蛋白提取常见问题分析
蛋白提取常见问题分析
Q：如何进行组织液氮研磨？
A：将组织块在液氮里冻实，敲成大小合适的小块后放在研钵里，倒液氮，边研边加，保持研钵里有液氮，或是保持组织块不融。研碎了就行了。注意做前研钵等器具要预冷，用液氮或是先放负二十冰箱一段时间。
注意事项：1.液氮研磨的研钵，药勺必须预冷。2.开始研磨前，将研钵置于冰袋上，并加入少量的液氮，快速将样品转入其中。3.继续加入液氮，快速捣碎样品，然后快速研磨。4.待液氮挥发完前，继续加入液氮，快速淹没，重复操作，待样品变成非常细小的白色干粉时即可。5.将干粉刮下转入裂解液中，再加裂解液于研钵中，将其中的黏附的样品洗下。整个过程保持样品处于温度低的环境，研磨的速度要快而有力度。这样才能破碎细胞，同时不降解蛋白。
Q：提取蛋白Western内参如何选择？
A：参照下表选择：
适用范围 内参名称 分子量大小 注意事项
胞浆蛋白和总蛋白 beta-actin 43 kDa 不适用于骨骼肌样品，细胞
生长条件的改变和细胞外
基质成分的相互作用可能
会改变肌动蛋白的合成
胞浆蛋白和总蛋白 GAPDH 30-40 kDa 一些生理因素例如缺氧症
和糖尿病会增强 GAPDH 在
特定细胞中的表达
胞浆蛋白和总蛋白 Tubulin 微管蛋白 55 kDa 微管蛋白的表达随着抗菌
和抗有丝分裂抗性药物而
改变
核蛋白 TBP（TATA box binding protein）38 kDa 不适用于除去 DNA 的样本 核蛋白 Lamin A74 kDa
核蛋白 Lamin B核纤层蛋白72 kDa 不适用于除去核膜的样本 核蛋白 Histon H3
膜蛋白 α-Tubulin55 kDa
膜蛋白 Na-K ATPase
植物内参 Rubisco核酮糖二磷酸羧化酶
Lhcb4多抗
当实验样品中只是核蛋白，而不是细胞总蛋白提取液时，可以用组蛋白H（Histone H)，或者核纤层蛋白(nuclear lamina protein)等为核内参抗体。除了这些，其它常见的核蛋白内参还有K70, K80, Lamin A和B，
在一些文献报道中，Erk2、TATA binding protein（TBP）以及c-Jun、c-Fos等都有使用。但是需要注意的问题是核蛋白内参的选择需要考虑实际的试验环境，比如在涉及细胞增殖相关试验中，c-Jun由于自身表达变化就不适合做内参；而在凋亡实验时，TBP、Lamin等也不适合作为内参。反之，组蛋白Histone H2A.X 及Histone H3.1等由于是染色体的组成型表达组分，表达比较稳定，经常被作为最广泛的核内参使用。
Q：膜蛋白不溶于loading buffer，或者煮沸后形成沉淀怎么办？
A：用60度变性1h；如果还是不行，把loading buffer的SDS换成LDS。
Q：多少细胞提的蛋白够做western blot？
A：一般5×106足够。但要看是哪种细胞，有的细胞的体积就很小，而有的细胞则铺得很开。常规做WB一个孔道上样要105个细胞。但也和目的蛋白及提取的方式有关。如果是膜蛋白或是某细胞器内分布的蛋白细胞数得增多。
Q：同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？
A：可以，甚至可以同时测十几种样品。
Q：蛋白提取后可以存放多久？
A：－80℃，一年没有问题。关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌污染
Q：提取蛋白后做WB一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？A：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。
Q：做组织样品蛋白的western的时候，提取蛋白有什么特别注意的吗？
A：必须进行研磨、匀浆处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制剂cocktail）。
Q：蛋白电泳胶浓度如何选择？
A：参照下表选择胶浓度
蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%)
<104 20-30
1×104-4×104 15-20
4×104-1×105 10-15
1×105-5×105 5-10
>5×105 2-5
Q：提取的蛋白选用何种方法定量？
A：提取的样品中若含有去垢剂则需要选用BCA法进行蛋白浓度测定，若样品中含有螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类等，则需要选用Bradford法进行蛋白浓度测定。
Q：用组蛋白H3作为核蛋白的内参,结果没出现条带，目的蛋白有条带？
A：组蛋白与DNA结合紧密,需进行超声剪切DNA,不然得到的信号很弱。
可以试试将常规所取上清留下的沉淀用loading buffer重悬,然后用超声剪切试试,上样对比一下,组蛋白应该在沉淀中。
蛋白提取相关产品：
蛋白提取
BB-3101 BestBio贝博生物总蛋白提取试剂盒
BB-3102 BestBio贝博生物核蛋白提取试剂盒
BB-3103 BestBio贝博生物膜蛋白提取试剂盒
BB-3104 BestBio贝博生物膜/胞浆/核蛋白分步提取试剂盒
BB-31042 BestBio贝博生物细胞膜/胞浆/核膜蛋白分步提取试剂盒
BB-3105 BestBio贝博生物磷酸化蛋白提取试剂盒
BB-31051 BestBio贝博生物植物磷酸化蛋白提取试剂盒
BB-3106 BestBio贝博生物活性蛋白提取试剂盒
BB-3108 BestBio贝博生物磷酸化蛋白富集试剂盒
BB-31081 BestBio贝博生物植物磷酸化蛋白富集试剂盒
BB-3109 BestBio贝博生物糖蛋白富集试剂盒
BB-3111 BestBio贝博生物膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒
BB-3112 BestBio贝博生物核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒
BB-3113 BestBio贝博生物胞浆蛋白提取试剂盒
BB-3114 BestBio贝博生物细胞跨膜蛋白提取试剂盒
BB-3115 BestBio贝博生物细胞核蛋白提取试剂盒
BB-31152 BestBio贝博生物组织核蛋白提取试剂盒
BB-3116 BestBio贝博生物细胞膜蛋白提取试剂盒
BB-31161 BestBio贝博生物细胞质膜蛋白提取试剂盒
BB-3117 BestBio贝博生物组蛋白提取试剂盒
BB-31171 BestBio贝博生物植物组蛋白提取试剂盒
BB-31172 BestBio贝博生物昆虫组蛋白提取试剂盒
BB-31173 BestBio贝博生物酵母组蛋白提取试剂盒
BB-3118 BestBio贝博生物胞浆蛋白/核蛋白/组蛋白提取试剂盒
BB-3121 BestBio贝博生物细胞蛋白提取试剂盒
BB-31211 BestBio贝博生物冻存细胞蛋白提取试剂盒
BB-3122 BestBio贝博生物组织蛋白提取试剂盒
BB-31226 BestBio贝博生物脂肪组织蛋白提取试剂盒
BB-31227 BestBio贝博生物脑组织蛋白提取试剂盒
BB-3123 BestBio贝博生物细菌蛋白提取试剂盒
