高效液相色谱_串联质谱法同时测定中药中的玉米赤酶烯酮和_玉米赤霉烯醇

[基金项目] 科技部重大新药创制专项(2009ZX095022025)及国

家中医药管理局2008年度中医药行业科研专项(200807042)

[作者简介] 申红红,女,硕士研究生,主要从事药物分析方面研

究。

*通讯联系人,E-m ai:l yang m e i hu a15@hot m ai.l co m

论著

高效液相色谱-串联质谱法同时测定中药中的

玉米赤酶烯酮和 -玉米赤霉烯醇

申红红1,2

,仇峰1

,杨美华*

,欧阳臻

2

(1.中国医学科学院药用植物研究所,北京 100094;2.江苏大学药学院,江苏镇江 212013)

[摘要] 目的:建立同时测定中药中真菌毒素玉米赤酶烯酮(ZON )和 -玉米赤霉烯醇( -ZOL )的高效液相色谱-串

联质谱法,对市售中药材及其制品中的ZON 和 -ZOL 进行检测。方法:样品经甲醇-水溶液(80 20,v /v)提取,免疫亲和柱净化,C 18分析色谱柱分离,以0.1%(v /v )甲酸-水/0.1%(v /v)甲酸-乙腈为流动相,采用梯度洗脱方式进行液相色谱分离,多反应监测模式,以染料木素为内标进行定量。结果:在0.1ng m l -1~500ng m l -1范围内,ZON 和 -ZOL 的线性相关系数分别为0.9981和0.9988。通过添加回收试验,两种毒素的定量限(S /N =10)均为0.12 g kg -1,ZON 三个添加水平的回收率为74.4%~96.5%,相对标准偏差为1.7%~5.0%; -ZOL 三个添加水平的回收率为89.3%~98.3%,相对标准偏差为1.5%~8.1%。结论:该方法简单快速、灵敏度和选择性高,适用于中药中微量真菌毒素ZON 和 -ZO L 的检测。

[关键词] 高效液相色谱-串联质谱;中药;玉米赤酶烯酮; -玉米赤霉烯醇[中图分类号] O 657.63 [文献标识码] A

[文章编号] 1004-8685(2011)06-1322-04

Si m ultaneous deter m i n ation of zearalenone and -zearalenol i n traditional Chi n ese m ed icines by high perfor m ance liquid chro m atography -tande m m ass spectro m etry

S H EN H ong -hong 1,2,Q I U Feng 1,YAN G M ei -hua 1*,OU -YAN G Zhen

2

(1.Instit ute o fM edicina l P lant D evelopment ,Chinese A cade m y of M ed i ca l Sc iences ,P ek i ng U n i on ,Be iji ng ,100193,Ch i na ;2.Schoo l o f Phar m acy ,Ji ang su U n i versity ,Zhen jiang 212013,China)[Abstract] O bjective :T o eva l uate a m ethod for t he de ter m i nati on of zeara lenone and -zearaleno l by H PLC -M S /M S i n 25w i dely consu m ed Ch i nese medic i nal he rbs and re lated products (C MHRP )sa m ples co llected from different reg i ons of Ch i na .M ethods :The sa m ples were ex tracted by m ethano l-w ater (80 20,v /v),cleaned up by i m munoaffi nity co l u mn .T heH PLC sep a ra tion w as perfor m ed on a C 18co l umn w ith a li near g rad i ent eluti on prog ram o f 0.1%(v /v )for m ic ac i d so l ution and 0.1%(v /v )fo r m ic ac i d-aceton itr ile as t he m ob ile phase .M ulti p l e reacti on mon it o ri ng (M RM )w as used fo r the se lecti ve detec tion of ZON and -ZOL.R esu lts :T he linear ity o f ZON and -ZOL i n the range from 0.1t o 500ng m l -1w as 0.9981and 0.9988,respectively .In the de tecti on o f sp i ked sa m ples ,the quantificati on li m it of the m ethod w as 0.12 g /kg f o r the t w o tox i ns .T he re cover i es of ZON we re 74.4%~96.5%w it h the relative standard dev iati ons of 1.7%~5.0%,and t he recover i es of -ZOL w ere 89.3%~98.3%w it h t he relative standard dev iati ons of 1.5%~8.1%.Interna l standard cali brati on w as used for the quantitati ve analysis .Con cl u si on:Th ism ethod w as si m ple ,fast ,h i ghly sensiti ve and selecti ve f o r the detection of ZON and -ZOL i n trad iti ona l Ch i nese m edic i na ls .[K ey words] H i gh per f o r m ance liqu i d chro m a t og raphy-tande m m ass spectrom etry ;T rad iti ona l Ch i nese m ed i c i nes ;ZON; -ZOL

