细胞传代

细胞传代
细胞传代

贴壁细胞:弃去培养液,加胰酶消化,加培养液终止胰酶作用,吹打成悬液,分装传代。由于贴壁细胞贴壁生长,接触抑制,长满一瓶后贴壁较紧,不易取出。这时必须用胰蛋白酶或者胶原蛋白酶处理,使其分散开后取出,然后在放入新的培养瓶中培养。

悬浮细胞:离心,弃上清液,加新鲜培养基,分装传代。悬浮细胞其实也有贴壁现象,只是贴壁不牢。可以直接用吹打发是细胞掉落下来,进行传代。

传代培养中的细胞传代培养(subculture),当原代培养成功以后,随着培养时间的延长和细胞不断分裂,一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制,生长速度减慢甚至停止;另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分,重新接种到另外的培养器皿(瓶)内,再进行培养。这个过程就称为传代(passage)或者再培养(subculture)。对单层培养而言,80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。

传代方法

1.悬浮生长细胞传代

传代培养中的细胞

离心法传代:离心(1000转/分)去上清,沉淀物加新培养液后再混匀传代。

2.半悬浮生长细胞传代(Hela细胞)

此类细胞部分呈现贴壁生长现象,但贴壁不牢,可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来,进行传代。

3.贴壁生长细胞传代

采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。

培养材料

1、无菌磷酸生理缓冲液

(Dulbecco’sphosphate-bufferedsaline,Ca++/Mg++free,D-PBS,

GibcoBRL21600-010)

传代培养中的细胞

2、

trypsin-EDTAsolution(0.05%trypsin-0.53mMEDTA-4Na,GibcoBRL25300-062):以10ml分装于15ml无菌离心管中,保存于–20℃,使用前放在37℃水槽回温。

3、新鲜培养基

4、无菌吸管/离心管/培养瓶

编辑本段培养步骤

1、附着型胞(adherentcell)

(1)吸掉旧培养液。

传代培养中的细胞

(2)用D-PBS洗涤细胞一至二次。

(3)加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2),37℃作用数分钟,于倒立显微镜下观察,当细胞将要分离而呈现圆粒状时,吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA,则在trypsin-EDTA作用后,加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用,离心后再吸掉上清液。

(4)轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落,加入适量之新鲜培养基,以吸管上下吸放数次以打散细胞团块,混和均匀后,依稀释比例转移至新的培养瓶中,以正常培养条件培养。

2、悬浮型细胞(suspensioncell)

(1)吸出细胞培养液,放入离心管中,离心1000rpm5分钟。

(2)吸掉上清液,加入适量之新鲜培养基,混和均匀后,依稀释比例转移至新的培养瓶中,以正常培养条件培养。

3、融合瘤(hybridoma)

(1)有些hybridomacell需培养三天以上才会产生抗体,若是更换培养基,则可能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基,直接添加新鲜培养基稀释细胞浓度即可。若体积太大,可倾斜放置,或分殖至新培养瓶中。

编辑本段主要区别

原代培养:即第一次培养,是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养,中途不分割培养物的培养过程。有几方面含义:

1、培养物一经接种到培养器皿(瓶)中就不在分割,任其生长繁殖;

2、原代培养中的“代”并非细胞的“代”数,因为培养过程中细胞经多次分裂已经产生多代子细胞;

3、原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液,也不等于不更换培养器皿。

正常细胞培养的世代数有限,只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。目前世界上许多实验室所广泛传用的HeLa细胞系就是1951年从一位名叫

Henrietta Lacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成。此细胞系一直延用至今。原代培养是建立各种细胞系(株)必经的阶段,其是否成功与组织污染与否、供体年龄、培养技术和方法、适宜培养基的选择等多种因素有关。由于原代培养的细胞转化性极小,对病毒敏感性好,因此适应制备疫苗等生物制品;但也存在有潜在外源因子、不能事先检查标本、且受供体年龄健康状况的影响而导致批间差异大等缺陷。目前常用的原代细胞培养有鸡胚成纤维细胞及猪肾、猴肾、地鼠肾等原代细胞。

原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种、加培养液、置培养条件下培养等步骤,在所有的操作过程中,都必须保持培养物及生长环境的无菌。

