荧光光谱法在药物分析中的应用_潘祖亭
第26卷第3期吉首大学学报(自然科学版)Vol.26No.3 2005年7月J ournal of J ishou University(Natural Science Edi ti on)Jul.2005
文章编号:1007-2985(2005)03-0027-08
荧光光谱法在药物分析中的应用
潘祖亭,关洪亮,原华平,李微,陈果
(武汉大学化学与分子科学学院,湖北武汉430072)
摘要:综述了荧光光谱法在药物分析中应用的研究进展,主要评述了几种常用的测定药物的荧光分析法,从机理角度详细阐述了利用荧光光谱法如何研究蛋白质、核酸等生物大分子与药物小分子的相互作用,并给出该方法在药物分析中应用的发展方向.
关键词:药物分析;荧光光谱分析法;蛋白质;核酸
中图分类号:O657.31文献标识码:A
1药物的荧光分析法进展
常用的药物分析方法有重量分析法[1]、滴定分析法[2]、色谱分析法(包括柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法、离子交换色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、固相微萃取、高效毛细管电泳等)[3-10]、光化学分析法(包括红外和紫外-可见分光光度法、荧光光谱法、化学发光法、磷光分析法、原子吸收光谱法、质谱法、共振光散射等)[11-18]、电化学分析法[19]等.荧光法以其灵敏度高、选择性好、操作简便等优点受到分析工作者的青睐.将荧光光谱分析法应用于药物分析,已在药物有效成分分析鉴定、药物代谢动力学研究、临床药理与药效分析等方面取得长足发展[20-21],并广泛应用于生化分析、生物医学、临床分析等领域的痕量分析[22-25].
常规荧光分析法最早被应用于分析抗疟疾药物奎宁[26].随着荧光分析法的发展,其应用范围日益扩大,被广泛用于抗菌素药物、止痛药、镇静剂、止血药等的分析[26],涉及合成药物、生物药物和天然药物.由于自身具有发射荧光特性的物质相对较少,并且受到拉曼峰和散射光等背景的干扰,常规荧光分析法在药物分析中的应用受到限制.为使荧光分析法的应用更加广泛,发展了各类荧光分析方法,如对不发荧光的物质可通过某类化学反应使其转变为适合测定的荧光物质[27-28],对荧光较弱的物质可采取荧光增敏分析法[29-30].近年来,还发展了各种新型荧光分析技术,如激光诱导荧光法[31]、同步荧光法[32]、导数荧光法[32]、荧光探针法[33]、光化学荧光法[34]、时间分辨荧光法[35]、三维荧光法[36]、偏振荧光法[37]、荧光免疫测定法[38]、荧光成像技术[39]、荧光光纤传感器[40]等.这些技术的应用加速了各种新型荧光分析仪器的研制,使荧光分析不断朝着高效、痕量、微观和自动化方向发展.
2常见的荧光分析法
2.1直接荧光分析法
直接荧光分析法适用于自身能产生荧光的药物.因荧光性质与溶液的pH值有关,故荧光强度的测定需在适宜的pH缓冲溶液中进行.对于成分复杂的生物供试品,为了防止干扰,有时需利用萃取、沉淀、色
y收稿日期:2005-03-20
基金项目:国家自然科学基金资助项目(20275028)
作者简介:潘祖亭(1945-),男,湖南省武汉市人,武汉大学化学与分子科学学院教授,主要从事分子光谱研究.
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谱分离等方法除去干扰物,以降低荧光空白本底,提高分析灵敏度.已用于直接荧光分析法的药物有盐酸洛哌丁胺、双水杨酯、左旋溶肉瘤素、叶酸等[41-44].
