157顺铂对Tca8113细胞线粒体内质网凋亡相关蛋白
科技信息2013年第1期
ＳＣＩＥＮＣＥ＆ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ
口腔颌面部恶性肿瘤的发病率在逐年的升高，严重威胁着人们的健康和生命。但是，传统的手术治疗的方法往往伴随着复发，因此需要寻找新的口腔颌面部恶性肿瘤治疗策略。顺铂是临床常用的治疗癌症的药物化其作用机制源于其DNA损伤作用，引起癌症细胞发生凋亡[1－2]。近来的研究显示，顺铂在诱导细胞发生凋亡的同时可以诱导内质网应激的发生[3]。内质网主要参与细胞内蛋白质的折叠，脂类的合成和钙离子的储存。许多生理和病理条件下都可以干扰内质网正常的功能，从而导致内质网应激的发生[4]。内质网应激可以活化一系列信号转导通路，从而诱导凋亡的发生[5]。本研究通过体外培养人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞，初步探讨顺铂对线粒体凋亡信号通路以及内质网凋亡信号通路的影响，为寻找新的治疗舌鳞状细胞癌的策略提供一定的理论依据。
1材料与方法
1.1试剂与细胞
顺铂和MTT购自Sigma公司；Caspase-3，Cleaved caspase-3，Bax，Bcl-2，GRP78和CHOP抗体购于Santa公司；人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株用含10%胎牛血清（Gibco公司）的DMDM（Gibco公司）培养液在37℃、5%CO2的孵箱内孵育培养，胰酶消化传代，隔2d 传代1:3传代，取对数生长期Tca8113细胞进行实验。
1.2实验分组
实验分为对照组（Control）以及不同剂量顺铂作用的实验组。
1.3细胞存活率检测
活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶可以将外界给予的MTT试剂还原成难溶性的蓝紫色颗粒继而沉积在细胞中,而死细胞线粒体却没有此功能。因此我们利用此方法检测顺铂对Tca8113细胞增值率的影响。取出于对数生长期的Tca8113细胞消化离心后均匀的加入到96孔细胞培养板中，每孔中加150μl约含1-1.5×104Tca8113细胞的培养液，二氧化碳培养箱中培养12-18小时，使细胞完全贴壁。设立对照组以及不同浓度顺铂作用组，每个组设置6个重复孔，作用24小时后，每孔加入20μl MTT，继续孵育4小时后弃掉孔板中的培养液，每孔加150μl DMSO，利用孔板振荡器振荡10min，充分融解孔板内结晶物。完全溶解后，在BIO-TEK酶标仪上，选择490nm波长，测定96孔细胞培养板各孔光吸收值，最后进行细胞增值率计算。对照组细胞存活率为100%,其余各组存活率=（各浓度组A值/对照组A值）×100%。
1.4Western blotting检测凋亡和自噬相关蛋白的表达
顺铂作用后，收集细胞。预冷PBS洗涤细胞两次，每瓶加入120μl RIPA蛋白裂解液，充分混匀后利用细胞刮将细胞完全刮下后移入1.5ml离心管中，放入4℃冰箱中作用45min，然后低温离心机离心，4000rpm离心20min，收取上清，检测蛋白浓度。取蛋白标准品BSA （1mg/ml），用RIPA液稀释将其稀释成0.1mg/ml，将待测蛋白2μl加入200μl Bio-Rad Assay Buffer，震荡混匀，酶标仪测630nm测量各孔OD 值，绘制标准曲线，根据标准曲线计算出各组蛋白浓度。100℃蛋白变性，然后用加样器缓慢加入变性后蛋白样本。上样完成后进行电泳，上层胶90V，15min，大约溴酚蓝指示到达浓缩胶和分离胶连接处，改变电源电压，下层胶180V，50min，当溴酚蓝即将分离胶底部时停止电泳。电泳结束后转膜，将转膜夹底部先铺上两层海绵，然后平铺两层滤纸，然后将切好的蛋白胶放在两层滤纸之上，上面放少许液体，轻轻平铺PVDF膜，然后再放入两层滤纸和两层海绵，利用平压后平推的方法清除每层之间的气泡。转膜，100V，120min。转膜结束后将完成转膜的PVDF膜放入5%脱脂奶粉中封闭30min。封闭结束后用加入相应一抗，4℃过夜。第二天，利用PBST洗膜3次，每次15min中，加入相应二抗，室温1小时。然后PBST再洗膜3次，每次15min，DAB显色液进行显色，当刚刚看到目标带后将膜放入蒸馏水内中止显色。显色完成后拍照，灰度值扫描分析，然后将PVDF膜晾干后封存。
1.5统计学分析
蛋白电泳灰度值运用SPSS11.0软件进行统计学数据分析处理，数据以X±S进行表示。电泳条带灰度值以灰度×面积/对照组表示。2结果
2.1CDDP对Tca811细胞生存率的影响
图1所示不同浓度CDDP可以明显降低Tca811细胞的生存率。
图1CDDP对Tca811细胞存活率影响
2.2CDDP对Tca811细胞凋亡相关蛋白Caspase-3表达的影响
Caspase-3蛋白是细胞凋亡的效应分子，当细胞发生凋亡时，其活性片段Cleaved Caspase-3表达水平明显增高。如图2所示，CDDP可以明显的增加Cleaved Caspase-3的表达，差异具有统计学意义提示CDDP可以诱导Tca811细胞发生凋亡。
2.3CDDP对Tca811细胞线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2以及Bax表达的影响
细胞内存在多种凋亡信号通路途径，其中线粒体凋亡信号通路是细胞内主要的凋亡信号通路，Bcl-2蛋白家族在线粒体凋亡信号通路中发挥重要的作用。如图3所示，CDDP可以降低抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡相关蛋白Bax的比值，提示CDDP可能通过线粒体凋亡信号通路诱导凋亡的发生。
2.4CDDP对内质网应激相关蛋白表达影响
近来的研究显示，CDDP可以诱导肿瘤细胞发生内质网应激，我们首先检测了内质网应该相关蛋白GRP78的表达水平，如图4A和4B所示，CDDP可以明显的增加GRP78的表达水平。内质网应激在一定条件下也可以诱导凋亡的发生，因此我们进一步检测了内质网凋亡信号通路蛋白CHOP的表达水平，结果显示CDDP同样可以引起
顺铂对Ｔｃａ８１１３细胞线粒体以及内质网
凋亡相关蛋白的影响
石璐
（长春医学高等专科学校，吉林长春130031）
【摘要】本文通过探讨顺铂对人舌鳞状细胞癌细胞Tca8113细胞线粒体与内质网凋亡蛋白的影响，探讨顺铂诱导Tca8113细胞发生凋亡的机制。体外培养Tca8113细胞，顺铂（CDDP）作用后，通过MTT检测Tca8113细胞增值率；Western Blotting检测顺铂对Tca811细胞线粒体凋亡以及内质网凋亡相关蛋白表达水平的影响。与对照组相比较，CDDP可以明显抑制Tca811细胞的存活率，差异有统计学意义（P﹤0.05）；Western Blotting结果显示，顺铂可以明显的增加线凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3的表达水平。另外，CDDP可以增加线粒体凋亡相关蛋白Bax的表达，以及内质网凋亡相关蛋白CHOP的表达。顺铂可以诱导Tca8113细胞发生凋亡，其凋亡可能通过线粒体与内质网凋亡信号通路共同发挥作用。
【关键词】凋亡；顺铂；鳞状细胞癌
※基金项目：此文为吉林省教育厅“十一五”科学技术研究项目研究成果
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○本刊重稿○
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