FLAG IP WB 步骤

IP & WB protocol

（以6孔板转染和FLAG-IP后WB为例，peteadam整理）

一质粒转染及蛋白制备

1 接种293细胞入6孔板，细胞密度不宜过大，待293细胞长到大约60%时，转染质粒（具体步骤可参见lipofectmin 2000试剂说明书），加3ml没有抗生素的培养基，48h后收集细胞。

2 吸净培养基，用PBS吹洗下细胞，入1.5ml的EP管。3000rpm，4℃离心5min收集细胞（optional:再用PBS小心漂洗一道）。

3 加入4℃预冷的300μl lysis buffer.冰上裂解细胞10min，每间隔2min涡旋一次，共5次。

4 14，000rpm，4℃，离心5min，取上清。分为两部分，一份为30μl，加入5x protein loading buffer，混匀，75℃煮蛋白3-5min，作为input，于-20℃保存；另一份置于冰上，用于IP实验。

注意：所有的lysis buffer都应预冷，加0.1% PMSF（现用现加）和0.5mM DTT，以保护蛋白活性。

二准备beads

1 建议剪掉200 μl的枪尖，吸10μl FLAG 入 1.5ml的EP管中。

2用800μl lysis buffer清洗一次（加lysis buffer，倒转混匀4-6次；3000g, 4℃离心1min）

注意：应小心的去除上清，除了第一次用枪头加beads入EP管中以外，之后不论是加裂解液还是吸去裂解液，应尽量避免枪头碰到或吸到beads。

三免疫共沉淀反应

1 用IP lysis buffer 稀释另一份蛋白裂解液到1ml，加入到处理好的beads管子中，用手轻弹混匀即可。

2 将EP管固定到混匀器上，使混匀器于4℃旋转1h-4h。

3 将免疫沉淀后的溶液于3000rpm，4℃离心1min。去上清，剩下beads 在EP管中。（不要将枪头吸到beads）

4用1ml的lysis buffer洗涤beads两次（旋转5min后，3000rpm，4℃离心1min），尽量吸净上清，只剩beads。

5 用30μl2xprotein loading buffer将beads-抗原抗体复合物悬起，用手指轻轻弹匀，金属浴75℃煮3-5min。

6 将煮好的样品14000 rpm，离心3min，吸取上清到另一新的1.5ml 的EP管中，即为IP之后的样品，于-20℃冰箱冻存。

四Western Blot

1 SDS-PAGE凝胶电泳:清洗玻璃板组装电泳槽,制胶，待胶凝后，上样，电泳（跑浓缩胶时电压可调小一点）。

2 切胶：电泳完毕，先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬（应该边撬边用流水缓缓冲洗）。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去。根据实验需要按照蛋白的分子量，以Marker为对照进行切胶。将切好的胶置于水中室温摇晃平衡。

3 转膜：NC膜的大小与胶相当，比胶稍大。用前将膜在水中处理1min。用

4 ℃预冷的protein transfer buffer浸泡滤纸和海绵。组装电转膜装置，注意消除膜/胶之间的气泡，用湿转法进行电转，4℃，100伏1小时，注意观察电流大约为200mA。

注意：在胶上割一小角，代表从这个角向右开始点样，向下开始电泳。在NC膜上剪一个小角，与胶上的小角重合。转膜之后，小角在右上方时，表明对着我们的是蛋白面，从这角开始向左点样，向下电泳。

4 转膜完毕后，取出NC膜，用PBS-T简单洗膜1次.

5 封闭：准备20ml封闭液（含5%的奶粉的PBS-T）封闭NC膜上的非特异性结合位点。将膜浸泡于封闭液中,于室温轻柔晃动1h。

6 用PBS-T简单洗膜1次。稀释FLAG抗体，1/5000(2.5%milk in PBST)，将FLAG抗体和膜共孵育1h-2h，或4℃过夜。孵育完后抗体要回收，此抗体可以重复利用约10次，平时于-20℃冰箱保存。

7 用PBS-T洗膜5次，每次5min。

注意：整个WB过程中都要保持膜的湿润，请不要长时间将膜至于空气中。以免蛋白失活。

五ECL发光，显影及定影

1 将等体积的ECL Solution A和Solution B（各100ul/膜）混合，以制备检测混合液。检测混合液需平衡至少5 分钟。

2让洗过的印迹膜沥去多余的洗液，但不可使膜干燥。在膜上有蛋白的一面加上检测混合液，室温孵育5分钟；

3沥去多余的检测混合液，并用保鲜膜将膜包裹好，尽量平整并无气泡。

4 将膜放在X 光片盒中(有蛋白的一面朝上)，关掉暗室内的灯，用红色灯照明。在膜上铺一张X光片，关紧盒，曝光。

5曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影1min，显影结束后，马上把X-光片浸入超纯水中洗涤1min，然后再放入定影液中，定影时间一般为1min，以胶片透明为止，最后在超纯水中洗涤1min，洗掉多余的定影液，取出晾干。

注意：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角或者用镊子夹住，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。