CTAB配方及植物DNA提取方法

主要试剂的配制

参考（美）萨姆布鲁克（Sambrook，J.）等.分子克隆实验指南（下册）配置如下[94]：

（1）0.5 mo1/L EDTA(pH 8.0)：称取EDTA-Na2 18.61 g，加80 mL双蒸水，磁力搅拌器上剧烈搅拌。加入7 mL 10 mo1/L NaOH调至pH 8.0再用双蒸水定容到100 mL，在1.03×105Pa下高压灭菌20 min。

（2）5 mol/L NaCl溶液：称取NaCl 29.22 g，溶解于90 mL的双蒸水，加热到80℃溶解，冷却，再用双蒸水定容100 mL，在高压灭菌20 min。

（3）10 mol/L NaOH溶液：称取40.00 g NaOH溶于80 mL的双蒸水，搅拌，定容到100 mL。

（4）1 mol/L Tris-HC1溶液(pH 8.0)：称取12.114 gTris碱，溶于80 mL的双蒸水，加入浓HC1 4.2 mL，调整PH值到8.0，加水定容到100 mL，高压灭菌20min。（5）10%CTAB（m/v）：称取CTAB 10.00 g，溶解于80 mL的双蒸水，加热促进溶解，加双蒸水定容到100 mL，室温保存。

（6）5 mo1/L KAc溶液(pH 4.8和6.5)：分别称取KAc晶体49.07 g，溶于80 mL的双蒸水，再用冰乙酸调至pH 4.8和6.5，加双蒸水定容到100 mL，在1.03×

105Pa下灭菌20 min。4℃保存。

（7）3 mo1/L NaAc·3H2O溶液(pH 5.2)：称取NaAc晶体20.412 g溶解于约30 mL 的双蒸水，用冰乙酸调至pH 5.2，加双蒸水定容到50 mL，高压灭菌20 min。4℃保存。

（8）提取缓冲液（0.4 mol/L葡萄糖，3%PVP，2％β-巯基乙醇）250 mL：称取葡萄糖19.817 g、PVP 7.50 g，加水溶解并定容到250 mL，在1.03×105Pa下灭菌20 min，β-巯基乙醇现用现加。4℃保存。

（9）裂解缓冲液（3%CTAB；100 mmo1/L Tris-HC1，pH 8.0；20 mmo1/LEDTA，pH 8.0；1.4 mol/L NaCl；2％β-巯基乙醇）100 mL：取10%CTAB 30 mL，加1mol/LTris～HC1(pH 8.0)10 mL，加0.5 mo1/L EDTA(pH8.0)4 mL，加5 mol/LNaCl 28 mL并定容到100 mL，高压灭菌20 min，β-巯基乙醇现用现加。

（11）TE缓冲液(10 mmo1/LTris-HC1，pH 8.0；1 mmo1/L EDTA，pH 8.0)：取Tris-HCl溶液(pH 8.0)1 mL，EDTA(pH 8.0)0.2 mL，用双蒸水定容到100 mL，高压灭菌20 min。4℃保存。

（12）电泳缓冲液TAE（Tris-乙酸）的配制

50×TAE母液的配制：242.0 g Tris-Bace、57.1 mL冰乙酸、100 ml 0.5mo1/L EDTA(pH 8.0)，用双蒸水空容至1000 mL。

1×TAE电泳缓冲液的配制：取50×TAE 10 mL，再加入490 mL双蒸水，定容至500mL

方法

丝瓜DNA的提取与纯化

CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法从预处理过的丝瓜叶片中取出一到两片，做好标记备用：

（1）称取1.5 g丝瓜预处理过的嫩叶片于预冷研钵中，置于液氮中，迅速研磨三到四次成粉末状。

（2）将粉末状材料转入10 mL的灭菌离心管中，立即加入3 mL 65℃预热的裂解缓冲液和60μL的β-巯基乙醇，充分混匀，在65℃水浴中保温45 min间摇动离心管三到四次)。

（3）加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（V/V/V=25/24/1），轻轻颠倒离心管匀，上部呈乳状液为止，室温下12000 r.min-1离心10 min。