BB-3124 BestBio贝博生物植物蛋白提取试剂盒
BB-31241 BestBio贝博生物植物根茎蛋白提取试剂盒
BB-3125 BestBio贝博生物酵母蛋白提取试剂盒
BB-3126 BestBio贝博生物昆虫蛋白提取试剂盒
BB-31262 BestBio贝博生物昆虫胞浆蛋白提取试剂盒
BB-3127 BestBio贝博生物真菌蛋白提取试剂盒
BB-31272 BestBio贝博生物真菌蛋白提取试剂盒
BB-3128 BestBio贝博生物大肠杆菌蛋白提取试剂盒
BB-3129 BestBio贝博生物革兰氏阳性菌蛋白提取试剂盒
BB-3130 BestBio贝博生物革兰氏阴性菌蛋白提取试剂盒
BB-3131 BestBio贝博生物藻类蛋白提取试剂盒
BB-3132 BestBio贝博生物土壤蛋白提取试剂盒
BB-3133 BestBio贝博生物液体样本蛋白提取试剂盒
BB-31332 BestBio贝博生物乳清蛋白提取试剂盒
BB-3134 BestBio贝博生物白细胞蛋白提取试剂盒
BB-3135 BestBio贝博生物血液单核细胞蛋白提取试剂盒
BB-3136 BestBio贝博生物丝状真菌蛋白提取试剂盒
BB-3137 BestBio贝博生物血浆蛋白提取试剂盒
BB-3138 BestBio贝博生物血清蛋白提取试剂盒
BB-3139 BestBio贝博生物血细胞蛋白提取试剂盒
BB-3140 BestBio贝博生物全血蛋白提取试剂盒
BB-31401 BestBio贝博生物血小板蛋白提取试剂盒
BB-31452 BestBio贝博生物溶酶体蛋白提取试剂盒
BB-31453 BestBio贝博生物高尔基体蛋白提取试剂盒
BB-31454 BestBio贝博生物内质网蛋白提取试剂盒
BB-3141 BestBio贝博生物厚壁微生物蛋白提取试剂盒
BB-3151 BestBio贝博生物细菌膜蛋白提取试剂盒
BB-31511 BestBio贝博生物细菌跨膜蛋白提取试剂盒
BB-31512 BestBio贝博生物细菌外膜蛋白提取试剂盒
BB-31515 BestBio贝博生物支原体膜蛋白提取试剂盒
BB-3152 BestBio贝博生物植物膜蛋白提取试剂盒
BB-31521 BestBio贝博生物植物跨膜蛋白提取试剂盒
BB-3153 BestBio贝博生物昆虫膜蛋白提取试剂盒
BB-31531 BestBio贝博生物昆虫跨膜蛋白提取试剂盒
BB-3154 BestBio贝博生物植物核蛋白提取试剂盒
BB-3155 BestBio贝博生物植物质膜蛋白提取试剂盒
BB-3156 BestBio贝博生物真菌膜蛋白提取试剂盒
BB-3157 BestBio贝博生物酵母膜蛋白提取试剂盒
BB-31572 BestBio贝博生物酵母膜蛋白/细胞质蛋白提取试剂盒BB-3158 BestBio贝博生物线粒体膜蛋白提取试剂盒
BB-3159 BestBio贝博生物真菌核蛋白提取试剂盒
BB-3160 BestBio贝博生物大肠杆菌膜蛋白提取试剂盒
BB-3161 BestBio贝博生物骨组织蛋白提取试剂盒
BB-3162 BestBio贝博生物高脂肪样本蛋白提取试剂盒
BB-3163 BestBio贝博生物神经元蛋白提取试剂盒
BB-3164 BestBio贝博生物石蜡包埋组织蛋白提取试剂盒
BB-3165 BestBio贝博生物甲醛固定组织蛋白提取试剂盒
BB-31651 BestBio贝博生物固定细胞蛋白提取试剂盒
BB-3166 BestBio贝博生物冻存样本核蛋白提取试剂盒
BB-3167 BestBio贝博生物植物核蛋白/细胞器蛋白提取试剂盒
BB-3168 BestBio贝博生物酵母核蛋白提取试剂盒
BB-31681 BestBio贝博生物酵母核蛋白/胞质蛋白提取试剂盒
BB-3169 BestBio贝博生物植物核蛋白/胞质蛋白提取试剂盒
BB-3170 BestBio贝博生物藻类膜蛋白提取试剂盒
BB-3171 BestBio贝博生物线粒体蛋白提取试剂盒
BB-31711 BestBio贝博生物组织线粒体蛋白提取试剂盒
BB-3172 BestBio贝博生物植物线粒体蛋白提取试剂盒
BB-31721 BestBio贝博生物丝状真菌线粒体蛋白提取试剂盒
BB-3173 BestBio贝博生物植物线粒体膜蛋白提取试剂盒
BB-3174 BestBio贝博生物细胞核膜蛋白提取试剂盒
BB-3175 BestBio贝博生物植物叶绿体膜蛋白提取试剂盒
BB-3176 BestBio贝博生物线粒体/胞浆蛋白提取试剂盒
BB-3177 BestBio贝博生物组织线粒体/胞浆蛋白提取试剂盒
BB-3178 BestBio贝博生物线粒体膜/胞浆蛋白提取试剂盒
BB-3179 BestBio贝博生物叶绿体蛋白提取试剂盒
BB-31791 BestBio贝博生物植物膜蛋白/叶绿体蛋白提取试剂盒BB-3180 BestBio贝博生物植物胞质蛋白提取试剂盒
BB-3181 BestBio贝博生物总蛋白提取试剂盒（2D电泳用）
BB-31812 BestBio贝博生物胞浆蛋白提取试剂盒（2D电泳用）BB-31813 BestBio贝博生物植物总蛋白提取试剂盒（2D电泳用）BB-3182 BestBio贝博生物细菌总蛋白提取试剂盒（2D电泳用）BB-3183 BestBio贝博生物植物总蛋白提取试剂盒（2D电泳用）BB-31836 BestBio贝博生物叶绿体蛋白提取试剂盒（2D电泳用）BB-3184 BestBio贝博生物植物质膜蛋白提取试剂盒（2D电泳用）BB-31841 BestBio贝博生物植物膜蛋白提取试剂盒（2D电泳用）BB-3185 BestBio贝博生物酵母蛋白提取试剂盒（2D电泳用）
BB-3186 BestBio贝博生物藻类蛋白提取试剂盒（2D电泳用）
BB-3187 BestBio贝博生物细菌膜蛋白提取试剂盒（2D电泳用）BB-3188 BestBio贝博生物膜蛋白提取试剂盒（2D电泳用）
BB-3189 BestBio贝博生物真菌蛋白提取试剂盒（2D电泳用）
BB-3190 BestBio贝博生物真菌膜蛋白提取试剂盒（2D电泳用）BB-3191 BestBio贝博生物线粒体蛋白提取试剂盒（2D电泳用）BB-3192 BestBio贝博生物酵母膜蛋白提取试剂盒（2D电泳用）BB-3193 BestBio贝博生物昆虫总蛋白提取试剂盒（2D电泳用）BB-3194 BestBio贝博生物丝状真菌蛋白提取试剂盒（2D电泳用）BB-31951 BestBio贝博生物血浆蛋白提取试剂盒（2D电泳用）BB-31961 BestBio贝博生物细胞蛋白快速提取试剂盒（离心柱法）
BB-31962 BestBio贝博生物组织蛋白快速提取试剂盒（离心柱法）
BB-31963 BestBio贝博生物植物蛋白快速提取试剂盒（离心柱法）
BB-31964 BestBio贝博生物细菌蛋白快速提取试剂盒（离心柱法）
BB-31965 BestBio贝博生物昆虫蛋白快速提取试剂盒（离心柱法）
BB-31966 BestBio贝博生物酵母蛋白快速提取试剂盒（离心柱法）
BB-31967 BestBio贝博生物血液蛋白快速提取试剂盒（离心柱法）
BB-31968 BestBio贝博生物真菌蛋白快速提取试剂盒（离心柱法）