多数情况下,分散的细胞若属于贴壁依赖型细胞,就能黏附、铺展于培养器皿和载体表面生长而形成细胞单层,这种培养方式称为单层细胞培养(monolayerculture),又叫贴壁培养(adherentculture)。少数情况下,培养的细胞没有贴壁依赖性,可通过专门设备使细胞始终处于悬状态而在体外生长,这种形式称为悬浮培养(suspensionculture)。如何让接种的细胞尽快贴壁,是决定培养成功的关键步骤:

1、取决于适当的生长基质表面;

2、可降低接种后培养液对细胞的浮力,如先少补加少量培养液,待细胞贴壁后再补足营养液继续培养;

3、注意适当的细胞接种密度,一般105个/ml左右。

传代培养:当原代培养成功以后,随着培养时间的延长和细胞不断分裂,一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制,生长速度减慢甚至停止;另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分,重新接种到另外的培养器皿(瓶)内,再进行培养。这个过程就称为传代(passage)或者再培养(subculture)。对单层培养而言,80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。

体外培养技术中所谓的传“代”概念并不等于细胞生物学中“亲代细胞”与“子代细胞”中“代”的概念。传代培养的实质就是分割后再一次培养,可以相对地衡量培养物的培养年龄。

实验原理

传代培养是组织培养常规保种方法之一。也

传代培养实验

是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶,细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行,每一步都需要认真仔细的无菌操作。

实验材料和器材

材料:培养瓶,试管,移液管,巴斯德吸管,废液缸,75%酒精棉球,酒精灯,培养细胞。

药品:培养基(RPMI1640或DMEM),小牛血清或胎牛血清,0.25%胰蛋白酶,Hanks液。

仪器:C02培养箱,倒置:显微镜,超净台。

实验步骤

1.人无菌室之前用肥皂洗手,用75%酒精擦拭消毒双手。

2.倒置显微镜下观察细胞形态,确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。

传代培养中的细胞

3.超净台台面应整洁,用0.1%新洁尔灭溶液擦净。

4.打开超净台的紫外灯照射台面20min左右,关闭超净台的紫外灯,打开抽风机清洁空气,除去臭氧。

5.点燃酒精灯;取出无菌试管,巴士德吸管和刻度吸管;安上橡皮头;过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。

6.将培养用液瓶口用75%酒精消毒,过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。

7.倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2—3mLHanks液洗去残留的旧培养基,或用少量胰酶涮洗一下。

8.每个大培养瓶加入1mL胰酶,小瓶用量酌减,盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察,当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶,使细胞脱离胰酶,然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液中。

9.加入少量的含血清的新鲜培养基,反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散,再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基(7~10mL/大瓶,3~5mL/小瓶)制成细胞悬液,然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖,适度拧紧后再稍回转,以利于CO2气体的进入,将培养瓶放回CO2培养箱。

10.对悬浮培养细胞,步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清,加入新鲜培养基,然后分装到各瓶中。

注意事项

1.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。

2.每天观察细胞形态,掌握好细胞是否健康的标准:健康细胞的形态饱满,折光性好,生长致密时即可传代。

3.如发现细胞有污染迹象,应立即采取措施,一般应弃置污染的细胞,如果必须挽救,可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗,随后培养基中加入较大量的抗菌素,并经常更换培养基等

细胞传代培养

一、原理

细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。

传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以,而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

二、材料和试剂

1、细胞:贴壁细胞株

2、试剂:0.25%胰酶、1640培养基(含10%小牛血清)

3、仪器和器材:倒置显微镜,培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等

三、操作步骤

1、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。

2、加入0.5—1ml 0.25%胰酶溶液,使瓶底细胞都浸入溶液中。

3、瓶口塞好橡皮塞,放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移,原贴壁的细胞逐渐趋于圆形,在还未漂起时将胰酶弃去,加入10ml培养液终止消化。

观察消化也可以用肉眼,当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1—3分钟。

4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液,分到另外两到三瓶中,实践培养液塞好橡皮塞,置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。

附:消化液配制方法:

称取0.25克胰酶蛋白酶(活力为1:250),加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s 液溶解,滤器过滤除菌,4℃保存,用前可在37℃下回温。