2.2胶束增敏荧光分析法
胶束增敏荧光分析法是在胶束溶液中进行的荧光分析法.胶束溶液对极性较小的弱荧光物质有增溶作用,对荧光物质的荧光发射有增敏增稳作用;因此,对某些不发荧光或荧光很弱的药物无法进行直接荧光分析法测定时,可通过加入某些增溶增敏试剂来增强药物的荧光,提高药物分析的灵敏度,如加入CT-MAB,SDS,CPB,PVA,TritonX-100,B ri-j35等表面活性剂及环糊精(A-C D,B-CD,C-CD).由于主客体分子的结构特征,以及温度、表面电荷及其它分子和离子等所形成的微环境,有利于形成胶束,胶束的存在,大大降低了荧光分子的非辐射过程速率,而辐射速率常数改变不大;因此,量子效率增加,激发光寿命增长,客体分子穿入、吸附和包络于胶束内外,使其行动受到限制,客体分子有效吸光面积、摩尔吸光系数增加,其激发态也不易被溶液中的荧光熄灭体碰撞而获得保护,从而荧光增强[45].马红燕等[46]用胶束增敏荧光光度法对土霉素的测定作了研究.梁丽华等[47]用胶束增敏荧光法测定吡哌酸的含量.潘祖亭等利用表面活性剂、B-CD对药物荧光进行增敏作用,研究了左炔诺孕酮[48]、醋酸甲萘氢醌[49]、盐酸芦氟沙星[50]、醋酸泼尼松龙[51]、双嘧达莫[52]、吲哚美辛[53]等的荧光光谱.刘秀萍等[54]用竞争荧光包合法研究了维生素B6、B-环糊精及其衍生物的包合性能.
2.3化学引导荧光分析法
化学引导荧光分析法是利用化学反应(氧化还原反应、络合反应、光化反应、化学衍生、颜色反应等)改变药物的荧光特性,使药物产生荧光或提高其荧光强度.潘祖亭等利用浓硫酸与无荧光药物作用后产生有荧光的物质研究了醋酸甲地孕酮[55]、丙酸睾酮[56].Gonzalez-Barreiro C等[57]用高效液相色谱分离、光化学诱导荧光检测了一些废水中的中性和酸性药物.A-l Majed A A等[58]利用药物净他敏与混合酸酐反应产生的强荧光对药剂和人体血浆中净他敏进行了荧光分析,检出限约1.5@10-10mol P L.Hefnawy M等[59]利用荧光胺与药物反应对头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢氨苄和头孢握定进行了分析测定.
2.4荧光探针分析法
以稀土离子、荧光分子等和药物作用的荧光探针技术,大大拓宽了荧光分析法在药物分析中的应用范围,显著提高了荧光分析的灵敏度和选择性.对荧光探针研究已有综述[60].凌连生等[61]综述了脱氧核糖核酸(DNA)荧光探针的研究进展.林章碧等[62]综述了以纳米粒子作为荧光探针在生物分析中的应用.王磊等[63]以铽离子作为荧光探针测定了尿样中痕量的环丙氟哌酸.赵长春等[64]研究了小蘖碱的特殊的荧光性质.王敏等[65]用荧光探针分析法研究了缩氨基硫脲类钯抗癌配合物的初步筛选与作用机理.
2.5荧光猝灭分析法
对有些药物可利用其对某一特定体系的荧光猝灭作用而进行定量测定.庞志功等[66]利用苦参碱和氧化苦参碱对荧光试剂乙酸乙烯酯的定量猝灭作用,建立了测定苦参碱和氧化苦参碱的荧光分析方法.杜黎明等[67]研究了氯苯胺酸与洛美沙星、环丙沙星、诺氟沙星发生的荷移反应,并对这4种药物进行了定量分析.此外,荧光猝灭法还用于分析羟基苯丙酮酸[68]、甲硝唑[69]等药物的含量.
2.6几种新型荧光分析技术
2.6.1导数荧光分析法导数荧光分析的特点是,以荧光强度对波长的导数d F P d K代替荧光强度F为纵坐标记录荧光发射光谱,此光谱称为一阶导数荧光光谱.若以d2F P d2K代替F记录荧光发射光谱,则称为二阶导数荧光光谱,依此可得到其他高阶导数荧光光谱.利用导数荧光光谱法进行物质测定的方法称为导数荧光分析.导数荧光分析可以提高光谱精细结构的分辨能力,减小光谱干扰;所以,导数荧光分析的抗干扰能力强,应用于多组分混合物分析可不经分离而直接进行荧光测定.该方法已用于维生素B[70]、氧氟沙星对映体[71]、环丙沙星[72]等药物的定量测定.