BB-31981 BestBio贝博生物细胞蛋白快速提取试剂盒（离心柱法，2D电泳用）BB-31982 BestBio贝博生物组织蛋白快速提取试剂盒（离心柱法，2D电泳用）BB-31983 BestBio贝博生物植物蛋白快速提取试剂盒（离心柱法，2D电泳用）BB-31984 BestBio贝博生物细菌蛋白快速提取试剂盒（离心柱法，2D电泳用）BB-31985 BestBio贝博生物昆虫蛋白快速提取试剂盒（离心柱法，2D电泳用）BB-31986 BestBio贝博生物酵母蛋白快速提取试剂盒（离心柱法，2D电泳用）BB-31987 BestBio贝博生物血液蛋白快速提取试剂盒（离心柱法，2D电泳用）BB-31988 BestBio贝博生物真菌蛋白快速提取试剂盒（离心柱法，2D电泳用）
电泳常见问题及解决方法
3. 1 滑橇底部油泥污染导致电泳缩孔及其解决办法在车身经手工预清理完后，进行洪流冲洗前，需要将车身承载在滑橇上并锁紧，再装挂在自行葫芦系统的吊架上，然后依次通过电泳涂装各工艺槽。当滑橇第一次通过电泳槽时，滑橇表面会泳涂上一层电泳漆膜，形成绝缘层。而当滑橇承载车身再一次通过电泳槽时，滑橇表面因有绝缘层的存在而不会泳涂上新的电泳漆膜，但会一次次附上一层新的电泳浮漆。由于电泳后的水洗工艺主要是针对车身，而位于车身底部的滑橇不可能被冲洗干净。因此，当附有电泳浮漆的滑橇在电泳后工位(如电泳烤房、电泳烤后存放)的输送链上前行时，滑橇底部的电泳浮漆和已泳涂上的电泳漆膜与输送链上的滚子不断接触、摩擦，就会粘附滚子上的润滑油，形成油泥。由于这些油泥位于滑橇底部，并且有很强的粘附性，即使在通过脱脂和水洗等工艺槽时，也不能完全被清除干净，从而污染磷化槽液、电泳槽液及电泳烤房。油泥污染引起的直接后果就是造成电泳漆膜缩孔。经观察发现，在每次对电泳滑橇通过的输送链加油润滑后，电泳漆膜缩孔明显增加。电泳漆膜缩孔不仅加大了电泳底漆打磨的工作量，也明显影响整车涂膜的质量和抗腐蚀性能。 人工擦除滑橇底部油泥，以避免电泳漆膜缩孔是一种解决办法，但费时费力；在预脱脂槽里增加喷嘴，利用高压脱脂液对滑橇底部油泥进行冲洗也是一种办法，但这样做需要对预脱脂槽进行较大的改造，并且还会加快预脱脂槽液的更新周期，从而造成成本上升；第3 种办法是在车身吊装进槽前的滚床间安装油泥清洗机。清洗机带有一对呈滚轮状的毛刷，通过电机减速驱动毛刷对滑橇底部油泥进行刷洗。该方法简便可行。为加强对油泥的清洗效果，利用该方法并采用3 套清洗机，通过其6 个呈滚轮状、用以粘附滚轮下面清洗液的毛刷对在清洗机上面通过的滑橇底部的油泥进行连续滚刷。清洗机安装调试完毕，经过2 周的试运行后发现，清洗机工作稳定可靠，清洗效果明显提高。 滑橇底部油泥在经过3 次连续的滚刷后基本被清除，再经过后续的洪流冲洗、脱脂、水洗等流程，油泥被清除得更为彻底，不再对磷化槽液、电泳槽液形成污染，从而避免了因油泥而造成的车身电泳漆膜缩孔的问题。虽然，滑橇通过电泳槽时，滑橇表面仍然会粘附新的电泳浮漆，而且滑橇底部的电泳浮漆在接触电泳烤房输送链上的润滑油后，也会形成油泥，但由于烤房输送链使用的是高温润滑油，不易挥发，故在烤房里形成的油泥，不会导致车身电泳漆膜缩孔。这样车身电泳漆膜缩孔问题便得到有效的控制。 3. 2 车身顶篷吸顶及其消除 在车身所有的部位中，车身顶篷的强度和刚性都是最弱的。笔者所在公司生产的车型为轻型越野车，尽管在顶篷内设计了加强筋，但比起车身其它部位，其强度和刚性还是稍差。于是，在电泳涂装过程中，当车身从浸入的各工艺槽中上升出槽时，受槽液压力影响，会在顶篷处造成局部凹陷，这就是通常所说的吸顶。轻微的吸顶经修复后，对车身质量不会造成太大的影响；如果吸顶严重，则会造成顶篷报废。在所生产的两款车型中，有一款是PAJERO 系列车型(CK 车)，车身外形长4 650 mm、宽1 780 mm、高1 450 mm，其顶篷长、宽尺寸也分别为2 400 mm 和1 200 mm。由于车身顶篷面积大，导致CK 车车身在电泳涂装线上试生产时，每台车都发生吸顶现象，而未开天窗的车身发生吸顶的情况尤为严重。因此，吸顶现象成为该车型生产亟待解决的问题。 起初，解决的措施是加大车身后仰出槽的倾斜角度，同时在不影响生产节拍的情况下，适当降低车身上升出槽时的速度，以减轻槽液对车顶的压力。采取上述措施后，取得了初步的成效，即：开有天窗的CK车在通过前处理电泳生产线的各工艺槽后，只有很少比例的车发生轻微的吸顶，而且稍加修复即可消除，对车身质量不会造成影响；但未开天窗的CK 车在通过前处理电泳生产线的各工艺槽后，仍然发生一定程度的吸顶。 研究发现，未开天窗的CK 车车身顶篷面积大，强度和刚性差，因此容易发生吸顶。此时，若继续加大车
党政机关公文处理常见问题及对策
近年来，各级党政机关及其文书处理部门认真贯彻国务院发布地《国家行政机关公文处理办法》(以下简称《办法》)和中共中央办公厅发布地《中国共产党机关公文处理条例)(以下简称《条例》)，以及国家质技术监督局发布地《国家行政机关公文格式)(以下简称《格式))等三个公文处理规范性文件，使机关文书处理工作日益规范化，维护了公文地严肃性和权威性，发挥了机关公文地应有效用. 但一些基层党政机关地公文处理工作仍然存在一些不规范地现象，值得引起重视并加以克服改进.笔者就日常公文处理工作中所见以及容易被大家忽略地一些问题进行粗略归纳和分析，期待与同行们一起探讨.资料个人收集整理，勿做商业用途 一、公文处理中常见地问题 (一)文种使用不规范 .滥发通知.(办法》第十五条规定:“政府各部门依据部门职权可以相互行文和向下一级政府相关业务部门行文;除以函地形式商洽工作、询问和答复问题、审批事项外，一般不得向下一级政府正式行文”.如需行文，应报请本级政府批转或由本级政府办公厅(室)转发;因特殊情况确需向下一级政府正式行文地，应当报本级政府批准，并在文中注明经政府同意.但资料个人收集整理，勿做商业用途事实上一些县级政府工作部门(包括一些议事协调机构，如领导小组、指挥部、委员会等)，却常常将其所主管地业务性工作以“通知”形式直接向乡镇一级政府行文交办，而没有正确使用“函”这一文种，明显违反了《办法)第十五条地规定.资料个人收集整理，勿做商业用途 .滥用请示.《办法》和《条例》都规定“请示适用于向上级机关请求指示、批准”“函适用于不相隶属机关之间商洽工作、询问和答复题，请求批准和答复审批事项”.根据上述定义，在请求批准时，有隶属关系，下级向上级请求批准地用“请示”;没有隶属关系，不论单位级别高低，向有关部门请求批准，一律用“函”.但在日常行文中，却常常出现乡镇一级政府向省、市、县级相关业务部门请求审批事项时，错误地用“请示”行文，而没有正确使用“申请色”或“请准函”这一文种.相应地，有关业务主管部门在答复审批事项时，也没有正确使用“问复函”答复，而错用“批复”文种.资料个人收集整理，勿做商业用途 （二)随意升格发文 公文随意升格地现象主要发生在乡镇一级机关，经常或被迫或不经意地发生以下两类情况: .有些成立或调整领导机构地“通知”类文件，本应由乡镇地党政办公室行文即可，但却常常错误地升格为以镇党委或镇政府地文件进行行文..资料个人收集整理，勿做商业用途 有些关于某一方面工作地一般性计划、方案、要点类文书，本应以相应工作部门或站所名义拟制，或者由党政办公室转发(印发)即可，但却常要以党委、政府重视为由，升格为镇党委或镇政府文件进行发文.资料个人收集整理，勿做商业用途 以上两类随意升格公文地现象，让党委、政府地公文沦为一般性事务通知地工具，有失党委、政府公文地严肃性和庄重性.资料个人收集整理，勿做商业用途 (三)文面格式不规范 较为常见地文面格式不规范地情况主要有如下种: .发文字号标注不规范.公文发文字号地正确标注方法是“机关代字〔位数年份〕实位序号”.但有地公文出现以位数标注年份、年份错用圆括号、序号出现虚位、序号前出现“第”字等不规范现象.资料个人收集整理，勿做商业用途 .公文标题不规范.有地公文标题出现逗号、顿号、书名号等不规范现象，违反了“公文标题中除法规、规章名称加书名号外，一般不用标点符号”地规定.资料个人收集整理，勿做商业用途 .主送、抄送机关称谓不规范.主要是因县乡两级机构改革后，其组成部门、内设机构、直属机构地名称职能已做相应变更，但一些上级业务主管部门在向下行文时，没有按改革后地规范名称行文，