胰酶溶液中也可加入EDTA,使最终浓度达0.02%。

编辑本段培养细胞

在口腔医学领域,尽管人们已经能够重新构建牙冠结构,然而重新构建结构复杂的牙根始终是不少科研人员的终极梦想。第四军医大学口腔医院文玲英教授等在一项国家自然科学基金资助课题中,培养出了纯化的牙囊细胞,尽管这离重新构建牙根还有很长的距离,但毕竟又向前迈了一步。牙囊是牙胚的重要组成部分,随着牙齿的发育,由它分化的细胞形成牙骨质、牙周膜和部分牙槽骨,换句话说,由牙囊发育的组织结构主要负责将牙齿固定在牙槽骨上。另外在牙齿萌出的过程中,牙囊细胞还可能通过对一些细胞和因子进行调控,促进牙齿的顺利萌出。

牙囊细胞的重要功能吸引了研究者的目光,但要进行深入的研究就需要首先分离出纯化的牙囊细胞。早在上世纪90年代,国外就已经开展了分离牙囊的研

究,但由于牙囊与成釉器(上皮来源)“关系密切”,始终难以简便地获得纯化的牙囊细胞。

据研究人员刘晓辉介绍,牙囊细胞和成釉器分别来源于外胚间充质和口腔上皮,这两类细胞在培养时对培养皿具有不同的黏附能力,当使用胰酶消化时,黏附能力较差的牙囊细胞会首先掉下来,成釉器上皮细胞则要慢一些,这就是差速消化的概念。利用差速消化法,收集牙囊细胞并进行传代培养,就称为差速传代技术。经3~4次差速传代,最终就可以得到纯化的牙囊细胞了。

在研究过程中,他们选用大鼠第一和第二磨牙牙胚,剥离出牙囊和成釉器作混合培养,经3次差速传代后,成功地从第4代牙胚原代细胞中获得了纯化的牙囊细胞。经细胞形态学及免疫化学染色检测结果显示纯化率达100%,细胞生长状态良好,增殖旺盛。

细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏

细胞传代培养的原理及操作步骤 (一)原理:细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以,而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 (二)细胞传代培养具体操作 1、细胞:贴壁细胞株 2、操作步骤 1)将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25%胰酶溶液,使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞,放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移,原贴壁的细胞逐渐趋于圆形,在还未漂起时将胰酶弃去,加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼,当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液,分到另外两到三瓶中,实践培养液塞好橡皮塞,置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备:细胞室及工作台紫外线照射15min;培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用;收集对数生长期细胞,在冻存前一天最好换液 2.用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液,PBS清洗2遍吸出冲洗液,加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶,加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞,使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中,离心(1000r/min,10分钟)。 5. 去上清液,加入与细胞悬液等量的冻存液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16~18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。 7.记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒;培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管,立即放入37℃水槽中快速解冻,离心。 3.去上清,加入培养基,吹打,然后移入培养瓶中,用培养基清洗冻存管,清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基,放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期;次日换液。

细胞传代培养

细胞传代培养(胰蛋白酶消化法) 具体操作: 一. 传代前准备: 1.预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 2.用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 3.正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。 4.点燃酒精灯:注意火焰不能太小。 5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶,放入微波炉内高火,8分钟再次消毒。 6.取出预热好的培养用液:取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 7.从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。 8.打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。 二.胰蛋白酶消化; 1.加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以盖住细胞最好,最佳消化温度是37℃。 2. 显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。 3.吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液,注意更换吸管,加入新鲜的培养液。 三.吹打分散细胞: 1.吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 2.吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。 3.平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心6-8分钟。 4.弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 四.分装稀释细胞: 1.分装:将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。 2.显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量,必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。 五.继续培养: 用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为一个+,占50%为++,占75%时为+++。 传代细胞培养注意事项: 1.严格的无菌操作 2.适度消化:消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响,消化过程中应该注意培养细胞形态的变化,一旦胞质回缩,连接变松散,或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