玉米赤霉烯酮(zeara l enone ,ZON ),又称F -2毒素,是由禾谷镰刀菌、三线镰刀菌及串珠镰刀菌等产生的一种雌激素

类真菌毒素。在动物及人体内,ZON 可以代谢产生 -ZOL ( -zea ra l eno ,l -ZOL ), -玉米赤霉烯醇( -zeara l eno ,l

-ZOL )以及其他一些产物;但在各种污染的谷物及饲料中仅能检测到ZON 和 -ZOL [1~3]。ZON 及其代谢物对动物及人类的危害主要表现在影响和破坏生长发育及生殖系统方面,人畜误食含有该毒素的食物后,会引起雌性激素中毒症,造成生殖系统的严重损害[4]。 关于食品、农产品以及动物饲料中ZON 和 -ZOL 的分析方法已有相关的研究报道[5~7]。但尚未见有关中药中ZON

和 -ZOL检测的相关报道。中药广泛用于人类疾病的防治,一些中药材也作为香料,食品添加剂或作为食品被广泛使用。因此,针对中药成分的复杂性,非常有必要建立同时测定中药中ZON和 -ZOL含量的灵敏、专属的分析方法,以避免共存成分的干扰。本文首次采用免疫亲和柱净化,建立了高效液相-串联质谱法同时检测中药中ZON和 -ZOL含量的方法。该方法简单快速、灵敏度和选择性高。

1 仪器与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(日本岛津公司);AP I4000三重四级杆质谱仪;Q ili nbe i e r旋涡混合器;H eraeus M ultifuge X3R低温高速离心机。

ZON对照品购于F er m entek公司; -ZO L购于S i gm a-A l dr ich公司;甲醇(色谱纯,S i gm a-A l drich);内标物染料木素(陕西慧科植物开发有限公司);乙腈(色谱纯,S i gm a-A l dr ich);甲酸(北京化学试剂厂);实验用水为M illi po re纯水系统制得的高纯水;其他试剂均为市售国产分析纯试剂;Z ea r a la test TM免疫亲和柱购于维康公司;25个中药样品购于全国各地,其中中药材样品由杨美华研究员鉴定。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱为Pheno m enex G em ini C

18

柱(20mm 2.00mm,3 m)。流动相:A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为乙腈(含0.1%甲酸,v v)。梯度洗脱程序: 0.01m i n~0.6m i n,90%A;0.61m i n~1.30m i n,90%A~5% A;1.30m i n~2.50m i n,5%A;2.51m i n~4.00m in,90%A。流速:0.50m lm i n-1。柱温:20 。进样量:10 l。

1.2.2 质谱条件 离子源:ES I;扫描方式:负离子扫描;雾化气(GS1)压力:60ps;i辅助气(G S2)压力:60ps;i离子喷雾电压(IS):-4500V;气帘气(CUR)压力:12ps;i毛细管温度: 550 ;检测方式:多反应监测扫描模式(M RM);两种毒素以及内标的检测离子对,去簇电压(D P),碰撞室出口电压(CXP),碰撞能量(CE)等质谱参数见表1,ZON, -ZOL以及内标的质谱图见图1。

表1 ZON和 -ZOL及内标测定的质谱检测参数

毒素及内标母离子(m/z)子离子(m/z)DP/V CE/eV CX P/V

ZON317.0131.0;174.8*;272.9-90-28;-34;-40-9;-7;-15 -ZOL319.0130.0;159.9;274.9*-95-30;-44;-46-5;-9;-13 I S268.9158.8-95-40-10

注:*定量离

子

图1 (A)ZON标准品的MRM二级质谱图;(B) -Z O L标准品的M R M二级质谱图;(C)内标的MRM二级质谱图

1.2.3 标准溶液及PBS缓冲液的配制 分别称取ZON和 -ZO L标准品5mg于100m l容量瓶中,加乙腈溶解并定容,得到质量浓度为50 g m l-1的标准储备液。分别取ZON和 -ZO L标准储备液各10 ,l加980 l空白溶液(以与样品同法处理的洗脱液),获得同时含有500ng m l-1ZON和500ng m l-1 -ZOL的标准工作溶液。

