纤维素酶活力及混合纤维素酶协同作用的研究_冯月
纤维素酶活力及混合纤维素酶协同作用的研究
冯 月 蒋建新 朱莉伟 菅红磊
(北京林业大学材料科学与技术学院,林业生物质材料与能源教育部工程研究中心,木质材料科学与应用教育部重点实验室)
摘要:该文评价了4种商业纤维素酶的总酶活力、内切葡聚糖酶活力、外切葡聚糖酶活力及纤维二糖酶活力,并分析了不同来源的纤维素酶制剂混合后的酶活力的变化,以及表面活性剂对酶活力的影响。结果表明:纤维素酶复合酶系中的纤维二糖酶是影响整个纤维素酶活力的重要因素,且不同来源的纤维素酶中的内切、外切葡聚糖酶及纤维二糖酶之间存在同工酶的效应;加入的表面活性剂浓度不同,对各种酶制剂的酶活力影响不同。向其中两种混合后的纤维素酶中加入0.01%浓度的表面活性剂Tween 80,可以提高酶活力,促进纤维素的降解。关键词:纤维素酶;酶活评价;协同作用;表面活性剂
中图分类号:TQ352.79 文献标志码:A 文章编号:1000-1522(2009)增刊1-0169-05
FE NG Yue ;JIANG Jian -xin ;ZHU Li -wei ;JIAN Hong -lei .Cellulase activity and synergism of mixed
cellulases .Journal of Beijing Forestry Unive rsity (2009)31(Supp .1)169-173[Ch ,15ref .]College of Materials Science and Technology ,Engineering Research Center for Forestr y Biomass Materials and Bioener gy of Ministr y of Education ,Key Laboratory of Wood Materials Science &Application of Ministry of Education ,Beijing For estry University ,100083,P .R .China .
Activity of endoglucanase ,exoglucanase ,cellobiase and filter paper enzyme of four kinds of commercial cellulases were evaluated .Sources of cellulases were mixed ,and enzyme activities of these mixtures were then deter mined .The impact of surfactants on the enzyme activity was studied as well .Results showed that cellobiase was the key factor to the total complex cellulase system .Additionally ,the endoglucanases ,exoglucanases and cellobiases fr om different complex cellulase systems were able to act as isoenzymes .The effect of surfactant on the cellulase activity varied with the concentration of the sur factant .Surfactant Tween 80was added to two of the mixed c ellulases in a concentration of 0.01%,which increased the cellulase activity and hastened the degradation of cellulose .
Key words cellulase ;enzyme activity evaluation ;synergism ;surfactant 收稿日期:2008-08-15
http : www .bjfujournal .cn ,http : j ournal .bjfu .edu .cn
