各种感受态细胞的区别、用途和特征

Xl1-Blue菌株

基因型：endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F‘[Tn10 proAB+ lacIq Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK- mK+)。

特点：具有卡那抗性、四环素抗性和氯霉素抗性。

用途：分子克隆和质粒提取。

BL21(DE3)菌株

基因型：F–ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])。

特点：该菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。

用途：蛋白质表达。[生物秀-专心做生物https://www.360docs.net/doc/822911301.html,]

BL21(DE3)ply菌株

基因型：F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3) pLysS(cmR)。

特点：该菌株带有pLysS，具有氯霉素抗性。此质粒还有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。

用途：蛋白质表达

Competent E. coli

Full Product Description BL21 Star? E. coli strains are high-performance BL21 hosts designed for improving protein yield in a T7 promoter-based expression system. Because T7 RNA polymerase synthesizes mRNA more rapidly than E. coli RNA polymerases, transcription from the T7 promoter is uncoupled to translation in E. coli. This results in mRNA transcripts unprotected by ribosomes, which are then subject to enzymatic degradation by endogenous RNases (1). The reduced level of transcripts in the cell often leads to greatly reduced levels of protein yield (Figure1). The BL21 Star? strains contain a mutation in the gene encoding RNaseE (rne131), which is one of the major sources of this mRNA degradation (2). BL21 Star? cells significantly improve the stability of mRNA transcripts and increase protein expression yield from T7 promoter-based vectors (3) (Figure 2).

BL21 Star?(DE3) is ideal for expressing proteins that are non-toxic to E. coli.

BL21 Star?(DE3)pLysS offers lower basal-level expression of heterologous genes than BL21 Star?(DE3). It is designed for expressing proteins that are slightly growth inhibitive to E. coli.

DH5α菌株

基因型：F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-, λ–

特点：一种常用于质粒克隆的菌株。其Φ80dlacZΔM15基因的表达产物与pUC载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。recA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。

用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。[生物秀-专心做生物https://www.360docs.net/doc/822911301.html,]

JM109菌株

基因型：endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ Δ(lac-proAB) e14- [F‘traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15]hsdR17(rK-mK+)。

特点：部分抗性缺陷，适合重复基因表达, 可用于M13克隆序列测定和蓝白斑筛选。

用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。

JM109,DH5a,BL21等感受态细菌特点及应用

1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coliDH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 BL21菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21 的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。基因型：F-，ompT， hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株 BL21(DE3) pLysS菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株 JM109菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α －互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac －proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TOP10菌株 TOP10菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697， galU，galK ，rps， (Strr) endA1， nupG 6：HB101菌株 HB101菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1

感受态细胞制备及各种感受态的特点

感受态细胞制备制备感受态常用的方法是电击法和CaC2制备法，以下介绍 CaC2制备法： 1、可以从-80 C冰柜中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板（由于 Rocetta 含有氯霉素抗性，需要涂布在氯霉素抗性的平板，后面的都是如此）上划线，并将菌种迅速放回 -80 C保存，在划线板上做好相应标记，于37 C培养过夜。 2、从37 C培养过夜的新鲜平板上挑取一个单克隆，接种于 2mlEP管中，37 C, 220rpm 震荡培养约 6个小时至对数生长中后期；将该菌悬液以 1:100 的比例接种于 50ml LB 液体培养基（ 2瓶）中，37 C 振荡培养2.5小时至OD600=0.5 。注意：接种比例不得大于 1:10。 3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷的离心管（50ml ）中,在冰上放置5~10min ；注意：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管,划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。 4、4C 5000g 离心 5 分钟。用预冷的去离子水洗涤沉淀, 4C 5000g 离心 5 分钟； Note ：此步主要是为了洗去培养基中的盐等 5 、沉淀加入 2ml 预冷的 0.05mol/L CaCl 2-1 5%甘油混合溶液, 轻吹散,冰浴 5分钟, 4C5000g 离心 5 分钟； 6、沉淀加入 2ml 预冷的 0.05mol/L CaCl 2-15%甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞悬液。分装成50~100卩l的小份，贮存于-70 C可保存半年。含 15%甘油的 0.05mol/L CaCl 2制备方法 : 称取0.28g CaCL（无水,分析纯），溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml,高压灭菌。感受态细胞的特征感受态：通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源 DNA 的状态。感受态细胞的特征：（1 ）细胞表面暴露出一些可接受外来 DNA 的位点（以溶菌酶处理,可促使受体细胞的接受位点充分暴露）。（2）细胞膜通透性增加（用钙离子处理,可使膜通透性增加,使DNA 直接穿过质膜进入细胞）。（ 3 ）受体细胞的修饰酶活性最高,而限制酶活性最低,使转入的 DNA 分子不易被切除或破坏。实验室常用的感受态细胞 1. DH5 a菌株