原核蛋白表达常见问题解析
原核蛋白表达常见问题解析 1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现？ 在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为 包涵体。经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的 培养基等方法获得更多的可溶蛋白。 2、跨膜蛋白为什么很难表达？ 跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个实验结果，究其原理，目前 众说纷纭很多种理论。以我们浅薄的理解层面来看，主要有以下几个 原因： 跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式 的连接，形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构，这种结构与 信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞 一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌 这一复杂过程，有些蛋白是多次跨膜，对于原核细胞来说几乎是不可 能完成的任务。 另外，对于疏水性的片段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏水 性多肽会抑制翻译过程，甚至与原核膜结构融合形成毒性，出于生物 自我保护的本能，所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。 3、如何选择蛋白表达宿主菌？
4、我们有哪些原核蛋白纯化方式？如何选择不同的纯化方式？ 答：我们公司的蛋白纯化方法大致分为亲和纯化、离子交换、切胶 回收三类。 1、常规情况下，一般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进行亲和纯化 获得融合蛋白，用亲和纯化的方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白， 亲和纯化的方便快捷。 2、如果需要目的蛋白不含有任何标签，怎么选择纯化方式？。 （1）可表达融合蛋白，用蛋白工具酶切割融合蛋白，再进行纯化除去 工具酶。此方法能快速得到蛋白。 （2）可表达不含标签的蛋白，进行离子、分子筛、疏水等纯化，通过AKATA纯化设备获得蛋白。 3、如果需要获得蛋白作为抗原，可以直接通过切胶回收的方式，此方 法获得蛋白纯度较高，进行免疫动物后得到的抗体进行WB反应，灵敏 度较高。 5、表达得到的蛋白是有活性的么？ 答：需要让蛋白有活性的条件很复杂，合适的缓冲液体系、盐浓度、蛋白的折叠状态甚至检测活性的方法的细微差别都可能导致活性 的强弱有无，一般情况下，上清表达的蛋白要比包涵体经过变复性纯 化后得到的蛋白活性要好，我们尽量从上清中获得蛋白，期许蛋白形 成的折叠最接近活性状态，这也是我们擅长的。但是在实际实验条件下，我们无法承诺表达纯化的蛋白一定具有客户期望的生理活性。
电泳涂装常见问题汇总
电泳涂装常见问题及解决方法一现象可能产生的原因对策 膜厚不足固体份低提高固体份 溶剂量少补加溶剂 电压低提高电压 温度低提高温度 水迹纯水不干净换纯水 温度过高降低湿度 固体份过低加漆 溶剂含量高适量超滤降低溶剂量起泡工作表所不洁净充分水洗 漆膜外观不丰满颜基比过高减少颜料补加，增加树脂含量 溶剂量少补加溶剂 槽液有泡沫进气漏气检查管道和泵是否泄漏 溢流槽液体过低提出高液体高度 固体份过高，槽液粘度太大降低固体份 涂膜粗糙颜料份高减少色浆，增加树脂 电导率高超滤，降低电导率针孔槽液温度低升高槽液温度 电导率过高超滤降低电导率 漆膜不均匀，破裂槽液温度高降低温度 电压高降低电压 电导率高超滤降低电导率 斑纹地图斑痕基材表面污染检查金属表面 漆迹清洗不够增加清洗 凹孔，缩孔杂质污染清除工件上杂质 颜料份低补加色浆 硬度烘烤时间延长烘烤时间 烘烤温度低升高温度 不够流平加溶剂 麻点液温低升温 溶剂少加溶剂 浓度低加漆 条纹表面外观不佳电压升高快 溶剂含量低槽液固含量低
电泳漆膜常见故障及其纠正方法 故障产生原因纠正方法 桔皮或表面粗糙电压过高降低电压 溶液温度高降低温度 固体分过高加水稀释槽液 极距太近加大极距 烘烤加温太快压缩空气吹干后再烘烤 PH 值过高用醋酸或乳酸调整 针孔或麻点固体分过低调整至工艺范围 PH 值过低降低溶液酸度 清洗水不干净换清洗水 溶液电导率太高超滤去掉杂质离子 膜厚太薄增加电泳电压或时间 电镀表面针孔压缩空气吹干后再烘烤 火山口或油点工件上附有油加强除油工序 槽液面有油渍防止槽液被油污染 颗粒污染加强循环过滤和超滤 电压高膜层厚降低电泳电压和时间彩虹膜层太薄增加电泳电压提高膜厚颜色不符膜层太厚或太薄选择合适的工作电压和时间 调配涂料时，颜色比例错严格按工艺配方配制电泳漆 溶剂太多，渗透能力差，膜层厚薄不 均 调整溶剂含量，使其符合工艺规范不规则图形前处理不彻底加强前处理工序 硬度不够烤烘时间短或温度低严格按工艺规范进行 涂装面点状或片状颜色差 异零件有针孔或砂眼杜绝不合格工件下槽色料乳化搅拌不匀加强电泳漆搅拌 表面有水液用压缩空气吹干 水滴未干即烘烤用压缩空气吹干 电泳前水洗不彻底加强入槽产零件的清洗 工件漆膜局部堆积PH太高用冰醋酸或乳酸调整然后超滤工件表面带碱性增加中和槽处理 工件油污未除尽加强除油工艺 漆膜附着力差工件表面带碱性增加中和槽处理 工件油污未除尽加强除油工艺 烘烤温度不够或时间太短提高烘烤温度，增加烘烤时间
质粒提取有关问题及注意点
质粒提取常见问题解析 涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？ 参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。 原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常? 参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。解决办法： 1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。 2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。 3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！ 【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常： 1、利用你的嗅觉。