细胞培养操作过程

一、试剂 1、培养基 新买的培养基可直接使用,使用前加FBS(胎牛血清)至10 %终浓度(250mL 培基中加入25mL血清)。 自配的培养基使用前需进行无菌检测。 配制过程: (1)取出两张0.22μm微孔滤膜(上海半岛公司生产),用超纯水淋洗后再浸泡其中数小时。 (2)将滤器与试剂瓶洗净烘干。 (3)取出浸泡好的滤膜,组装滤器,包扎纱布与牛皮纸,高温高压灭菌滤器与试剂瓶。 (4)完成灭菌,待冷却后取出滤器和试剂瓶转入超净台中,组装滤器,连接好恒流泵,紫外灭菌半小时。 (5)灭菌期间取一袋培养基粉末溶于约980-990 mL超纯水中(注意超纯水冲洗包装袋1-2次,防止粉末残余),按产品说明添加所需的药品,搅拌溶解(注意用保鲜膜封口)。 (6)pH计测培养液pH(pH计使用前需进行校准,同时清洗探头),用1 M HCL 或1 M NaOH将pH调整至合适的数值。 (7)培养液定容至1000 mL。 (8)将培养液转入灭菌好的超净台中,恒流泵以橡皮管连接培养液,玻璃钟罩拆开牛皮纸与纱布后过火并连接试剂瓶(瓶口注意过火)。 (9)打开恒流泵,调整橡皮管的培养液抽取方向,开始过滤。 (10)当滤器下方橡皮管中出现培养液时,以止血钳夹住橡皮管,将滤器上部的气阀旋松;待气阀处溢出培养液后,拧紧气阀,取下止血钳,开始过滤。(11)过滤开始和结束时分别取5 mL培养液转入小方瓶中,放入培养箱中检测(48 h),过滤好的培养液试剂瓶注明配制日期、培养基名称和配制者姓名,放入4 C冰箱中保存。 (12)取出恒流泵与滤器,将超净台清理干净,注意将滴撒有培养液的地方擦拭干净。 (13)拆开滤器,观察滤膜有无破损(若破损此次过滤作废,需重新过滤),清洗滤器。 (14)无菌检测合格后,方可添加血清使用。 2、胰酶 按配方(0.25 g胰酶粉末与0.03 g EDTA溶于100 mL超纯水,NaHCO3溶液调节pH至7.6-7.8)配制胰酶溶液后,在超净台中用0.22 μm针头过滤器过滤分

实验五 细胞的传代培养

实验5 细胞的传代培养 一、实验目的 熟练掌握动物细胞的传代培养法。 二、实验原理 哺乳动物细胞的传代培养是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶,细胞才能继续生长,这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。 三、仪器、材料与试剂 1仪器 CO2培养箱,倒置显微镜,超净台 2材料 培养瓶,试管,移液管,巴斯德吸管,废液缸,75%酒精棉球,酒精灯,细胞。 3试剂 完全培养基(RPMLl640或DMEM),0.25%胰蛋白酶,D-Hanks液。 四、实验步骤 1.入无菌室之前用肥皂洗手,用75%酒精擦拭消毒双手。 2.倒置显微镜下观察细胞形态,确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。 3.超净台台面应整洁,用75%酒精溶液擦净。 4.打开超净台的紫外灯照射台面20min左右,关闭超净台的紫外灯,打开抽风机清洁空气。 5.点燃酒精灯,取出无菌试管,刻度吸管;安上橡皮头;插在无菌试管内。 6.打开细胞培养瓶,过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。 7.倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3mL Hanks液洗去残留的旧培养基,或用少量胰酶涮洗一下。 8.加入胰酶消化液,盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察,当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶,使细胞脱离胰酶,然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液。

9.加入少量的新鲜培养基,反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散,再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基(7-10mL/大瓶,3-5mL/小瓶)制成细胞悬液,分装到新培养瓶中。盖上瓶盖,适度拧紧后再稍回转,以利于CO2气体的进入,将培养瓶放回CO2培养箱。 10.对悬浮培养细胞,步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清,加入新鲜培养基,然后分装到各瓶中。 五、注意事项 1.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。培养用液应严格分开。 2.每天观察细胞形态,掌握好细胞是否健康的标准:健康细胞的形态饱满,折光性好,生长致密时即可传代。 3.如发现细胞有污染迹象,应立即采取措施,一般应弃置污染的细胞,如果必须挽救,可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗,随后培养基中加入较大量的抗菌素,并经常更换培养基等。 六、实验报告 1.试述传代培养的步骤和注意事项,并指出哪些是关键步骤? 2.细胞传代培养的目的是什么?