PBS缓冲溶液的配制:称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾溶于900m l水中,用浓盐酸调节p H至7.0,用水定容至1000m l。

1.2.4 供试品溶液的制备 准确称取干燥粉碎的样品12.5g 于三角锥形瓶中,加入1.25g氯化钠及50m l甲醇 水(80 20, v/v),摇床振摇1h,过滤,取10m l滤液加入10m l PBS稀释,用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,滤液备用。吸取上述滤液10m l于玻璃注射器中,以1滴/秒通过免疫亲和柱直至2m l~ 3m l空气通过,再加10m l水以2-3滴/s的速度淋洗免疫亲和柱,弃去流出液,并使2m l~3m l气通过免疫亲和柱。准确加入1.5m l甲醇以1m lm i n-1~2m l m in-1洗脱,收集洗脱液定容至2m,l取洗脱液100 ,l加入5 l浓度为500ng m l-1的内标(IS)染料木素乙腈溶液,3000rp m离心10m i n,取上清10 l进样。

1.3 结果

1.3.1 方法的线性范围 各取100 l不同浓度的标准系列溶液(同时含有相同浓度的ZON和 -ZOL,浓度依次为0.10ng m l-1,0.20ng m l-1,0.50ng m l-1,

2.0ng m l-1, 10.0ng m l-1,50.0ng m l-1,100ng m l-1,200ng m l-1, 500ng m l-1)和5 l浓度为500ng m l-1的内标溶液, 3000rp m离心10m i n,取上清10 l进样。分别以待测物质与内标峰面积的比值对对照品的浓度作线性回归,权重因子为1/X2,得相应的回归方程。ZON的线性方程为Y=0.230X+ 0.00174,r=0.9981; -ZOL的线性方程为Y=0.0725X+ 0.00284,r=0.9988,线性范围均为0.10ng m l-1~ 500ng m l-1。

1.3.2 日内,日间精密度试验 日内精密度试验:取处理好

的对照品溶液,连续进样测定5次,测得ZON和 -ZOL的RSD分别为3.0%和3.8%。日间精密度试验:取处理好的对照品溶液,每天进样一次,连续进样5d,测得ZON和 -ZOL 的RS D分别为3.4%和4.7%。

1.3.3 重复性 精密称取含有ZON的样品(薏苡仁,北京-5),按建立的供试品溶液制备方法平行制备5份供试品溶液,并进行检测,测得ZON含量的RS D为3.7%,结果表明方法的重现性较好。

1.3.4 方法回收率、精密度、检出限和定量限 采用在空白样品中添加标准溶液的方法,对三种具有代表性的中药材生麦芽,党参和焦神曲进行添加回收率实验,三个添加水平分别为30 g/kg、60 g/kg、300 g/kg,每个水平进行三次试验,平均加样回收率和精密度见表2。以信噪比(S/N)为3:1,测得ZON和 -ZOL的检出限均为0.6 g kg-1;以信噪比(S/ N)为10 1,测得ZON和 -ZOL的定量限均为1.2 g kg-1。

表2 玉米赤酶烯酮和 -玉米赤霉烯醇的

加标回收率和精密度(n=3)

药材

添加水平

( g kg-1)

Z ON

回收率(%)RSD(%)

-Z ON

回收率(%)RSD(%)

生麦芽30094.4 3.996.01.5

6093.0 1.793.75.0

3094.9 2.291.95.6党参30090.8 5.089.36.7

6091.5 4.891.93.8

3074.4 1.489.94.8

焦神曲30095.0 3.498.38.1

6096.5 4.992.54.9

3088.8 4.292.74.8

1.3.5 样品的测定结果 应用本法分别对20个中药材及5个中药制剂进行了检测,结果见表3。其中12个样品含有ZON,污染水平在0.200 g kg-1~288 g kg-1;但均未检测到 -ZOL。空白样品,标准品及含ZON样品(甘草,海南)的M R M色谱图见图2。

表3 样品中ZON和 -ZOL含量测定结果(n=3)

中药名称产地

Z ON的含量

( g k g-1) -Z ON的含量

( g kg-1)

中药名称产地

Z ON的含量

( g kg-1)

-ZON的含量

( g k g-1)