基金项目:教育部新世纪优秀人才资助计划项目(NCET -07-0082)、中国博士后科学基金项目(20060400401)。
第一作者:冯月。主要研究方向:生物质能源。电话:138******** Email :fengyueabc77@yahoo .com .cn 地址:100083北京林业大学材料科学与技术学院。
责任作者:蒋建新,博士,副教授。主要研究方向:林产化学及生物质能源。电话:137******** Email :jiangjx @bjfu .edu .cn 地址:同上。
目前,随着“不与人争粮,不与粮争地,不污染环境”成为解决能源危机的必要条件,人们越来越倾向于利用地球上丰富的纤维素资源生产石化燃料的替代品生物乙醇。因此,研究人员已开始广泛研究可将纤维素降解为葡萄糖的纤维素酶,目前降低纤维素酶的生产成本以及不断提高酶活力成为主要的研究目标。纤维素酶降解纤维素为葡萄糖,涉及到内切葡聚糖酶(endo -1,4-β-D -glucanase ,EC 3.2.1.4,E G )、外切葡聚糖酶(exo -1,4-β-D -glucanase ,EC 3.2.1.91,又称纤维二糖水解酶,CBH )及纤维二糖酶(β-glucosidase ,E C 3.2.1.21,又称β-葡萄糖苷酶,CB )之间的协同作用[1
-2]
,大部分商业
纤维素酶制剂都含有以上复合酶系,且不同来源的纤维素酶其复合酶系的组成也不尽相同。表面活性剂在降低发酵液表面张力的同时也可提高微生物细胞膜的通透性,促进还原糖更好的被酵母菌利用,从而提高乙醇产率
[3]
。表面活性剂对纤维素酶活力的
促进或抑制作用,对研究开发纤维素同步糖化发酵转化生物乙醇有重要意义。本文主要针对商业酶制剂对于标准底物的外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶及纤维二糖酶酶活力进行评价,并初步研究了不同来源的酶制剂混合后总酶活力的变化,以及不同浓度
第31卷 增刊12009年1月
北京林业大学学报JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol .31,Supp .1Jan .,2009
的非离子表面活性剂对酶活力的影响。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
实验所用羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、纤维二糖及葡萄糖均来自Sigma公司的进口分装。Whatman No.1定量滤纸为Whatman International Ltd.公司进口。
1.2 仪 器
UV-2000型紫外-可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 待测酶液的制备
本实验选用4种来自不同厂家的纤维素酶制剂,即A、B、C及D酶(诺维信Celluclast1.5)进行分析。将酶制剂用蒸馏水溶解稀释,配制成5mg mL 的酶液备用。
1.3.2 葡萄糖标准曲线的测定
分别量取不同体积的葡萄糖标准溶液进行反应,再用分光光度计在540nm波长处测定其吸光度,以葡萄糖含量(mg)为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
1.3.3 内切葡聚糖酶活力的测定
按照国际理论应用化学协会(I UPAC)推荐的国际标准方法测定[4]。
向试管中各加入1.0mL1%的羧甲基纤维素钠柠檬酸-柠檬酸钠溶液,及0.5mL酶液在50℃水浴中保温30min,取出后加入1.5mL DNS试剂终止反应,加热、定容后在540nm波长处测定吸光度。
内切葡聚糖酶活力(E G)定义:以C MC-Na为底物,在50℃,pH4.8,恒温30min的条件下,以水解反应中每分钟催化C MC-Na水解形成1μmol葡萄糖的酶量为一个单位,用U g表示。
1.3.4 外切葡聚糖酶活力的测定
向试管中各加入10.0mg微晶纤维素、1.0mL 缓冲液及0.5mL酶液在50℃水浴中保温30min,取出后加入1.5mL DNS试剂终止反应。加热、定容后在540nm波长处测定吸光度。
外切葡聚糖酶活力(CBH)定义:以微晶纤维素为底物,在50℃,pH4.8,恒温30min的条件下,以水解反应中每分钟催化微晶纤维素水解形成1μmol葡萄糖的酶量为一个单位,用U g表示。