原核表达--宿主菌株选择指南

作为原核表达地宿主，对外源基因地表达会产生一定地影响，是勿庸置疑地.每一个宿主细胞都像一个微观地小工厂，按照细胞固有地程序完成“你给它们安排地生产任务”――因为很难亲眼观察微观世界中表达是如何进行地，当出现问题时，我们需要经验判断问题所在.宿主细胞对原核表达可能会产生哪些影响呢？知其然还要知其所以然.比如，菌株内源地蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物地不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想地起始表达菌株.堪称经典地系列就是和蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉地表达菌株.大名鼎鼎地()融源菌则是添加聚合酶基因，为表达系统而设计.文档收集自网络，仅用于个人学习真核细胞偏爱地密码子和原核系统有不同，因此，在用原核系统表达真核基因地时候，真核基因中地一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低.改造基因是比较麻烦地做法，系列就是更好地选择―― 这种携带质粒地衍生菌，补充大肠杆菌缺乏地七种（及）稀有密码子对应地，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中地表达水平.（已经携带有氯霉素抗性质粒）文档收集自网络，仅用于个人学习当要表达地蛋白质需要形成二硫键以形成正确地折叠时，可以选择衍生菌系列，()和()两条主要还原途径双突变菌株，显著提高细胞质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达.（卡那霉素敏感）文档收集自网络，仅用于个人学习 ? 则是综合上述两类菌株地优点，既补充种稀有密码子，又能够促进二硫键地形成，帮助表达需要借助二硫键形成正确折叠构象地真核蛋白.（卡那霉素敏感）文档收集自网络，仅用于个人学习是衍生自突变地菌株，这个突变能根据地浓度精确调节表达产物，使得表达产物量呈现浓度依赖性.（四环素敏感）文档收集自网络，仅用于个人学习在决定试用这些名字古怪地菌株时，有几个小要注意地，一个是不同菌株有时已经携带某个质粒或者已经具有某种抗生素抗性，要注意自己地表达质粒是否能与之兼容.比如已经携带有氯霉素抗性质粒，不能再用氯霉素筛选等等.文档收集自网络，仅用于个人学习现象可能原因改进方案建议菌株无蛋白表达出现截短蛋白 . 地密码子偏移性补充稀有密码子地；将稀有密码子突变为普通大肠杆菌密码子包涵体二硫键形成困难降低宿主胞质地还原性；利用促进二硫键形成地各种载体标签表达过快，表达量过高控制优化表达水平：降温，浓度优化

常用几种感受态区别

常用大肠杆菌感受态JM109，DH5a，BL21的区别 1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。基因型：F-，ompT， hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TOP10菌株该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697， galU ，galK ，rps， (Strr) endA1， nupG 6：HB101菌株该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1 7：M110或 SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶 C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影

大肠杆菌感受态细胞制备

大肠杆菌电转化感受态细胞制备第一天： 1. 将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养 2. 高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用 3. 准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天： 4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板∑恐? 5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时 6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次) 7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时) 8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液(如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天) 9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升)，然后加水稀释至离心管的2/3体积。 10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液 11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞 12. 离心，弃上清液 13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液(沉淀可能会很松散) 15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml 16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80°C保存转化方法: 1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟

2. 添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟 3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡)中 4. 加载P1000，准备好300μl LB 或 2xYT 5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏)(检查时间常数，应该在3以上) 6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中 7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法大肠杆菌电转化感受态细胞制备第一天： 1. 将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养 2. 高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用 3. 准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天： 4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板∑恐? 5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时 6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次) 7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时) 8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液(如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天) 9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升)，然后加水稀释至离心管的2/3体积。 10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液

(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备

大肠杆菌感受态细胞的制备标签： tr..,Ca..,co.. 分类：细胞技术> 感受态细胞来源：实验管理实验概要大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化实验原理处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。主要试剂 (1)0.1mol/L CaCl2溶液 (2)LB液体培养基

TOP10 感受态细胞使用说明书

全国免费电话：400-818-1148 TOP10 感受态细胞 Cat. No. JH0102-3 保存：-80℃ 组分说明产品简介本产品是大肠杆菌 TOP10 菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于 DNA 的热击转化。TOP10 是一种常用于质粒克隆的菌株，其 φ80lacZΔM15 基因产物可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。使用 pUC19质粒检测，转化效率可达 108，适用于高效的质粒 DNA 克隆并能保证高拷贝质粒的稳定复制。注意事项 1.转化所有步骤均在无菌条件下操作。 2.感受态细胞应在-80℃下保存，不可多次冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。 3.包装中有0.1 ng/μl 的pUC19DNA ，供对照试验使用。操作步骤 1.取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100 μl ，可以根据实际情况分装使用。以下实验以100 μl 感受态细胞为例。 2.待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入目的DNA （根据实际情况加入适量的DNA ，通常100 μl 感受态细胞能够被1 ng 超螺旋质粒DNA 所饱和），用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30分钟。 3.42℃热击90秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。 4.向每个离心管中加入900 μl 无菌的SOC 或LB 培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床，150 rpm 振荡培养45分钟使菌体复苏。 5.取100 μl 已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC 或LB 固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，直至干燥，倒置平板，37℃培养12-16小时。注意：1）涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA 总量较多，可取少量转化产物涂布平板；若转化的DNA 总量较少，可取200-300 μl 转化产物涂布平板。若预计的克隆数较少，可通过离心（4,000 rpm ，2分钟）后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于平板中。 2）新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。 3）涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。 Cat. No. JH0102-3 Kit Size 10×100 μl TOP10 感受态细胞 10×100 μl Control DNA pUC19，0.1 ng/μl 10 μl

感受态细胞制备及各种感受态的特点

感受态细胞制备及各种感受态的特点 Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT

感受态细胞制备制备感受态常用的方法是电击法和CaCl2制备法，以下介绍CaCl2制备法： 1、可以从-80℃冰柜中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板（由于Rocetta含有氯霉素抗性，需要涂布在氯霉素抗性的平板，后面的都是如此）上划线，并将菌种迅速放回-80℃保存，在划线板上做好相应标记，于37℃培养过夜。 2、从37℃培养过夜的新鲜平板上挑取一个单克隆，接种于2mlEP管中，37℃， 220rpm震荡培养约6个小时至对数生长中后期；将该菌悬液以1:100的比例接种于 50ml LB液体培养基（2瓶）中,37℃振荡培养小时至OD600=。注意：接种比例不得大于1:10。 3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷的离心管（50ml）中，在冰上放置 5~10min；注意：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管，划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。 4、4℃ 5000g离心5分钟。用预冷的去离子水洗涤沉淀，4℃ 5000g离心5分钟；Note：此步主要是为了洗去培养基中的盐等 5、沉淀加入2ml预冷的L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，冰浴5分钟，4℃5000g 离心5分钟； 6、沉淀加入2ml预冷的L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，即成为感受态细胞悬液。分装成50~100μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。含15%甘油的L CaCl2制备方法: 称取 CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。