薏苡仁江苏52.4n d白术海南nd nd 薏苡仁海南23.3n d胖大海海南nd nd 薏苡仁江西288.0n d黄芪海南nd nd 薏苡仁北京-165.8n d黄芩北京nd nd 薏苡仁北京-2168.0n d防风北京nd nd 薏苡仁北京-382.9n d生何首乌北京nd nd 薏苡仁北京-448.7n d川芎北京nd nd 薏苡仁北京-5132.0n d大山楂丸北京nd nd 肉苁蓉北京271.0n d加味保和丸北京nd nd 醋延胡索北京1.4n d牛黄解毒丸北京nd nd 炒神曲北京0.2n d人参健脾丸北京nd nd 建曲北京111.0n d黄连上清丸北京nd nd 板蓝根海南nd n d

注:nd:未检测到

图2 (A)空白样品的MRM色谱图;(B)ZON, -Z O L标准品及内标的MRM色谱图;(C)含ZON,不含 -ZOL的样品甘草(海南)的M R M色谱图

2 讨论

为了控制ZON对人和动物产生的危害,世界多国已制定了食品及饲料中ZON的限量标准,如奥地利制定的小麦等食品中ZON的限量标准为60 g kg-1,法国规定的谷物和菜油中的ZON的限量标准为200 g kg-1。欧盟2007年规定各种谷类及食品中ZON的限量标准范围为20 g kg-1~ 400 g kg-1。在我国,最新的粮食卫生标准规定供人食用的原粮和成品粮,包括禾谷类、豆类等ZON的限量标准为60 g kg-1[8]。暂时还未有关于 -ZOL的限量规定,但是很多谷类及动物饲料中都检测到 -ZOL。

本文检测了20个中药材及5个中药制剂中的ZON和 -ZO L,结果12个样品都含有ZON,但未检测到 -ZO L。在这12个样品中,有6个样品超过了常规的限量标准(60 g kg-1)。欧盟规定,ZON的最大摄入量不得超过0.2 g kg-1b.w.day-1,因此,对于一个20kg的小孩,ZON 一天的摄入量不得超过4000ng,根据ZON含量较高的几个中药样品(288.0 g/kg,271.2 g/kg,168.0 g/kg)和日常中药的大约消耗量(~30g),ZON每天的摄入量将会分别有8640ng,8136ng,5040ng,大大超过了欧盟规定,会危害到人体健康,因此,迫切需要建立同时测定中药中ZON和 -ZOL 的检测方法并制定其限量标准。

本文建立的免疫亲和柱净化-高效液相-串联质谱法同时测定中药中ZON和 -ZOL的含量方法,选择性好,灵敏度

(下转第1327页)

3 讨论

本文利用液-液萃取和固相萃取及净化样品预处理技术,建立了用液相色谱/质谱/质谱检测水果及果汁样品中三氯新残留量的新方法。作为一种新的检测方法,其具有省时、省力、以及效率高等优点,检出限、重现性及线性都令人满意,对实际样品的检测表明,可以将该方法应用于水果及果汁样品中三氯新的检测。

运用本方法对广东主要进口水果的三氯新残留情况进行抽样检测和调查(结果见表4)。

表4 水果样品中三氯新的含量

进口水果样品

三氯新(m g/kg)

样品数(个)检出率(%)最大值平均值苹果(某国)1020.00.090.02

橙(某国)1030.00.150.03

柠檬(某国)1020.00.060.01

苹果(某国)1010.00.100.01

葡萄(某国)1010.00.080.01

橙(某国)1010.00.04<0.01龙眼(某国)500.0<0.01<0.01橙(某国)500.0<0.01<0.01 抽查结果显示,进口水果中检出三氯新的机会还是比较大的,占了10%~20%左右。这表明由于三氯新的广泛应用,水果和果汁的加工生产过程中三氯新已有所 入侵 ,由于三氯新与二恶英的 亲密关系 ,其潜在的危害性应该引起政府和民众的足够重视,加之三氯新生产技术控制的不严格性和其广泛使用,对人们健康的威胁是显然存在,相关食品监管检测部门应对三氯新的安全性重新评估,并及时开展检测工作。

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(收稿日期:2011-02-14)

(上接第1324页)

高,且方法的回收率和重现性均能满足定量分析要求,结果准确可靠。本方法可为其他中药中ZON和 -ZOL的分析提供参考和借鉴。

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(收稿日期:2011-03-09)