1.3.5 纤维二糖酶活力的测定
按照国际理论应用化学协会推荐的国际标准方法测定[4]。
向试管中各加入1.0mL15.0mmol L的纤维二糖柠檬酸-柠檬酸钠溶液,及0.5mL酶液在50℃水浴中保温30min,取出后加入1.5mL DNS试剂终止反应。加热、定容后在540nm波长处测定吸光度。
纤维二糖酶活力(CB)定义:以纤维二糖为底物,在50℃,pH4.8,恒温30min的条件下,以水解反应中每分钟催化CMC-Na水解形成1μmol葡萄糖的酶量为一个单位,用U g表示。
1.3.6 纤维素酶总酶活力的测定
按照国际理论应用化学协会推荐的国际标准方法测定[4]。
向试管中各加入1c m×6cm的Whatman No.1定量滤纸,1.0mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液及0.5 mL酶液在50℃水浴中保温1h,取出后加入1.5mL DNS试剂终止反应。加热、定容后在540nm波长处测定吸光度。
总酶活力(滤纸酶活力FP A)定义:以滤纸为底物在50℃,pH4.8,恒温1h的条件下,以反应中每分钟水解纤维素形成1μmol葡萄糖的酶量为一个单位,用U g表示。
1.3.7 纤维素酶混合酶液酶活力的测定
将A、B、C、D4种酶液分别以5∶5及7∶3两种比例(质量比)两两混合,然后根据上述方法测定混合后酶液的滤纸酶活力。
1.3.8 表面活性剂对酶活力的影响
向试管中分别加入不同浓度的非离子表面活性剂Tween80、A酶溶液、缓冲液及滤纸,在50℃水浴中反应1h,取出后加入1.5mL DNS试剂终止反应。加热、定容后在540nm波长处测定吸光度,并确定滤纸酶活力增加最多时添加的表面活性剂浓度,在该浓度下测定5∶5及7∶3两种比例的混合酶液滤纸酶活力的变化情况。
2 结果与讨论
2.1 纤维素酶酶活力
2.1.1 葡萄糖标准曲线
用DNS法在540nm下测定的葡萄糖标准曲线方程为:y=0.6762x-0.0846(R2=0.9998)。
2.1.2 内切葡聚糖酶酶活力
纤维素复合酶系中内切酶的主要作用是在纤维素内部的非结晶区随机切断纤维素长链的β-1,4-糖苷键,生成纤维寡糖、纤维三糖或纤维二糖等长度不等的短链低聚糖,这些低聚糖再经纤维二糖酶进一步水解生成终产物葡萄糖[5]。
通过上述方法分别测得了4种商业纤维素酶的内切葡聚糖酶酶活力:A酶为56.5U g,B酶为76.1 U g,C酶为87.7U g,D酶为96.9U g。从图1中可
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以看出D 酶的活力高于其他三者,比A 酶的活力高出71.5%,可见D 酶的内切酶活力较高是致使其总酶活力也较高的原因之一。
2.1.3 外切葡聚糖酶酶活力
外切葡聚糖酶主要作用于纤维素的结晶区,可破坏其结晶结构并从纤维素长链的非还原端逐一水解出纤维二糖,所以又称纤维二糖水解酶。实验测定了4种商业纤维素酶的外切葡聚糖酶酶活力(如图1所示):A 酶为31.2U g ,B 酶为37.8U g ,C 酶为55.4U g ,D 酶为60.6U g 。可以看出D 酶活力亦高于其他三者,且A 酶与B 酶的活力相近,C 酶与D 酶的相近。
外切葡聚糖酶主要由催化域(Catalytic domain ,CD )和结合域(Cellulose binding domain ,CBD )两部分构成,其中起到吸附作用的结合域可以结合到不溶纤维素的表面,并将单个葡萄糖链从纤维素表面疏解下来[6
-7]
,从而破坏整个纤维素的结晶结构,使得
更多的纤维素长链分子暴露在外,以便内切酶及纤
维二糖酶继续水解。因此即使内切葡聚糖酶活力不是很高,C 酶的总酶活力也要比A 酶和B 酶高出许多
。
图1 4种纤维素酶的外切葡聚糖酶、内切葡聚
糖酶、纤维二糖酶及滤纸酶活力
FIGUR E 1 Activit y of endogl ucanase ,exoglucanas e ,cellobiase
and fil ter paper enzyme of four kinds of cell ulases
2.1.4 纤维二糖酶酶活力
纤维二糖酶主要用于水解反应中生成的纤维二糖。纤维二糖对纤维素外切酶具有较强的可逆竞争性反馈抑制作用。其通过与外切酶的结合域结合使酶分子的构象发生变化,减弱了结合域对纤维素长链的吸附能力,成为无效吸附
