D. pK树脂＞pH＞pK物质

47、在低浓度下已吸附的被吸附分子又能吸附在液相中的分子，其吸附等温表现为。

A. 凸形

B. 凹形

C. S形

D. 阶梯形

49、当溶质浓度增加时，分子在固相表面逐渐吸附，趋于稳定后被吸附的分子又吸附其他分子，其吸附等温表现为。

A. 凸形

B. 凹形

C. 正S形

D. 反S形

50、被吸附的分子在吸附剂表面随液相中溶质浓度的增加会发生吸附取向的变化或吸附状态的改变，其吸附等温表现为。

A. 凸形

B. 凹形

C. S形

D. 阶梯形

51、在应用吸附分离技术时，根据经验，吸附剂孔径等于溶质分子直径的多少较适合。

A. 1倍

B. 2倍

C. 4倍

D. 6倍

52、检测蛋白质是否变异的常用方法有。

A．肽谱 B. HPLC C.等电聚焦 D.毛细管电泳E.以上都对

53、下列蛋白质含量测定法，哪项灵敏度最高。

A．凯氏定氮法 B. 考马斯亮蓝法 C.Folin－酚试剂法 D.紫外吸收法

55、在有机相中添加下列哪项，将在表面活性剂总浓度不变的情况下可以提高反胶团尺寸，增大反胶团萃取的操作pH范围。

A. 助溶剂

B. 带溶剂

C. 稀释剂

D. 助表面活性剂

56、双水相萃取技术与生物转化过程结合，下列哪项不是其优势。

A. 消除产物反馈抑制

B. 细胞（酶）可循环使用

C. 生产能力、收率及分离效率高

D. 传质面积增大

57、关于温度对双水相萃取的影响，下列说法正确的是。

A. 在临界点附近，对蛋白质分配系数影响较小

B. 远离临界点时，对蛋白质分配系数影响较大

C. 影响双水相黏度和密度，从而影响蛋白质的分配系数

D. 大规模的双水相萃取操作需在冷却状态下进行

58、下列哪个组合不可能形成双水相系统。

A. PEG/ Dex

B. PEG/Inorganic salt

C. 乙醇/硫酸盐

D. 磷酸盐/硫酸盐

59、在溶剂萃取中，在水相中加入无机盐，下述哪项不是其目的。

A. 由于盐析作用，使产物在水中的溶解度下降，而有利于转入有机相

B. 增加两相间密度差，减少有机溶剂和水之间的互溶度

C. 减轻乳化现象，使其容易分离

D. 沉淀杂质

60、萃取剂对目标产物和杂质的分离能力可用下列哪项来表征。

A. 分离因素（β）

B. 萃取因素

C. 分配系数

D. 活度系数

65、在GC和LC中, 影响柱选择性的不同的因素是

A.固定相的种类；

B. 柱温；C．流动相的种类；D．分配比。

66、在液相色谱中, 某组分的保留值大小实际反映了哪些部分的分子间作用力？

A．组分与流动相；B．组分与固定相；C．组分与流动相和固定相；D．组分与组分。

68、在液相色谱中，梯度洗脱最宜于分离：

A．几何异构体；B．沸点相近，官能团相同的试样；

C．沸点相差大的试样；D．分配比变化范围宽的试样。

五、简答题

1. 高效液相色谱是如何实现高效、快速、灵敏的？

从气相色谱的高效、高速和高灵敏度得到启发，采用5-10μm微粒固定相以提高柱效，用高压泵加快液体流动相的流速；

设计高灵敏度、死体积小的紫外、荧光等检测器，提高检测灵敏度，克服经典液相色谱的缺点，从而达到高效、快速、灵敏。

2. 简述液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素，如何减少谱带扩宽，提高柱效？

因素:涡流扩散、流动相传质、停留流动相传质及柱外效应。

减少填料颗粒直径，减小填料孔穴深度，提高装填的均匀性，

采用低黏度溶剂作流动相，流速尽可能低，

同时要尽可能采用死体积较小的进样器、检测器、接头和传输管线等。

3. 色谱柱A柱长为15cm，载体粒度为5μm。另一B柱长为30cm，载体粒度为10μm。两柱的柱效相等吗？

∵l=L/d p ∴l A=15/0.0005=30000 l B= 30/0.0010=30000

A柱的折合柱长为30000，B柱的折合柱长也为30000，表明组分在两根柱内从柱入口到出口都经过30000个载体颗粒，两柱的柱效相等。

4. 为什么体积排阻色谱中任何组分的分配系数必须符合0≤K≤1？如果K>1说明什么问题?