只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。 2、肉眼观察活化菌株。对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。】 未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ 参考见解： 1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。 2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。 3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。 4、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。 5、溶液使用不当：溶液2和3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。 6、吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。 7、质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。 8、乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。 9、洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。 10、洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。
公文写作常见问题分析
一、标题常见问题分析 公文标题是公文内容的摄要，在发挥公文效能上起着举足轻重的作用。但受诸多因素的影响，公文标题时常出现一些毛病，现归纳为以下八个方面，并作粗浅分析。 （一）要素不全 完整的、规范的公文标题，一般应具备“三要素”，即发文机关名称、事由、文种，以标明由谁发文、为什么发文和用什文种发文。2012年7月1日起施行的《党政机关公文处理工作条例》作出明确规定：“公文标题应当准确简要地概括公文的主要内容（事由）并标明公文种类（文种），一般应当标明发文机关”。当然，特殊情况下，也可省略标题中的一至二个要素，但不可随意省略，要相对规范，否则，将毛病百出。 常见的病例有三种： 一是随意省略事由。如《××县人民政府决定》，由于省略事由，受文者看不出标题所反映的主要内容、事项和基本观点，不利于学习、贯彻、领会、落实文件精神。除一些非重要的、极其简短的通知、通告和特殊机关发出的特定公文外（如中华人民共和国国务院、司法部门发出的国务院“公告”、“主席令”、“布告”等），一般情况下不得省略事由。 二是随意省略发文机关。如：一份没有版头的文件标题《关于加强农村党支部建设的报告》，待上级看完文件后，才从落款处知道文件是哪个机关发出的，既不庄重，也不严肃，更不利于公文运转和办理。具有重大决策和事项的下行文不得省略发文机关；没有版头的下行文、上行文均不得省略发文机关，但有版头（发文机关标识）的，也可不标明发文机关。 三是随意省略文种。使受文者不得要领，失去公文的严肃性。如《××乡人民政府关于召开春耕生产会议的有关事宜》。 （二）乱用文种 主要表现在三个方面：
一是混用文种。如《全国人大常委会党组关于县乡换届选举问题的请示报告》，这里把“请示”、“报告”两个不同的文种混淆在一起使用，不论是已经废止的《国家行政机关公文处理办法》，还是自2012年7月1日起施行的《党政机关公文处理工作条例》，都没有“请示报告”这一文种，明显不妥。从该“请示报告”的内容看，应使用批转式“报告”这一文种。 二是错用文种。有的该用“请示”的，却用了“报告”，而该用“报告”的反而用的是“请示”；有的该用“函”的却用“通知”；有的把没列为文种的公文种类作为文种使用，如“条例”、“规定”、“办法”、“总结”、“计划”等，以上这些，都不可作为文种使用，不可直接行文。《党政机关公文处理工作条例》所确定的公文文种共有15种，决议、决定、命令（令）、公报、公告、通告、意见、通知、通报、报告、请示、批复、议案、函、纪要。除此之外，均不可直接行文，但可作为“印发”、“颁发”或“通知”的“附件”行文。 三是生造文种。如《关于调整工资的补充说明》、《关于机构改革中有关问题的解释》等，这里的“补充说明”、“解释”均不应作为文种使用，以上两个标题可修定为《××（发文机关）关于印发调整工资补充说明的通知》、《××（发文机关）关于印发机构改革中有关问题解释的通知》。还有的把“安排”、“要点”、“细则”这些既不是公文文种又不是应用文体种类的东西常常作为公文文种直接行文，是错误的。 （三）隶属不清 不该用“批转”的，用了“批转”；该用“批转”的却用了“印发”、“转发”，分不清三者之间的隶属关系和词性。如《××县政府办公室关于批转××市长在××会议上讲话的通知》，这里的“批转”使用不当，应该使用“印发”或“转发”。因为“批转”具有“批准转发”之意，是上级对下级报告的认同并转发下去贯彻落实的。下级对上级机关的文件和上级领导同志的讲话、批示等不可使用“批转”，否则将混淆了上下级的隶属关系。 （四）提炼不精。主要表现在标题冗长上。如《×××（发文机关）关于招收退休退职职工子女就业，进行合理安
电泳常见问题及解决方法
阴极电泳常见问题及解决方法 一、颗粒 （1）现象 在烘干后的电泳涂膜表面上有手感粗糙的、较硬的粒子，或肉眼可见的细小痱子，往往被涂物的水平面较垂直面严重，这种漆膜病态称为颗粒。 （2）产生原因 ①CED槽液PH值偏高，碱性物质混入，造成槽液不稳定，树脂析出或凝聚。 ②槽内有沉淀“死角”和裸露金属处。 ③电泳后清洗液脏、含漆量过高，过滤不良。 ④进入的被涂物面及吊具不洁，磷化后水洗不良。 ⑤在烘干过程中落上颗粒状污物。 ⑥涂装环境脏。 ⑦补给涂料或树脂溶解不良，有颗粒。 （3）防治方法 ①将CED槽液的PH值控制在下限，严禁带入碱性物质，加强过滤，加速槽液的更新。 ②消除易沉淀的“死角”和产生沉积涂膜的裸露金属件。 ③加强过滤，推荐采用精度为25μm的过滤元件，养活泡沫。 ④确保被涂面清洁，不应有磷化沉渣，防止二次污染。 ⑤清理烘干室和空气过滤器。 ⑥保持涂装环境清洁，检查并消除空气的尘埃源。 ⑦确保新补涂料溶解良好，色浆细度在标准范围内。 二、缩孔（陷穴） （1）现象 在湿的电泳涂膜上看不见，当烘干后漆膜表面出现火山口状的凹坑，直径通常为0.5~3.0mm,不露底的称为陷穴、凹洼、露底的称为缩孔，中间有颗粒的称为“鱼眼”。产生这一弊病的主要原因是电泳湿涂膜中或表面有尘埃，油污与电泳涂料不相溶的粒子，成为陷穴中心，使烘干初期的湿漆膜流展能力不均衡，而产生涂膜缺陷。 （2）产生原因 ①被涂物前处理脱脂不良或清洗后又落上油污、尘埃。 ②槽液中混入油污，漂浮在液面或乳化在槽液中。 ③电泳后冲洗液混入油污。 ④烘干室内不净，循环风内含油分。 ⑤槽液的颜基比失调，颜料含量低的易产生缩孔。 ⑥涂装环境脏、空气可能含有油雾、漆雾，含有机硅物质等污染被涂物或湿涂膜。 ⑦补给涂料有缩孔或其中树脂溶解不良，中和不好。 （3）防治方法 ①加强被涂物的脱脂工序，确保磷化膜不被二次污染。
关于质粒抽提的杂菌污染问题解决方案