干货 I 细胞复苏、冻存、传代之实验操作及注意事项

细胞培养之实验操作及注意事项|细胞复苏/冻存/传代 一、细胞培养前期准备工作 细胞培养仪器设备: ●细胞培养通风橱(即生物安全柜) ●培养箱(通用推荐:湿式二氧化碳培养箱) ●离心机 ●医用冰箱(4℃)和冰柜(-20℃)、生物超低温冰箱(-80℃)、液氮冷冻罐●倒置显微镜 其他用品:细胞培养容器(培养瓶、培养皿、多孔板等),吸管和移液器,培养基、血清和试剂 注意事项: ●无菌工作区域:细胞培养实验室的主要要求是需要维持细胞培养操作工作区 域处于无菌状态,最简单经济的方式就是使用细胞培养通风橱。 ●无菌试剂和培养基:商品化试剂和培养基经过严格的质量控制以确保无菌, 注意操作过程中不要被污染,其他试剂和溶液需要选择适当的灭菌方法(例如:高压蒸汽、无菌过滤等)进行灭菌。 ●无菌操作:要求操作人员在实验开始前对工作区域和双手操作部分进行75% 酒精消毒;尽量使用一次性塑料吸管进行单次操作,避免交叉污染;试剂瓶和培养用具使用时方可开盖,用后要第一时间盖上,暴露于环境中的时间尽可能要短。 ●整体的细胞实验环境也弥足重要,需要定期对实验室环境进行较为彻底的清

扫消毒和杀菌,包括实验用仪器和室内地面、桌面等。 二、细胞的复苏与冻存 细胞复苏: 在细胞状态不足以满足实验需求或者出现细胞污染的情况下,需要进行细胞复苏:a)从超低温冰箱或者液氮中取出自保存或商品化购买的冻存细胞后,快速转移 至37℃水浴条件下轻轻转动融化(一分钟内)。 b)75%酒精擦拭冻存管外部后,转移至通风橱中。 c)加入适量新鲜的完全培养基混合,约800-1000rpm下离心5-10分钟,实 际离心速度时间取决于细胞种类和细胞状态。 d)新鲜培养基重悬后接种于相应的培养器皿中,做好标记,37℃,5%CO2条 件下培养。 细胞冻存: 为现有细胞系做细胞储备,需要对代数相对靠前的细胞进行扩增培养和细胞冻存: a)准备细胞冻存液,置于2℃-8℃下备用。 b)观察待冻存的细胞,密度达到80%-90%左右,将贴壁/悬浮细胞分别按照传 代方法收集。 c)使用血球计数板对细胞密度进行大致估算后,计算出冻存溶液的体积,从而 保证单支冻存细胞有足够的细胞量用于复苏。 d)约800-1000rpm下离心5-10分钟,无菌条件下小心弃去培养基,不要搅 动细胞沉淀。 e)用合适体积的预冷后冻存液重新混悬细胞沉淀,分装至冻存管中,做好标记

原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项

初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器:培养箱(调整至37℃),培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱(37℃) 材料:动物组织块 试剂:1640培养基(含20%小牛血清),0.25%胰酶,Hank′s液,碘酒 初代消化培养法 1. 准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面,紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局:点燃酒精灯,安装吸管帽。 3. 处理组织:把组织块置于烧杯中,用Hanks液漂洗2~3次,去除血污;如怀疑组织可能污染,可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切:用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块,以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角烧瓶中,结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化:或用恒温水浴,或置于37℃温箱消化均可,消化中每隔20分钟应摇动一次,如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离:在消化过程中见消化液发混浊时,可用吸管吸出少许消化液在镜下观察,如组织已分散成细胞团或单个细胞,立即终止消化,随即通过适宜不锈钢筛,滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 (500~1000转/分)离心消化液5分钟,吸出上清,加入适量含有血清的培养液。 7. 计数:用计数板计数,如细胞悬液细胞密度过大,再补加培养液调整后,分装入培养瓶中。对大多数细胞来说,pH要求在7.2~7.4范围,培养液呈微红色,如颜色偏黄,说明液体变酸,可用NaHCO3调整。 8. 培养:置于36.5℃温箱培养,如用CO2温箱培养,瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞,纱布塞易生霉菌,每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切:把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中,用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污,吸静Hanks液,用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布:用弯头吸管吸取若干小块,置于培养瓶中,用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部,小块相互距离以0.5cm为宜,每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶,另瓶底向上,注意翻瓶时勿另组织小块流动,塞好瓶塞,置36.5℃温箱培养2小时左右(勿超过4小时),使小块微干涸。 4. 培养:从微箱中取出培养瓶,开塞,46度斜持培养瓶,箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许,然后缓缓再把培养瓶翻转过来,让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。