因为组分的分配系数为K=C s/C m,C s与C m分别为组分在固定相和流动相中的浓度,当分子直径大于孔径时,此时C m=0,∴K=0。当分子直径小于固定相孔径时,组分向空隙内流动相扩散,达到平衡时,一半组分在空隙内,一半组分在空隙外,此时K=1,若分子直径介于以上两种极限情况之间,K一定介于0与1之间,可见体积排阻色谱中,任何组分的分配系数为0≤K≤1,如果K>1说明此时的分离方式已不是纯粹的体积排阻色谱,其分离过程受到其他作用力(如吸附)的支配.

5.HPLC操作中，流动相为什么要脱气？常用的脱气方法有拿几种？

害处：（1）气泡进入检测器，引起光吸收或电信号的变化，基线突然跳动，干扰检测；（2）溶解在溶剂中的气体进入色谱柱时，可能与流动相或固定相发生化学反应；

（3）溶解气体还会引起某些样品的氧化降解，对分离和分析结果带来误差。

脱气法:（1）加热脱气法（2）抽吸脱气法；

（3）吹氦脱气法；（4）超声波振荡脱气法。

6. 生物工程下游技术的基本步骤。

（1）建立分析方法：

①生物测定方法；②理化测定方法；③理化方法与生物学方法结合测定；

（2）选择提取材料；

（3）选择提取方法；

（4）分离纯化方法的探索；

(5）均一性的鉴定。

7、生物工程下游技术按生产过程划分几个阶段？各阶段的任务是什么？

①发酵液预处理、固液分离、细胞破碎：

除去发酵液中的不溶性固形物杂质和分离菌体细胞；

分离胞内产物，收集细胞后进行细胞的破碎和细胞碎片分离。

②提取：除去与产物性质差异较大的杂质

③浓缩：主要去除水分，提高产物浓度

④纯化：去除与产物的物理化学性质比较接近的杂质。

⑤成品化：根据质量标准和产品剂型制作产品。

8. 发酵液预处理的目的是什么，如何选择发酵液预处理过程？

①去除部分杂质

②改善理化性质，有利于固液分离

③使产物转入便于后处理的一相中

如何选择发酵液预处理过程：

①胞外产物，发酵通过离心或过滤实现固液分离，使其转入液相；

②胞内产物，先通过离心或过滤收集细胞并洗涤，然后细胞经破碎或整体细胞萃取使目标产物释放，转入液相，再进行细胞碎片分离。

③细胞本身，通过离心或过滤获得细胞，然后对细胞进行洗涤、干燥。

9. 超临界CO2破碎细胞技术的原理是什么？

超临界流体CO2在高压条件下渗透到细胞内，突然降压后，CO2变成气体，使细胞内外压力差增加，细胞急剧膨胀发生破裂。另外CO2对脂质有萃取作用，细胞碎片较大。10. 在溶剂萃取时，为什么要进行破坏乳化？

乳化是水或有机溶剂以微小液滴形式分散于有机相或水相中的现象。

有机溶剂相和水相分层困难，出现两种夹带：①发酵废液（萃余液）中夹带有机溶剂（萃取液）微滴，使目标产物受到损失；②有机溶剂（萃取液）中夹带发酵液（萃余液），给后处理操作带来困难。

产生乳化有时即使采用离心机也往往不能将两相分离完全，所以必须破坏乳化。

11. 超临界萃取的原理是什么？

溶质在超临界流体中的溶解度，与其密度有关，密度越大，溶解度越大。在临界点附近，微小的压力增加或温度下降，则超临界流体的密度大幅度增加，对溶质的溶解度将大

幅度增加，有利于溶质的萃取。而在临界点附近，微小的压力下降或温度上升，则超临界流体的密度大幅度减少，对溶质的溶解度将大幅减少，有利于溶质的分离和溶剂的回收。

12. 膜的浓差极化对生产有何影响？减少浓差极化有哪些措施？

浓差极化：在膜过滤时，随溶剂不断透过膜，大分子溶质被带到膜表面，但不能透过，就被截留在膜的表面上，造成膜面浓度升高，产生膜面到主体溶液之间的浓度梯度，这种浓度差导致溶质自膜面反扩散至主体溶液中的现象称为浓差极化。