2.6.2同步荧光分析法当一些化合物的激发波长和发射波长存在比较大的差距时,应用同步荧光技术能有效降低散射峰的干扰.同时,对激发和发射光谱同步扫描,对描出的图谱进行微分处理,使重叠的峰彼此分离,可得到较可靠的测量结果.同步荧光分析法与导数荧光分析法联用能取得较高的灵敏度,如用同步-导数荧光光谱法测定尿样中的痕量左氧氟沙星[73]和洛美沙星[74],检出限分别可达0.3,0.35mg P L.Jo-
se Antonio Murillo Pulgarin 等
[75]用可变角同步荧光法测定了几种荧光相近的混合药物.
2.7荧光联用技术在现代分析化学技术中,联用技术大大提高了分析检测的效率和效果,其中发展较快、使用较多的有色谱-荧光检测技术[76-79]和流动注射-荧光检测技术[80-83]
等.多种分析技术的联用,使分析方法的连续化、自动化、最优化和智能化特征成为药物分析学科发展的必然趋势.3 药物小分子与生物大分子的相互作用
3.1蛋白质与药物小分子的相互作用
研究小分子与生物大分子之间的相互作用,特别是具有生物活性的药物小分子与生物大分子的相互作用,有助于了解药物在体内的运输和分布情况,对阐明药物的作用机制、药代动力学及药物的毒副作用有重要意义.
药物从给药部位进入血液,其中一部分可能与血浆中的蛋白质(主要为白蛋白)发生可逆的结合,结合的部分称为结合型药物,未结合的部分称为游离型药物,当游离型药物浓度降低时,部分结合型药物解离为游离型,二者处于动态平衡.只有游离型药物可透过血壁分布到作用部位与受体发挥作用,绝大多数药物也只有游离型可被机体代谢和排泄.药物的这种与蛋白可逆型结合不仅影响其代谢动力学(作用强度与时间),而且往往与药物的相互作用、作用机理等密切相关,所以引起人们越来越多的注意和研究.
药物与蛋白质结合后能改变药物或蛋白质的吸收光谱性质,如吸收光谱的改变、吸收强度的改变、新吸收峰的出现等,都可以提供药物与蛋白质相互作用的信息.研究药物分子与受体之间的关系,也可为药物分子结构的改造及合成疗效更好、毒性更低的药物提供信息.
Yuri V Il .ichev 等[84]研究了赭曲霉素与人血清白蛋白的相互作用,以及相互作用的结合位点数、赭曲霉素和其他酸性化合物与蛋白质的竞争性结合.潘祖亭等应用荧光光谱法和紫外-可见吸收光谱法研究了双嘧达莫[85]、盐酸多西环素[86]、甲苯咪唑[87]等药物与牛血清白蛋白的结合反应,并根据F êster 理论模型计算出给体与受体间的结合距离和一些物理化学、热力学参数,为研究药物与蛋白质结合作用提供了借
鉴.Purcell M [88]研究了药物与人血清白蛋白之间的作用,得出它们之间的键合常数及键合位点数.Anna Su -
lkowska [89]研究了抗甲腺药物与人血清和牛血清白蛋白的结合情况.Ribou A C
[90]用荧光探针和荧光光谱技术研究了牛血清白蛋白和乙二胺四乙酸、钙离子对体系的影响.崔凤灵等
[91]用荧光光谱法研究了氨基硫
脲的衍生物与蛋白质结合的机理.
3.2核酸与药物小分子的相互作用DNA 和核糖核酸(RNA)是重要的遗传物质,也是某些药物作用的靶分子,研究NDA 和RNA 与小分子荧光探针及药物的相互作用有重要意义[92].
应用荧光光谱法和紫外-可见吸收光谱法研究药物与DNA 相互作用的主要依据是,药物与DNA 作a 静电作用 b 沟槽作用 c 嵌入作用图1 小分子与脱氧核糖核酸作用的3种模式
用后吸收光谱和荧光光谱发生了变化.但与蛋白质
不同的是,DNA 的吸收波长在260nm,而其荧光很
弱,直接利用荧光光谱法研究药物与DNA 的相互作
用受到一定的限制;因此,在用荧光光谱法研究药物
与DNA 相互作用时,一般要利用与之相互作用的药
物的自身荧光,或者利用荧光探针试剂与DNA 作用
后产生的荧光.