[8]
,使得底物不能很好
的被催化域水解;且纤维二糖还可以在催化域的活性中心与色氨酸结合生成空间位阻,导致单个的纤维素分子很难进入细小的活性中心[9]。不过此种抑制作用为可逆性抑制[10],只要复合酶系中含有足够的纤维二糖酶就可以消除这种抑制
[11]
。
如图1所示,A 、B 及C 酶的纤维二糖酶活力很低,而只有D 酶的纤维二糖酶活力较高,为71.5U g 。由此可知,造成A 酶和B 酶的总酶活力较低的首要原因就是二者的纤维二糖酶活力太低,不断积累的纤维二糖对纤维素外切酶产生了反馈抑制作用,影响了总酶活力。这说明纤维二糖酶活力是制约整个纤维素酶活力的首要因素。2.1.5 纤维素酶的滤纸酶活力
滤纸酶活力即纤维素酶的总酶活力归功于内切、外切葡聚糖酶及纤维二糖酶三者协同作用的结果[1-2]。即外切酶首先作用于纤维素的结晶区,破坏其结晶结构,再由内切酶深入内部将纤维长链切割成短链的低聚糖,最后再由纤维二糖酶将这些中间产物降解为葡萄糖。
由图1可以看出,在4种商业纤维素酶中,D 酶的滤纸酶活力(221.4U g )明显高于其他三者,为A 酶的5.18倍,且C 酶也较A 酶和B 酶的酶活力高出许多。由于具有较高的纤维素内切酶、外切酶活力的D 酶其纤维二糖酶活力也不低,基本上可将生成的纤维二糖转化为葡萄糖,消除其对外切酶的抑制作用[11]
,因此成为所研究的4种酶中总酶活力最高的一个。此外,内切、外切葡聚糖酶及纤维二糖酶单独酶活的加和应小于三者组成的复合酶系的总酶活。而从图1可以看出A 、B 酶的内切酶活力要比二者的总酶活力高,表明二者的外切酶活力受到产物纤维二糖的抑制,使得其复合酶系不能打开滤纸纤维的结晶区,以至于内切酶活力无法发挥到最高水平。因此二者虽然有较高的内切酶活力,但是总滤纸酶活力却偏低。
2.2 纤维素酶的混合酶液活力
纤维素复合酶系通过内切、外切葡聚糖酶及纤维二糖酶之间的协同作用,最终实现了纤维素到葡萄糖的有效转化。不过其中一种酶活力较低就会影响总的酶解效率,因此不同来源的纤维素酶制剂之间的协同作用也是值得研究的。
实验将4种酶液以5∶5比例两两混合后测得的总酶活力(滤纸酶活力)见图2。可以看出D 酶与其他3种酶液混合后总酶活力有所提高,其中A 酶与D 酶混合后酶活力最高,较混合前的D 酶高出14.7%。而A 、B 、C 酶之间两两混合后酶液的活力虽然都未曾高于混合前酶活力较高的纤维素酶,但与低酶活的相比还是稍有提高。当低活力酶与高活力酶的混合比例为7∶3时,酶活力较高的也是D 酶与其他3种酶混合后的酶液(见图2)。其中也是A 酶与D 酶混合后酶活力最高,但与混合前的D 酶相比降低了2.1%。而其余3种酶之间混合后与高酶
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增刊1冯 月等:纤维素酶活力及混合纤维素酶协同作用的研究
活的非混合酶相比,其活力亦未见改善,且4种酶之间以7∶3的比例两两混合后的酶活力都要比5∶5比例混合的低
。
图2 纤维素酶混合酶液的滤纸酶活力
FIGUR E 2 Filter paper enzyme activity of mixed cell ulases
分析上述结果发现:混合酶液的总酶活力都要高于混合前活力较低的酶,且无论5∶5还是7∶3的混合比例,D 酶与A 酶混合后的总酶活力增加的最多。前面提到制约A 酶总酶活力的因素为纤维二
糖酶的酶活力,而恰巧D 酶的纤维二糖酶活力较高,可以大量水解生成的纤维二糖以减少其对A 酶的纤维素外切酶的抑制作用,使更多的外切酶活力释放出来
[8]
。因此认为对于D 酶而言,A 酶的纤维
素内切酶以及降低了反馈抑制作用的外切酶都起到
了同工酶的作用[12],提高了整个反应体系中纤维素内切、外切酶的酶活力,更好的促进了纤维素结晶区的松散和无定形区的水解,从而提高了酶解效率,增加了整个复合酶系的酶活力。但毕竟A 酶本身的纤维素内切、外切酶的酶活力并不是很高,且降低混合酶中D 酶的比例,纤维二糖酶也要随之减少,所以增大A 酶比例后混合酶活力会降低。同理分析B 酶、C 酶与D 酶混合的结果也可得到上述结论。至于不含有D 酶的其他3种混合酶液的总酶活力都未见提高,也是基于纤维二糖酶活力过低的原因。其中A 、B 酶分别与C 酶混合的结果表明:虽然C 酶的纤维二糖酶活力不高,却足可以减少一部分纤维二糖的抑制作用;且由于反应体系中原本纤维二糖酶含量就不高,减少C 酶的比例对整个酶活力的影响也就不会很大。而A 酶与B 酶以7∶3的比例混合后,酶活力要比5∶5比例混合后的低,更说明了过多的纤维二糖积累是抑制总酶活力的关键。由此可知,要提高混合纤维素酶的总活力,提高纤维素复合酶系中纤维二糖酶的含量是很有必要的。2.3 表面活性剂对酶活力的影响