影响：①提高渗透压，降低水通量；②降低膜的截留率；③产生结垢现象，造成物理阻塞，使膜逐渐失去透水能力。

措施：对处理液搅动、振动、错流以及加快液流速度等。

13. 有机溶剂沉淀法原理是什么？

加入有机溶剂于蛋白质溶液中可产生多种效应，这些效应结合起来，使蛋白质沉淀。

①有机溶剂，使溶液介电常数降低，蛋白质、核酸、多糖等带溶质间静电引力增大，从而相互吸引、聚集而沉淀。

②有机溶剂减小水的极性，使两性溶质在溶液中的溶解度降低。

③由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，从而降低了亲水溶质表面水化层的厚度和溶质的亲水性，导致脱水凝聚。

④极性有机溶剂破坏溶质的某种键（如氢键），使其空间结构发生变形，使原来包在内部的疏水基团结合形成疏水层。

14. 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。

由于聚丙烯酰胺凝胶是多孔介质，不仅能防止对流，把扩散减少到最低；而且其孔径大小与生物大分子具有相似的数量级，能主动参与生物分子的分离，具有分子筛效应。

因此，在使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离时，在电泳过程中不仅取决于蛋白质的电荷密度学（电荷效应），还取决于蛋白质的大小（分子量）和形状（分子筛效应）。

15. 简述SDS－PAGE电泳测定未知蛋白分子量的方法。

以不同的标准分子量蛋白MARK，与未知蛋白样品一同进行SDS－ PAGE电泳。染色后分

别计算未知蛋白、标准分子量蛋白MARK的迁移率，然后根据标准分子量蛋白M ARK迁移率与其分子量的对数值作图，可得一标准曲线并拟合方程。将未知蛋白迁移率代入拟合方程，求出未知蛋白的分子量。

16. 影响离子交换能力和选择性因素有哪些？

离子交换能力和选择性的好坏集中反映在离子交换常数K上，K值越大，说明离子交换能力和选择性越好。影响K值的因素有：

（1）被交换离子的水化半径和化合价：树脂对水化半径小的离子和化合价高的离子选择性好。

（2）溶液浓度：树脂对离子交换吸附的选择性，在稀溶液中比较大，而在浓溶液中选择性较小。

（3）溶液的pH：pH必须满足使树脂和生化物质都呈离子状态。

（4）交联度：对凝胶树脂，交联度小，树脂的孔径大，选择性降低。

（5）有机溶剂：当有机溶剂存在时，常会使树脂对有机离子的选择性降低，而容易吸附无机离子。因此进行交换吸附时，料液中不应存在有机溶剂。但在解吸附（洗脱）时，可采用有机溶剂来提高解吸的收率。

18. 色谱方法共分几类？常用的蛋白质分离方法有哪些？并简述其原理

（1）按溶质分子与固定相相互作用的机理不同，色谱分离可大致分成如下 5 大类：吸附色谱分离，分配色谱，离子交换色谱，凝胶色谱，亲和色谱。（2）根据固定相的形状不同，色谱分离技术可分为柱色谱分离、纸上色谱分离、薄层色谱分离。

（3）根据流动相的物态不同，色谱分离技术可分为气相色谱分离、液相色谱分离、超临界色谱分离。

（4）根据操作压力不同，色谱分离技术不同可分为低压色谱分离、中压色谱分离、高压色谱分离。

19. 在吸附分离技术中，如何选择洗脱剂？

（1）洗脱剂：选择与吸附剂溶解度参数相近的试剂作为洗脱剂；

洗脱剂对被吸附物有较大的溶解度；

（2）洗脱剂为水溶液时，需考虑洗脱pH：对于弱酸性物质，在偏酸性条件吸附，洗脱应为碱性水溶液；弱碱性物质则相反。

（3）如果吸附在高浓度盐溶液中，则洗脱可仅用水。

（4）易挥发性物质，可用热水或蒸汽解吸。

20. 蛋白质含量/浓度测定方法有哪些？各有什么特点？

蛋白质含量（浓度）测定，是生化检测中的基本内容，常见的测定方法有：凯氏定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。考马斯亮蓝法（Bradford法）。