（4）取上清液至10 mL的灭菌离心管中，加入等体积的氯仿/异（V/V=24/1），轻轻颠倒离心管，混匀，室温下12 000 r.min-1离心10 min。

（5）把上清液转移到10 mL的灭菌离心管中，加入2/3倍体积并于-20°C预冷的异丙醇，轻轻晃动，于-20℃静置30 min。

（6）4℃下8000 r.min-1离心5 min，收集沉淀。倾去上清液，用75%（的乙醇漂洗沉淀2次（每次1 mL），将离心管倒置在吸水纸上，风干。

（7）沉淀用50μL TE缓冲液溶解，并加入0.5μL 10 mg/mL RNase，使RNA酶的终浓度为10μg/mL，轻轻混匀，于37℃水浴中温浴45～60 min。

（8）在离心管加入TE缓冲液300μL，再用等体积的氯仿/异戊醇(V/V=24/1)

抽提，轻缓颠倒混匀，于4℃下12000 r.min-1离心10 min。

（9）取上相，加入1/10体积的3 mo1/L NaAc（pH 5.2)，轻轻混匀，再加入2.5倍体积并于-20℃预冷的无水乙醇，混匀，于-20℃静置30 min。

（10）4℃下8000 r.min-1离心5 min，收集沉淀。倾去上清液，用75%乙醇漂洗沉淀2次（每次1 mL），真空抽干。

（11）真空抽干之后将DNA溶100 ul TE溶液再加入1 uL Rnase(10mg/L)，并于37℃保温30 min，-20℃保存备用。

丝瓜基因组DNA浓度和纯度的测定

从提取的DNA样品中取出1μL，用TE稀释到100μL，然后用UV-1810型紫外/可见分光光度计，分别测定260 nm和280 nm的吸光值OD260和OD280，计算检测DNA的纯度、浓度和产率。

DNA纯度＝OD260/OD280；

DNA浓度（ng/μL）＝OD260×50μg/mL×100倍

DNA产率（ng/g·FW）＝OD260×50μg/mL×100倍×50μL/0.5 g

丝瓜基因组DNA的电泳检测

采用1×TAE电泳缓冲液的配制1.5%的琼脂糖凝胶，充分凝结之后，电泳检测提取的DNA 完整性。取5μL DNA溶液与1μL 6×Loadingbuffer（溴酚蓝）充分混合均匀后点样，在电压120 V、电流300 A下电泳45 min，溴化乙锭（EB）染色15 min，凝胶成像系统拍照保存，备份原始数据。

主要溶液如下：

1）1M Tris-HC1（pH 8.0）：在800mL水中溶解121g Tris碱，用浓HC1调节pH至所需值pH 8.0（约42mL HC1），加水定容1000mL，分装后高压灭菌。2）0.5M EDTA（pH 8.0）：在400mL水中加入90.05g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2·2H2O），搅拌溶解，用NaOH调pH至8.0（约10g NaOH颗粒），定容至500mL，高压灭菌。

3）5 M NaCl：称取292.2 g NaCl，用双蒸水定容到1000mL，高压灭菌备用。4）TE缓冲液（pH 8.0）：10mM Tris-HC1（pH 8.0），1.0mM EDTA（pH 8.0）。5）2×CTAB提取液（pH 8.0）：2％（w/v）CTAB，1.4 M NaCl，20mM EDTA，100mM Tris-HC1，0.2%巯基乙醇（v/v）。即称取CTAB 2 g，加蒸馏水40mL，加1 M Tris-HCl（pH 8.0）10mL、0.5 M EDTA（pH 8.0）4mL和5 M NaCl 28mL，待CTAB溶解后用蒸馏水定容到100mL。

CTAB提取DNA缓冲液配方

CTAB 4g

NaCl 16.364 g

1M Tris-HCl 20ml( PH8.0)

0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌。

TE缓冲液配方

TE的组成浓度为：10mM Tris-HCl ；1mM EDTA PH=8.0，配制过程如下：

量取下列溶液于500ml烧杯中

1M Tris-HCl Buffer PH=8. 0 5ml

0.5M EDTA PH=8.0 1ml

向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存.