关于质粒抽提的杂菌污染问题解决方案过 对于从事分子生物学的研究的人来说，质粒抽提几乎是每天都用做的常规技术。我们经常会收到来自用户的各种求助，像质粒提取失败了、不是自已想要的那个质粒及提取得率低等等。 其实提取质粒并不难，基本上按照质粒提取试剂盒的说明书，小心操作，一般不会有问题。但是为什么还会有这些问题存在？因为在实验中我们应该注意一些我们经常忽略的细节。可能实验室的环境的污染，操作时的不注意都会造成我们培养细菌时染杂菌，使得在质粒的提取过程中现象出现异常，导致实验不成功。说到这里，有些人可能会问：那我们染的杂菌是什么菌呢？其实大部分为真菌，也有可能是革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌等。 为了让大家能能判断出所用的菌体是否染杂菌，继而能从实验现象可以判断出该原因，我们特意在本实验室里做了一个从染杂菌的细菌中提取质粒的对照模拟实验。 实验方案 编号具体方案 号高拷贝质粒的大肠杆菌1 2号号染杂菌的大肠杆菌3 4号全为杂菌（酵母菌）号 5．6号 实验步骤 根据simgen快速质粒DNA小量试剂盒的说明书的操作步骤进行实验。 实验结果 （一）Buffer II裂解不完全
后溶液变粘稠的澄清液体；而部分BufferII2号为正常的大肠杆菌加入如上图所示1、号加入之后溶液呈不粘稠的浑浊、64号变为粘稠的浑浊液体；全为杂菌的5染菌的细菌3、液体。时，其中的碱性溶液能使革兰氏阴性菌的细胞壁破裂以及蛋白质变Buffer II 在加入号正常的革兰氏阴性细2等细胞内容物。对于1、性，从而释放出质粒DNA、基因组DNA等细胞内容物从而溶液变为粘稠的DNAII溶液能将其细胞壁破裂，释放出质粒菌，Buffer 溶液能号，我们可以看到它出现了粘稠的浑浊液体，这是因为Buffer II澄清液体，而3、4的细胞壁却不能破裂，真菌）溶解正常的革兰氏阴性细菌的细胞但部分杂菌（革兰氏阳性菌、5、6号都为杂菌，不能被破裂的杂菌呈现浑浊状。它们的细胞壁较厚，Buffer II溶液只能裂解很小部分的细胞壁使其穿孔而泄露部分核酸（主要是RNA），细胞内的基因组DNA等其他细胞内容物难以释放，所以它呈现了不粘稠的浑浊状。 （二）拷贝数降低或质粒丢 失． 图2
公文常见错误分析及对策
公文常见错误分析及对策 公文写作 公文常见错误分析及对策 公文是公务文书的简称，是处理公务、管理事务的一种书面文字工具。其重要特点就是行文的规范化、制度化和标准化。对于公文格式，国家技术监督局制定了《国家行政机关公文格式》（GB/T9704—1999，以下简称《格式》），国务院办公厅制定了《国家行政机关公文处理办法》（2001年1月1日起施行，以下简称《办法》），中央办公厅制定了《中国共产党各级领导机关文件处理条例（试行）》（以下简称《条例》）。但是不少单位和部门制发文件，并没有严格按照规定、要求去做，而是各行其是，制发文件存在很大的随意性，造成公文格式的不规范，严重影响了公文的严肃性、公正性。更在一定程度上影响了公文的质量和效能，影响了政 府的行政效率，因此必须引起高度重视。 一、存在的问题 （一）文种使用乱。一是生造文种。把没列为文种的公文种类作为文种使用。《办法》所确定的公文文种共有13类14种，即：命名、令，决定，公告，通告，通知，通报，议案，报告，请示，批复，意见，函，会议纪要。除此之外，均不可直接行文，但可作为"印发"、"颁发"式"通知"的"附件"行文。例如，《关于××市区退休人员一次性缴纳医疗费分期缴费的具体操作规定》、《关于使用社会保障卡有关问题的说明》等，这里的"操作规定"、"说明"均不应作为文种使用，可以改成《××关于印发市区退休人员一次性缴纳医疗费分期缴费的具体操作规定的通知》、《××关于印发使用社会保障卡有关问题的说明的通知》，不能作为文种使用的还有"条例"、"规定"、"办法"、"总结"、"计划"等，有的甚至把"安排"、"要点"、"细则"这些既不是公文文种又不是应用文体种类的东西常常作为公文文种直接行文，都是错误的。
质粒提取注意事项
1. 质粒制备的基本原理是什么？ 答：做过分子生物学实验的,大多数做抽提过质粒，但不是所有人都知道质粒制备的基本原理。所以有必要做一个说明，能帮助您了解和解决实验过程中遇到的一些问题。制备质粒最常用的方式是碱裂解法。质粒被转化到细菌中，单菌落接种到含有特定抗生素的培养基中，一般培养到细菌生长的平台期离心收集细胞；细菌用悬浮液（Solution I, 内含RNase A）悬浮细胞，用SDS-NaOH (Solution II)裂解。SDS是很强的去污剂，抽提出细胞膜蛋白质和磷脂，释放出细胞内物质，NaOH为强碱，使蛋白质，染色体DNA和质粒DNA变性；细胞裂解彻底后，加入酸性醋酸钾（Solution III）, 中和裂解液，同时SDS-K,变性蛋白质，变性基因组DNA和细胞碎片形成沉淀，通过离心，但是质粒DNA正确复性，仍留在上清溶液中。如何从上清液中回收DNA的方法有很多，有用苯酚/氯仿抽提的，有用乙醇沉淀的，有用核酸吸附吸附的，目的都是试图采用有效，快速的方式纯化质粒DNA。我们提供的试剂盒就是选用特异的核酸吸附材料，优化结合与洗脱条件得到高纯度质粒DNA，纯化的质粒DNA纯度和得率可以满足分子生物学实验的要求。 2. 质粒DNA 制备的关键是什么？ 答：碱裂解法的关键是如何把握SDS-NaOH处理的时间。质粒制备过程中，如果质粒长时间暴露于NaOH, 质粒有可能不可逆变性，使得抽提质粒中有部分是变性质粒。这些变性质粒，不能酶切。所有一般情况下，SDS-KOH处理时间不能超过5分钟，最好在冰里处理，观察到液体变得清就可以加入中和液。 3. 质粒中基因组污染是怎么产生的？ 答：基因组的产生一般是因变性和中和步骤处理不当所致。如果为了提高混合效果，混匀的动作过于剧烈，基因组DNA可能被剪切成小片段，这些小片段在后来中和过程中被复性，保留在溶液中，与质粒一起回收出来了。要降低基因组的污染，记注两点：混合动作要温和，细胞用量要合适。 4. 如何确定质粒小抽细胞的用量？ 答：根据实验目的确定质粒的需求量。对于一般的克隆酶切鉴定，亚克隆、测序分析等常规分析，有几微克的DNA就够了。质粒拷贝数的高低确定接种体积的大小。高拷贝的质粒，接过2-3ml 的细胞就够了，对于中低拷贝的如pBR322,接种5ml也能满足要求。使用过过的细胞，由于细胞裂解难以彻底，时间难以把握，DNA的纯度和得率有时因吸附材料容量的限制，得率并没有显著提高，纯度反而下降。对于细胞数很大的质粒制备，需要按比例提高各溶液的用量，才能保证抽提质粒的纯度和得率。 5. 电泳分析抽提的质粒会看到什么？ 答：如果您制备的质粒很脏，从电泳加样孔起，您会看依次看到微量的基因组DNA, 开环环装质粒（open circular plasmid），超螺旋质粒(Super Coiled), 变性的超螺旋质粒（denatured supercoiled plasmid）, 细菌RNA。判定质粒制备质量高低的标准是观察超螺旋质粒在整个抽提DNA中的百分比。质量高的主要部分为超螺旋质粒，没有变性超螺旋质粒和没有基因
蛋白Western blot电泳——试验中常见问题及解答