1）凯氏定氮灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为±2％费时

8～10小时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长

2）双缩脲法（Biuret法）灵敏度低 1～20mg 中速 20~30分钟多肽键＋碱性Cu2＋?紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似

3）紫外吸收法较为灵敏 50～100μg 快速 5～10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶；

4）Folin－酚试剂法（Lowry法）灵敏度高～5μg 慢速 40～60分钟双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化

5）考马斯亮蓝法(Bradford法) 灵敏度最高 1～5μg 快速5～15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液；

21. （重组）蛋白质量检测方法有哪些？

（重组）蛋白必须经过严格的质量控制才能成为产品。重组蛋白的质量控制指标包括：1）重组蛋白的鉴别（序列）

2）重组蛋白的纯度（杂质的类型）

3）重组蛋白的活性（检测方法）

4）重组蛋白的安全性

5）重组蛋白的稳定性

6）重组蛋白的一致性（构象与构型）

具体的检测项目和方法有：

1）产品是否含内毒素家兔热原法

2）蛋白质是否变异肽谱、HPLC、等电聚焦、毛细管电泳

3）甲硫氨酸是否被甲酰化肽谱、质谱、HPLC、Edman分析

4）蛋白质是否变性、聚合、脱氨基SDS-PAGE、凝胶层析、等电聚焦、质谱、HPLC、毛

细管电泳、Edman分析

5）配体是否脱落 SDS-PAGE、免疫分析

6）氨基酸是否发生取代氨基酸分析、肽谱、质谱、毛细管电泳

7）产品是否被细菌、病毒、支原体等污染微生物学检测

22、生物技术产品的分离提取工艺应考虑那些因素？

某一具体产品的分离提取工艺与下列情况有关： (1)是胞内产物还是胞外产物；

(2)原料中产物和主要杂质浓度；(3)产物和主要杂质的物理化学特性及差异；

(4)产品用途和质量标准；(5)产品的市场价格；(6)废液的处理方法等。

23、“清洁生产”应该包括哪三方面的内容？

(1)清洁生产工艺技术和过程：含先进的无废少废技术、高效的装备和完善的管理；

(2)清洁产品：使用中和使用后对人体和环境无害；

(3)清洁能源：包括常规能源清洁利用、采用节能技术、再生能源和新能源的开发利用。

六、综合题

1．试述非线性色谱的概念及其特点?

非线性色谱: 流动相中的样品浓度(Cm)与固定相中的样品浓度(Cs)不呈线性关系的色谱.分析色谱大多属于线性色谱;制备色谱大多属于非线性色谱

非线性色谱的特点

①.样品的保留值可变:非线性色谱的保留值随样品及其浓度的不同而变化;

②.峰形的不对称性:不是高斯正态分布的;

③.色谱峰的峰高与浓度不是线性关系:峰高增加的速率随浓度的增加而下降.

2．什么叫吸附等温线?研究吸附等温线有什么意义?

附等温线：指在一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系。

研究吸附等温线可以提供得到以下方面的信息：

①.预测代表该吸附等温线的组分在非线性色谱中色谱峰的形状；

②.为非线性色谱分离与纯化物质选择最佳条件；

③.反映被分离物质分子与固定相表面的作用，从而研究分子的构型及吸附状态。

④.建立分子结构-吸附之间的定量关系，从而由分子结构预测吸附性能。

3．做为优良的凝色谱介质应该具备什么基本特点?

①.介质本身为惰性物质，不与溶质、溶剂分子发生任何作用；

②.应尽量减少介质内含的带电离子基团，以减少特异性吸附，提高蛋白质的收率；

③.介质内孔径大小要分布均匀，即孔径分布较窄。

④.凝胶珠粒大小均匀；

⑤.介质要有良好的物理化学稳定性及较高的机械强度，易于消毒。

4．做为优良的HPLC填料应具备什么基本的物理化学特性?