DNA 与小分子化合物的作用方式有3种(见图
1)[93].第1种是静电作用,此作用沿着DNA 双螺旋
结构的外壁,没有选择性,且受到溶液中离子强度的
影响较大;第2种是小分子与DNA 沟槽的相互作
用;第3种是嵌入作用.后2种作用方式具有选择29第3期 潘祖亭,等:荧光光谱法在药物分析中的应用
30吉首大学学报(自然科学版)第26卷
性,是该研究领域的重点.
核酸分子与小分子化合物作用的3种方式各有不同的特点,在紫外-可见吸收光谱和荧光光谱上表示出不同的光谱信息.
若药物本身有荧光,当与DNA发生某种形式的作用后,其荧光光谱发生了变化.阿霉素、柔红霉素、喜树碱等就是具有这种性质的药物,其作用模型可由Scatchard方程描述.当核酸上可与药物结合的结合点为同一类型且相互独立时,药物与DNA的结合过程可简单地用质量作用定律来描述:
K=r P[c(n-r)],r P c=K(n-r).(3)其中:K为结合常数;c为游离药物的物质的量浓度;r为每一个核苷酸上已结合的药物的分子个数;n为每个核苷酸上能结合的核苷酸的分子数.若以r P c对r作图,可得到一条直线,直线的斜率为K,截距为K n.根据实验数据作图,按所得的斜率和截距可计算出药物与DNA的稳定常数K及每个核苷酸可结合的药物的分子数.药物与DNA的作用方式可通过离子强度对结合常数K的影响情况来判断.若Na+浓度的增加对药物与DNA的作用影响较大,K和n均会发生变化,则药物与DNA的作用主要表现为静电力作用;若药物与DNA相互作用的结合常数不受Na+浓度影响,则药物与DNA的作用主要为嵌入作用.
若药物本身没有荧光,与DNA的作用可用溴化乙锭(EB)、噻唑橙二聚体、唑黄二聚体等荧光探针[94]来研究.EB是检测双链DNA的灵敏探针试剂.当向EB中加入DNA后,体系的吸光度降低,最大吸收峰红移,这是EB峰值的平面菲罗啉环嵌入DNA堆积的碱基对之间所致.当向EB-DNA体系中加入药物后,若EB的最大吸收峰值增加,且EB红移后的吸收峰是向原位(紫外)回复,则可证明药物的存在破坏了DNA 与EB之间的嵌入作用,EB又游离出来;如果作用不强,影响不大,就需借助其他方法作进一步判断.
核酸是当代新药发展的首选目标.李志良等[95]将荧光法用于抗癌药物的初步筛选.唐宏武等[96]根据吖啶橙可穿过完整的细胞膜并能用于细胞内DNA和RNA染色的特点,提出一种新的抗癌药物的筛选方法.GOPAL M等[97]利用紫外吸收光谱法、荧光光谱法研究了一种抗癌新药与DNA的作用.袁小英等[98]用荧光法研究了环丙沙星与小牛胸腺DNA的结合反应,并利用所测的结合常数研究了铜(ò)对环丙沙星和DNA相互作用的影响及其可能的机理.此外,如金属离子及其对药物与DNA作用的影响,顺铂类化合物、一些抗癌药物与DNA作用的研究也很引人注目[99-102].
4展望
随着药学学科的发展,人们对药物分析的要求越来越高,因此必须运用和发展更适当的分析方法来满足药物分析的要求.今后的发展方向是:探索并提出常规药物荧光分析新方法;与计算机技术紧密结合,研制出自动化程度高、获得和处理信息速度快的荧光分析仪器;发现和合成选择性优良的药物荧光试剂;与其他现代化分析仪器和方法联合使用,以更准确、更灵敏、更专一和更低检测限获得药物及药物与生物大分子相互作用的有关信息.
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Application of Fluorescence Spectrum in Pharmaceu tical Analysis
PAN Zu-ting,GUAN Hong-liang,YUAN Hua-ping,LI Wei,C HE N Guo
(College of Chemistry and Molecular Sciences,Wuhan University,Wuhan430072,China)
Abstract:This paper reviewed the progress of the fluorimetry in pharmaceutical analysis in recent years.The present situation of fluorescence spectrum for the reaction of medicine and biomacromolecules such as protein,nucleic acid was introduced in detail,including its mechanism.The future application is phar maceutical analysis was foreseen.
Key words:pharmaceutical analysis;fluorescence spectrum;protein;nucleic acid