实验室常用的细菌作用及其选择

第一篇：JM109，DH5a，BL21这些感受态有何区别 1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。基因型：F-，ompT， hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac －proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TOP10菌株该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697， galU ，galK ，rps， (Strr) endA1， nupG 6：HB101菌株该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验

实验室离心机的选择和分类

实验室离心机的选择和分类离心机是一种结构复杂的高速旋转机械，它是利用离心力，不同物质在离心场中沉淀速度的差异，对混合溶液进行快速分离的专门设备，是一种将装有样品溶液的离心管、瓶或袋韵转头置于离心轴上，利用转头绕轴高速旋转所产生的强大离心力，使样品中不同性质颗粒相互分离的特殊装置。，可以实现样品的分析、分离。离心机自问世以来，历经低速、调整、超速的变迁，其进展主要体现在离心机设计和离心技术两方面，二者相辅相成。由于台式离心机结构简单，造价低，体积小，很快成为实验室的常规仪器，国内外知名离心机厂商几乎都生产台式离心机，如近几年来在我国比较活跃的德国Hheraeus，eppendof，Sigma，Hettich，Hermle，法国的Jouran，美国的Beckman，Sorvall，IEC，日本的Hitachi，Kukna，Sanyo／Mse等，国内的北京医用离心机厂、湖南凯达科学仪器有限公司、上海安亭科学仪器厂等。从转速看，台式离心机基本属于低速、高速离心机的范畴，因此，具有低速、高速离心机的特点。与落地式离心机相比，只不过只是尺寸和容量小一些。离心机的式样和型号很多，有国产的和进口的，按用途可分为分析式离心机和制备式离心机；按转速可划分为：普通离心机(低速)<8000r／min；高速离心机8000 ～30000r／rain；超速离心机30000 ～80000r／min；超高速离心机>80000r／min；按生物高分子量来选用离心机：分子量>10。，用普通离心机和高速离心机；

分子量10 ～10。，用超速离心机；分子量<10 ，用离心和超离心分离效果不好，必须采用另外的分离方法。可以根据实验目的和实验需要，选择不同容量、不同转速、不同温度控制的离心机。例如，需要常温、微量、快速离心时，可使用手掌型离心机(LX—100型，江苏海门麒麟医用仪器厂生产)和微型离心机(DW一41型，韩国KOREA)；如需要的转速不大于16000rpm，可使用台式离心机(德国Hettich，MIKRO12—24型；做质粒DNA少量提取、cDNA提取实验，蛋白提取，及从植物中提取RNA时，转速需要12000—140000rpm，经常使用高速冷冻台式离心机(德国Hettich，16R型和32R型)、台式高速离心机(德国HettichMIKRO12—24型)及高速冷冻离心机(法国JOURN BR4i型)；在制备感受态细胞和大量提取质粒DNA时，经常使用到自动高速冰冻离心机(日本HITACHI，日立工机株式会社，20PR-52D型)和超高速冷冻离心机(美国Beckman A vantU一301)型；如需要大量离心，例50mL、100mL或100mL以上，且转速需要20000～70000rpm，则可以使用自动超速冰冻离心机(日本HITACHI，日立工机株式会社，70P一72型)。在上述离心机当中，比较先进的是美国Beckman A vanti J一301型超高速冷冻离心机，其性能较优越，集真空、高速和冷却于一身，可以用于大量的细胞、亚细胞、细菌、病菌的快速分离，是常见的实验室设备，通常将转速在5000 ～30000RPM(转／分钟)范围内的离心机称为高速离心机，Beckman A vanti J一301型离心机的最高转速是30000RPM，因此属于高速离心机的范围。