蛋白质电泳与western blot1 Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术。 （1）原理 （2）分类 ①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色 （3）主要试剂 （4）主要程序 （5）实验常见的问题指南 1. 参考书推荐 2. 针对样品的常见问题 3. 抗体 4. 滤纸、胶和膜的问题 5. Marker 的相关疑问 6. 染色的选择7. 参照的疑问8. 缓冲液配方的常见问题 9. 条件的摸索10. 方法的介绍 11. 结果分析（1）原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 （2）分类 ①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 （3）主要试剂 1、(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和 1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。 2、，1mlH2O去离子水配制，室温保存。 3、分离胶缓冲液:1.5mmol/L Tris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C 保存。 4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05g Tris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。 5，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制. 6.1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。 7缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
His蛋白纯化原理、方法和问题分析
组氨酸(His)标签蛋白的纯化 His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱（IMAC）纯化。 IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath et al.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadex G-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年1987年Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。1986年Porath et al.还发现Fe3+-IDA-sephadex G-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。 Ni柱中的氯化镍可以与有HIs（组蛋白）标签的蛋白结合，也可以与咪唑结合。 步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化镍，一个柱长体积就行了，然后平衡柱子，拿你自己的buffer，给蛋白提供最适的环境，我一般平衡4个柱长，然后蛋白上样，你可以让他自己挂，这样挂柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加个恒流泵，但是一定不能太快，太快挂柱效果差，当然你也可以选择循环挂柱，就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯，从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。挂完之后，按理想来讲，你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了，杂蛋白多数在烧杯里，留下来了，当然肯定有少量杂蛋白也挂上了，这时候你要梯度洗脱，拿咪唑和你的buffer配，一般从0 20mM 40mM。。。。100mM这样洗脱（当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候）我指的是咪唑的终浓度。咪唑加入之后，会和蛋白争夺与Ni的结合位点，杂蛋白、你的目的蛋白，会在不同的浓度被洗脱下来，洗完之后，你可以用400mM咪唑洗柱子，清理一切蛋白，然后平衡几次，是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~过的蛋白用不同的管子收下，然后SDS-page检测在哪个管子里。 市面常见的商品化IMAC用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几种： 一、组氨酸(His)标签蛋白的纯化步骤： 大肠杆菌的破碎方法： 1）收集培养发酵液，4度7000-8000g离心10分钟，收集沉淀的菌体(如果不是马上破碎可以放-70度冷冻，但是最好能保存成小块或者薄片，这样好用。) 2）取1-2克菌体加10ml破碎缓冲液（pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，0.5mg/ml溶菌酶，1mM PMSF，1mM MgCl2，1.7units/ml Benzonase,其中的菌酶，1mM PMSF，1.7units/ml Benzonase现加）在冰上混合45分钟，如果pH不在7-8，需要用0.5M NaOH一边搅拌一边滴加.如果溶菌酶10mg/ml混合时间可以缩短到
SDS-PAGE电泳常见问题
SDS-PAGE电泳问题总结 蛋白质条带为什么走到下面逐渐变宽发散？ 回答:多数情况是因为小分子在胶里的运动不规律，这种情况常发生在高浓度胶或凝固不一致的胶里，你可以加大阴极的缓冲液浓度，可能会有点改善 胶凝的快慢不在于TEMED多少，在于APS的量，APS提供自由基，TEMED帮助自由基作用， 是催化剂，对凝固速度影响不是太大，可以试试加大APS的量 丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶的分辨范围 15 ％ 15～45 kDa 12.5％ 15～60 kDa 10 ％ 18～75 kDa 7.5％ 30～120kDa 5 ％ 60～212kDa 来源于《蛋白质技术手册》汪家政 每种浓度的变性胶的分离范围不是指能跑出哪个范围分子量的蛋白质，而是指在这个区 间内，蛋白质迁移率基本和分子量成正比，也就是线性关系，为了数据的可靠性，大家 尽量根据这个来选择自己配胶的浓度。 下层也就是阳极缓冲液的作用当然是导电，用普通TRIS缓冲液做阳极缓冲液，一样跑得好，阴极就不一样了，需要提供离子强度和SDS环境，而在电泳过程中，阴极缓冲液的一些离子损失，而且与样品接触，不适合再次使用
至于有些时候跑太大浓度的胶，因 为药品，BUFFER配制过程的一些问题，导致会出现蛋白带无法电泳到分离胶的最下方，胶跑得难看情况比较多，一般来说，15%的胶已经能够跑出大约15KDa左右的蛋白，对于普通 SDS-PAGE已经几乎到了极限，还跑不出来的MARK带，就不必去追究商品的问题了 SDS-PAGE胶的凝结速度受温度影响很大，随着温度的升高，凝结速度越来越快，温度降低则反之。所以，夏天时胶凝结的比较快，而冬天脚的凝结速度则变慢，甚至不能凝结，解决此类问题较可行的方法是：冬天在原配方的基础上加倍过硫酸铵和TEMED的使用量，可很好的解决胶凝结速度过慢的问题。 做SDS-PAGE的时候，除了蛋白量上样一致，最好体积也一致，这样跑出来的胶各个泳道之间的band能做到一样宽，方便后面的比较，特别是WB。做法就是拿1X的上样缓冲补全要加的样做到体积一致，否则跑出来会有的宽有的窄，特别是上样体积相差较大的 加入染色液后，先放入微波炉里加热5-10秒，使染色液微热即可（千万不要加热太久， 否则冰醋酸就挥发了）。然后放水平摇床上摇20分钟，最多半小时就染好了。脱色也很 简单，不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉里煮沸5分钟左右，然后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次，就可以了。效果可能比正常的脱色稍差一点点，不 如那样清楚，只要电泳时比平时多上1/5的样品就可以了，关键是这样省时省材料（用不