表面活性剂可以降低纤维素的表面张力,提高
纤维素这种高分子聚合物的亲水性
[13]
,使其更易与纤维素酶结合,提高酶的降解效率。此外表面活性剂还降低了溶液中的表面张力,从而使纤维素酶在整个反应体系中分散的更均匀,并能促进酶与底物
的结合[14],因此可以提高纤维素酶活力。经测定,A 酶的滤纸酶活力随加入的非离子表面活性剂Tween 80的浓度不同而变化。如图3所示,当加入的浓度(质量与体积比)为0.007%、0.01%、0.03%及0.05%时,A 酶的滤纸酶活力都有所提高,其中表面活性剂浓度为0.01%时A 酶的滤纸酶活力达到最大值48.1U g ,较加入前提高了6.3%。
图3 Tween 80添加量对A 酶滤纸酶活力的影响FIGURE 3 Effect of content of surfactant Tween 80on the filter
paper enz yme activit y of cellulase A
分别向A 与B 酶、C 及D 酶的混合酶液中加入0.01%的表面活性剂Tween 80(见图4)。从图4可以看出B 、C 酶加入0.01%的Tween 80后其酶活力
都有所增加,与A 酶混合后酶活力也略微提高。其中A 酶与B 酶以7∶3比例混合时加入Tween 80后酶活力增加的最多,为16.0%。而加入相同浓度的表面活性剂后D 酶的酶活力受到很大影响,尤其是与A 酶混合后酶活力降低的更多,其中二者以5∶5比例混合的酶液加入Tween 80后其滤纸酶活力降低了24.5%。
图4 表面活性剂Tween 80对混合酶液的滤纸
酶活力的影响
FIGURE 4 Effect of s urfactant Tween 80on the filter
paper enzyme activity of mi xed cellul as es
由此可以看出加入0.01%浓度的表面活性剂
172北 京 林 业 大 学 学 报第31卷
也可以提高其他酶制剂的总酶活力,尤其是A酶与B酶以7∶3比例混合时的酶活力。这说明非离子表面活性剂Tween80对部分纤维素酶有促进作用。然而相同的表面活性剂对于不同的酶作用结果也不同[15],加入0.01%的Tween80降低了D酶以及其与A酶混合后的酶活力,分析原因可能是表面活性剂浓度偏高,影响了纤维素酶中蛋白质的活性,导致酶活力降低。由此可知,加入低浓度的非离子表面活性剂可以提高纤维素酶的活力。但不同的酶其最适表面活性剂浓度不同,尤其对于混合后的纤维素酶,加入其中一种酶最适浓度的表面活性剂不一定能够提高整个混合酶系的酶活力。不过添加合适浓度的表面活性剂,可以促进同步糖化发酵中纤维素的酶解和酵母菌的发酵[3],这对降低燃料乙醇的生产成本有着重要意义。
3 结 论
随着人们对开发燃料乙醇的重视,商业纤维素酶已层出不穷。这些酶普遍来自里氏木霉、黑曲霉等霉菌发酵。得到的纤维素酶不仅成本高,且复合酶系中内切、外切葡聚糖酶及纤维二糖酶比例不均,酶活各异,因此通常总的纤维素酶活力较低。本实验主要针对4种商业纤维素酶进行了分析。结果表明:纤维素酶复合酶系中内切、外切葡聚糖酶活力较高,而纤维二糖酶活力较低,不断累积的纤维二糖抑制了外切葡聚糖酶活力,从而成为制约整个纤维素酶活力的关键。不同来源的纤维素酶中内切、外切葡聚糖酶及纤维二糖酶之间存在同工酶效应,可将纤维素酶制剂混合使用或者向酶制剂中补充纤维二糖酶以提高总酶活力,降低纤维素转化中酶的成本。加入低浓度的非离子表面活性剂,可以提高纤维素酶的活力,且向混合后的纤维素酶中加入一定浓度的表面活性剂,也可以促进纤维素的降解;添加合适浓度的表面活性剂可以促进同步糖化发酵中纤维素的酶解和酵母菌的发酵[3],这对降低燃料乙醇的生产成本有着重要意义。
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(责任编辑 赵 勃)
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