细胞传代实验报告

细胞传代培养 一.实验目的 初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程,为生物技术在医学上的 应用打下基础。 二、原理 从生物体中取出某种组织或细胞,模拟体内生理条件,在人工培养条件下使其生存、生 长、繁殖或传代,这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接 观察 活细胞,并在有控制的环境条件下进行实验,避免了体内实验时的许多复杂因素,还可 以与 体内实验互为补充,可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象,耗费少,比较 经济, 因此成为生物学研究的重要手段。 细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养 为 原代培养;当原代培养的细胞增殖达到一定密度后,则需要做再培养,即将培养的细胞 分散 后,从一个容器以1:2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养,为传代培养, 传 代培养的累积次数就是细胞的代数。 细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受 温度、渗透压、ph值、无机盐影响,消毒、配液等均有严格的规范和要求,特别是无菌 操 作是细胞培养成败的关键。 三、材料和试剂 1、细胞:293细胞株 2、试剂:0.25%胰酶、1640培养基(含10%小牛血清) 3、仪器和器材:倒置显微镜,培养箱、电动枪,培养板,吸液枪,5ml玻璃吸管、酒精 灯等 四、操作步骤 1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。 2、加入1~2ml 0.25%胰酶溶液,使板底细胞都浸入溶液中。 3、马上吸走胰酶液,再次加入2ml左右的胰酶,同样马上吸去,再加入几滴胰酶放入 培养箱中消化几分钟 4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液,再按照观察的生长情况确定的传代比例传代 5.根据确定的比例来取需要的量(剩余的细胞拿来做细胞计数),加入4ml左右的培养液 6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后,将培养板放入培养箱 7.收拾整理超净台 附:消化液配制方法: 称取2.5克胰酶蛋白酶,加入100ml10xpbs+纯水溶解到1l,滤器过滤除菌,4℃保存, 用前可在37℃下回温。 10x pbs配方:na2hpo4(14.2g) kh2po4(2.32g) nacl(80g) kcl(2.02g) (调至ph=7.4) 五、实验结果

细胞培养操作步骤

培养基的配置:基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置:DMS018ml+胎牛血清2ml。 依次比例酌量配置。 超净工作台常规配置 移液器1套(2.5小20 d、200 pl> 1ml),酒精灯1盏,液器1台,斜架1台, 酒精喷壶 1 个,酒精棉球缸 1 个,污缸 1 个, 常规耗材:培养瓶(50 cm 2),定量移液管(5ml、10ml),枪头(1ml、200小 10 d),培养皿,6/24/48/96孔板,医用脱脂棉球,保种管 所需试剂:gibco高糖培养基,胎牛血清,双抗,DMSO,胰酶,苯扎溴氨,75% 酒精…… 实验前准备: 所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内,用酒精喷壶喷洒实验台面,并关闭工作台打开紫外灯照射30min 后开始实验操作。 首次传代前细胞的复苏,首先用一大烧杯盛满37C的温水放于液氮罐旁边,待 细胞株取出后留上端1/3于37C水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若 种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。 实验步骤 一、原代细胞的培养 1. 紫外消毒30min 后关闭紫外灯,开启超净台正常工作状态,用酒精消毒操作者的 双手。 2. 将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内,点燃酒精灯,将培养基瓶口用酒 精棉球擦拭后,再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次,旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖,分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上,瓶口对准酒精灯,且放在距离酒精灯最近的位置,瓶盖置于酒精灯的另一侧。 3. 取1 个高压后的新培养瓶,瓶口在酒精灯上消毒2-3 次,旋开后分别再次消毒瓶 口和瓶盖2-3 次分别放于酒精灯两侧,把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3 后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边,取1ml 移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2 次,然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液,悬空移入培养瓶内。 4. 拿出1 支高压后的5ml 定量移液管,在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上, 再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3 次,悬空进入培养基瓶内吸取4ml 培养基再悬空移入培养瓶内,将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3 次后拧紧平放,在瓶身做好实验标记。 5. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3 次后拧紧,熄灭酒精灯,整理实验台面,取出实验试 剂及污缸等,关闭超净工作台。 6?将培养瓶放于28C,5%CO2的培养箱内培养,旋开瓶口少许。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水,且定期更换确保无菌。 在CO2培养箱内培养10-12h,瓶盖拧紧后拿出培养箱,置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况,及细胞形态。最后更换培养液。 、培养液的更换