党政机关公文处理中的常见错误分析及案例解读(培训辅导授课讲稿)
公文处理中的常见错误分析及案例解读 XXX （2018年6月13日） 尊敬的各位领导、各位同行，大家好： 根据安排，我与大家交流探讨四个方面内容：一是?党政机关公文处理工作条例?的特点和规范性要求；二是公文处理中常见错误分析；三是办公厅办文中出现的不规范性案例；四是市州政府和省政府部门向省政府报文易出现的错误和应该注意的问题。 一、《党政机关公文处理工作条例》的特点和规范性要求 （一）《党政机关公文处理工作条例》的主要特点。 ?党政机关公文处理工作条例?已经党中央、国务院同意，自2012年7月1日起施行；与之配套的?党政机关公文格式?已由国家质检总局、国家标准委发布，自2012年7月1日起正式实施。其主要特点如下（五个统一）： 1.统一了公文的定义。“党政机关公文是党政机关实施领导、履行职能、处理公务的具有特定效力和规范体式的文书，是传达贯彻党和国家方针政策，公布法规和规章，指导、布臵和商洽工作，请示和答复问题，报告、通报和交流情况等的重要工具。”（简称五大作用：一是指导工作，传达意图；二是联系工作，交流情况；三是请示工作，答复问题；四是总结工作，推广经验；五是记载工作，积累史料。）
2.统一了公文种类。统一后的公文种类有15种：决议、决定、命令（令）、公报、公告、通告、意见、通知、通报、报告、请示、批复、议案、函、纪要。这里大家注意，除了文种种类统一以外，还有一点就是“会议纪要”改成了“纪要”。 15个文种的适用范围： 决议：适用于会议讨论通过的重大决策事项。 决定：适用于对重要事项作出决策和部署、奖惩有关单位和人员、变更或者撤销下级机关不适当的决定事项。 命令（令）：适用于公布行政法规和规章、宣布施行重大强制性措施、批准授予和晋升衔级、嘉奖有关单位和人员。 公报：适用于公布重要决定或者重大事项。 公告：适用于向国内外宣布重要事项或者法定事项。 通告：适用于在一定范围内公布应当遵守或者周知的事项。 意见：适用于对重要问题提出见解和处理办法。 通知：适用于发布、传达要求下级机关执行和有关单位周知或者执行的事项，批转、转发公文。 通报：适用于表彰先进、批评错误、传达重要精神和告知重要情况。 报告：适用于向上级机关汇报工作、反映情况，回复上级机关的询问。 请示：适用于向上级机关请求指示、批准。 批复：适用于答复下级机关请示事项。 议案：适用于各级人民政府按照法律程序向同级人民代表
蛋白质组学常见问题及解答
蛋白质组学常见问题及解答 作者：未知来源：华大中生科技公司点击：129 时间：2006-9-12 Q: 重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑2D 的一向吗？ A: 一般情况下是可以的。但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收，这样跑完1D 和2D 胶后，会有很多横向条纹。所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。 Q: 为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面？ A: 这是因为BioRad 的电泳槽有个盖子。为了固定电泳槽中的胶条，这个盖子上设计了对应的突起，以便压住胶条。由于虹吸作用，这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽，从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面。如果由此把胶条暴露在空气中，那对等电聚焦的影响将是毁灭性的。为了防止这个现象的发生，可以在相邻的空电泳槽里，也加入适量（ 80 ％满）的矿物油。 Q: 跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？ A: 刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应的 pH 条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的pH 区域移动。Q: 跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动？ A: 蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。溴酚蓝也是pH 指示剂，当它移动到酸性区时（pH4 ），颜色会变成黄色。溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。 Q: 跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？ A: 当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。Q: 跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？ A: 当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的pH 值区域值，从而变成中性分子。这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。 Q: 跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生？ A: 等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的pI 值区域，而成为中心分子。这是加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。 Q: 重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么？A: 硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的pH 值后，就变成了中性分子。而不带电荷的蛋白质分子容易聚集，从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率，可能会造成竖的脱尾。而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用，防止它们的聚集。 Q: 怎样估计2D 胶上蛋白质点的分子量和pI 值？ A: 可以用BioRad 生产的2D 胶标准蛋白来校准。也可以用体系内已知蛋白来做比对。