常用大肠杆菌感受态JM109,DH5a,BL21等的区别-用途-特征

常用大肠杆菌感受态JM109，DH5a，BL21等的区别 1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pU C系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gy rA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLy sS菌株该菌株含有质粒pLy sS，因此具有氯霉素抗性。PLy sS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLy sS ，C amr 4：JM109菌株该菌株在使用pU C系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的La cZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株基因型：recA1，endA1，gy r A96，thi－1，hsdR17，supE44，re lA1，Δ（lac－proA B）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TO P10菌株该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。基因型：F- ，mcr AΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU，galK ，rps，(Strr) endA1，nupG 6：HB101菌株该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xy l-5，mtl-1，le uB6，thi-1 7：M110或SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GA TC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC 序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影响. 部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如F baI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如XbaI, BclI等。而且甲基化只发生在特定序列，以XbaI为例，只有在位点序列旁出现GA或TC，该XbaI位才会被甲基化。而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法：（1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响；（2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coli JM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。 8：E.coli JM110 要排除dam,dcm甲基化的影响，需要用特定的dam-,dcm-的菌株，如JM110 如果由JM110或SCS110等甲基化缺失的菌株产生的质粒，则不会被甲基化. 各种感受态细胞的区别用途特征 Xl1-Blue菌株

超级高效感受态细胞

克隆/建库/表达专用超级高效感受态细胞国外的同学说一般他们克隆都是直接购买感受态细胞转化，实验效率很高的。我总是以为如果是一般的克隆实验，自己做感受态好像够用了－－如果是建库，购买现成的感受态细胞就是非常必要的首选，因为转化效率确实比实际手工制备的高2－3个数量级以上，特别是建库，能实实在在地提高实验的效率。实际上，除了建库以外，Stratagene为更好的表达蛋白、以及转化效率较低的巨无霸质粒，而特别优化了一些感受态细胞，做表达的人其实可以参考一下，有点用处的。生物通在这里借用Merck公司提供的资料供大家参考。 Stratagene的XL10-Gold?几乎算得上是高效转化的代名词了，研究者一旦要克隆大质粒、连接DNA和建库，克隆甲基化DNA，进行蓝白斑筛选等，首选的就是XL10-Gold?和其衍生菌。 XL10-Gold?用途包括： --克隆大DNA：包括表达质粒，基因组DNA克隆 --构建质粒文库：减少DNA大小偏倚性，使全长cDNA克隆、双杂交质粒等各种大小的质粒转化效率更接近，提高文库代表性（比DH10B高25倍）。 Hte 基因型 Hte（高效转化）基因型是Stratagene开发的特异性提高大质粒、连接DNA的宿主菌基因型，并使细胞生长加快（当天获得菌落），已经成功应用于25kb超螺旋DNA和8kb连接DNA的克隆。XL10-Gold?，BL21-Gold，BL21-CodonPlus?，SoloPack? Gold 和96Pack? Gold等系列细胞都带有这个新的性状。超级感受态细胞 Stratagene提供多种>5 x109转化子/μg 超螺旋DNA转化效率的化学法超级感受态细胞正是克隆获得大质粒、连接DNA克隆和建库时最值得推荐的。电转化感受态细胞 Stratagene的电转化感受态细胞特别耐受电击处理，方便好用，在DNA材料极珍贵、量少时，或构建有代表性文库时，建议采用电转化感受态细胞。ElectroTen-Blue?细胞是目前商品化的电转

感受态细胞制备的几种方法

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法关于感受态细胞(Competent cells) 常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。转化，是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。 α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-?-D 硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为α-互补现象。由互补产生的α－半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法方法一：细菌转化的方法多以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌。本法适用于大多数大肠杆菌菌株，且迅速、重复性好。操作过程简述如下。 1．从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH52），或1ml 新鲜的16～20h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约2～3h（旋转摇床200～300r/min），每隔20～30min测量OD600值≈0.4。 2．在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10～20min。 3．于4℃用SorvallGS2转头（或与其离心管相配的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。 4．倒数培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。 5．以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀，放于冰上。 6．于4℃用SorvallGS3转头（或与其相应的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。 7．倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。 8．每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用。 9．用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加DNA或连接反应混合物（体积≤10μl，DNA≤50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。