在物理结构上的要求:

①合适的颗粒大小及较窄的粒度分布;

②一定的颗粒强度;

③一定的孔径大小和孔径分布,避免复杂的微孔结构;

④一定的溶胀及收缩水平;

优良的HPLC填料目前的主要发展方向:

①颗粒单分散的填料;

②贯穿性超大孔结构的填料;

③小颗粒的非多孔填料;

在化学结构上的要求:填料的化学结构,特别是颗粒表面和内孔表面的化学结构(如连接在基质上的官能基团或链段)是影响色谱热力学行为(保留值,选择性等)的主要因素

①特定的选择性;

②良好的化学稳定性;

③避免不可逆吸附;

5．试述羟基磷灰石做为一种有广阔发展前途的色谱填料的主要特点.

羟基磷灰石(hydroxyapatite, HAP)是一种弱阳离子或弱阴离子交换层析材料.其材料本是骨骼和牙齿等生物硬组织的主要无机成分,与生物组织有特异性的亲和力和相容性.其优点是:能精确地分离,纯化结构上只有微小差别的生物大分子.

做为一种优良的色谱填料,羟基磷灰石具有以下特点:

①.高机械强度:可以耐受15MPa以上压力,陶瓷HAP可以耐受几十MPa的压力.

②.高柱效:球形HAP颗粒大小,形状及孔隙大小均适合HPLC的要求.其颗粒及孔径小,有比较高的柱效.

③.化学和热稳定性:是磷酸钙盐中最稳定的,在中性和碱性不相中非常稳定,溶解度很低,热稳定性很高,可采用高温制备方法生产.

④.低的非可逆性吸附:HAP有非常低的非可逆性吸附.

⑤.表面修饰性:HAP表面比较容易进行各种化学修饰.

⑥.总之HAP:高选择性,高键合容量,低的非可逆吸附,良好的化学和热稳定性。

6．与传统的稀释法和透析法相比，液相色谱复性的优点是：

①.在进样后可很快的除去变性剂；

②.色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的分子聚集，从而避免了沉淀的产生，提高蛋白质复性的质量和活性回收率；

③.在蛋白质复性的同时，可使目标蛋白质与杂蛋白分离达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行；

④.便于回收变性剂，降低废水处理成本。

7．在对包含体蛋白质进行增溶和复性的过程中为什么要加入还原剂,同时为什么还必须加入金属螯合剂?常用的还原剂有哪些?在复性后为什么要加入氧化剂?常用的氧化剂有哪些?（见21）

8．什么叫双水相萃取?在双水相萃取中为什么要尽量将细胞碎片集中在下相?可以采取什么可能的措施在使细胞碎片尽量集中在下相的同时,使目标蛋白质尽可能集中在上相? 9．什么是径向色谱?径向色谱应用于生物物质分离有什么优点?

采用径向流技术的色谱，即样品和流动相沿径向流动，可以从色谱柱的周围流向圆心，也可以从圆心流向柱的周围。通常采用从柱的周围流向圆心的方式。

优点：

可以在较小的柱床层高度时使用较大的流动相速度；

在较高流动相速度时，反压降低；

可以线性地增加样品处理量，样品可以在完全相同的色谱条件下直接放大。

10．利用微载体进行动物细胞培养的优点有哪些？

微载体培养的优点:

①表面积/体积比大;

②微载体悬浮于培养基中,细胞生长环境均一,便于监测和控制;

③培养基利用率高;

④采样重演性好;

⑤收获过程不复杂;

⑥放大较容易;

⑦劳动强度小,占用空间小.

11．为什么动物细胞培养要用血清培养基？血清培养基使用有何缺点？

答：1）因为动物细胞正常生长所需要的一些必要成份均存在于血清中，而且这些成份的组成及其含量至今没有被阐明，因此只能直接采用血清进行培养，而目前寻找无血清的制品代替进行培养并没有获得广泛的成功。

2）采用血清培养基有以下缺点：

①血清是培养基成本的主要部分；血清中含有细胞生长必须的微量组分，但这些组分的成分及其作用至今未清楚，因此无法取代；