感受态细胞的制备方法

感受态细胞的制备方法 1、感受态定义、作用、常用制备方法及原理 2、感受态细胞不好用的原因 3、影响转化效率的原因 4、为何要低温环境制备 1.感受态定义：细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态（competence）。作用：如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。感受态的目的是增加细胞的通透性，以便外源基因进入宿主细胞，实现转化的目的。优点是细胞膜通透性增大，方便大分子的进入。意义是实验转移外源DNA分子进入受体细胞，完成实验。常用制备方法：细菌感受态少量制备法（CaCl2法）、细菌感受态大量制备法、细菌电转化法等详见《基因工程实验指导》p153-157. 2.感受态细胞做得不好的原因一．菌液OD值偏大或偏小二．原始菌株不好三．试剂超纯程度不够四．操作时对菌体伤害过大 3. 影响转化效率的原因 1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制.DH5α菌株OD600为0.5 时细胞密度是5 ×107/ml ）；2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行； 3．经CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加, 24小时达到最高,之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）； 4．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO 或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高（100-1000 倍）； 5．所使用的器皿必须干净.迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率； 6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA ； 7．一定范围内,转化效率与外源DNA 的浓度呈正比； 4．为何要低温环境制备在制备过程中,细胞膜通透性增大而变得脆弱,低温能提高感受态细胞存活率.所以在制备感受态细胞时要保持低温和不能剧烈震荡. 如果放于-20℃保存，时间长了细胞内部液化度较高的情况下，细胞会由于流动性的原因造成不可逆损伤，甚至死亡。所以要放于-80摄氏度。

感受态制备注意事项

1>细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α 菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107个/mL左右，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 2>所有操作均应在无菌条件和冰上进行；实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。 3>经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的） 4>化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或 Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍） 5>所使用的器皿必须干净。少量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率; 首要问题就是操作是防止污染，因为这个是最容易影响感受态制作的因素。其次，就是悬浮沉淀的过程，一定要轻轻悬浮，最好轻摇悬浮，如果用移液器，把枪头前面剪掉一部分，然后再吹，这样吹的比较柔和感受态制备及转化的方法很多，效率最高的是电转化，可达到10次方，普通的化学转化只能达到8次方，一般自己做也就是6-7次方，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管即开始转化，但效率也最低，只能满足环形质粒的转化（某些公司也有现成试剂盒）要想又简单，又能有较高的转化效率，最好的莫过于1990年《Gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受态的制备与转化方法。以下是一些制备感受态的注意事项： 1、所用器具的洁净程度。这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的，毋庸置疑。 2、培养基的装量。培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值：培养基体积/三角瓶容量 =100ml/500ml，50ml/250ml。 3、培养基的pH值。这里讲的pH值并非单指配制或灭菌后的pH值，而且还包括整个摇瓶结束后的pH值。一般来说，接种前的pH值在6.8-7.2。等菌摇好后，可以测一下pH值，不要低于6.0，最好在6.5以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好，按要求做，肯定效率不低。 4、培养后的OD值。其实这是一个非常重要的参数，只是当OD值大到一定的程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调OD不得大于0.6、0.8等等。同时，OD值大时菌体总量大，感受态绝对数量要大一点。因此需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点。 5、培养基中的各种离子。经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时，该方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时，使用20mM MgCl2做为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。

常用大肠杆菌感受态JM109_DH5a_BL21等的区别

【引用】常用大肠杆菌感受态JM109，DH5a，BL21等的区别生命科学2011-03-31 14:48:42 阅读80 评论0 字号：大中小订阅本文引用自xxrrzq《常用大肠杆菌感受态JM109，DH5a，BL21等的区别》 1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TOP10菌株该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU ，galK ，rps，(Strr) endA1，nupG 6：HB101菌株该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1 7：M110或SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影响. 部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如XbaI, BclI等。而且甲基化只发生在特定序列，以XbaI为例，只有在位点序列旁出现GA或TC，该XbaI位才会被甲基化。而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法：（1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响；