组织细胞培养技术课程教学大纲

《组织细胞培养技术》课程教学大纲 课程编码:26990214 课程名称:组织细胞培养技术 英文名称:Cell and tissue culture technology 开课学期:第二学期 授课对象:统招硕士 开课院系:基础医学院 开课教研室:病理学与法医学教研室 学时:40 (其中理论学时:20 实验学时:20 ) 学分:0.5 课程类型:公共选修课(公共必修课/选修课/专业课) 选用教材:自编教材《组织细胞培养技术》 主要参考书:⑴鄂征主编. 组织培养和分子细胞学技术.北京:北京出版社,1994。⑵施新猷主编.实验动物学. 北京:人民军医出版社,2000。 大纲编写人员:张宏颖副教授 一、课程目的与任务 组织细胞培养技术是研究组织和细胞的技术方法,被培养的组织和细胞也是实验研究的对象。本课程是医学临床与基础专业硕士研究生的公共选修课程之一,在医学各专业高级人才培养中具有重要地位。本课程系统介绍了组织和细胞培养技术有关的概念、基本原理、操作程序和关键技术,及其在医学研究和临床实践中的应用,该领域的研究历史和最新发展动态;转基因动物技术的概念、研究进展、技术方法、建立方法、应用及前景展望。旨在提升医学专业硕士研究生的知识结构,掌握现代生物技术中的基本实验技能,培养学生开拓创新的能力,适应未来学科发展对人才的需求。 二、教学基本要求 本课程系统地论述了组织细胞培养技术的理论和方法,简要介绍了转基因动物技术及应用。要求学生全面系统地掌握组织细胞培养的操作过程,了解各种操作的基本原理;有判定细胞生长好坏和是否发生污染的能力;熟悉体外培养细胞的生存条件、细胞的生物学性状和与此有关的基本理论知识,了解国内外细胞培养的最新动态和研究进展,了解转基因动物技术的概念、研究进展、技术方法、建立方法、应用,并能自行根据需要设计实验,运用所学技术解决科研中的实际问题,提高学生综合分析问题,系统利用专业知识的综合素质。 三、各章节内容及学时分配 第一章组织培养技术的基本理论知识(4.5学时) 目的与要求 1、掌握组织培养基本概念;了解对组织培养的评价;熟悉对组织培养工作者的要求和工作方法。 2、了解体内外细胞的差异与分化;掌握培养细胞形态分类及培养细胞的大体形态;熟悉组织培养 细胞的生长和增殖过程。 3、熟悉培养细胞生存环境和条件。

细胞传代培养标准操作规程

细胞传代培养(消化法)标准操作规程 一、原理 细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以,而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 二、材料和试剂 1. 无菌磷酸生理缓冲液(PBS) 2. 胰酶-EDTA溶液(0.05%胰酶-0.53mM EDTA-4Na): 以10ml分装于15 ml无菌离心管中,保存于–20℃,使用前放在37℃水槽回温。 3. 新鲜培养基 4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 三、操作步骤 1. 传代前准备 (1)预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 (2)用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 (3)正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。 (4)点燃酒精灯:注意火焰不能太小。 (5)准备好将要使用的消毒后的空培养瓶。 (6)取出预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 (7)从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。 (8)打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。 2. 胰蛋白酶消化 (1)加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以盖住细胞最好,最佳消化温度是37℃。

(2)显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。 (3)吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液,注意更换吸管,加入新鲜的培养液。 3. 吹打分散细胞 (1)吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 (2)吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。 (3)平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心6-8 分钟。 (4)弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 4. 分装稀释细胞 (1)显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量,必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。 (2)分装:将细胞悬液吸出分装至2~3个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。(3)继续培养:用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。 5. 悬浮型细胞的传代 (1)吸出细胞培养液,放入离心管中,离心1000 rpm 5 分钟。 (2)吸掉上清液,加入适量之新鲜培养基,混和均匀后,依稀释比例转移至新的培养瓶中,以正常培养条件培养。 注意事项: 1.严格的无菌操作。 2.适度消化:消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响,消化过程中应该注意培养细胞形态的变化,一旦胞质回缩,连接变松散,或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

细胞传代培养标准操作规程

创作编号: GB8878185555334563BT9125XW 创作者:凤呜大王* 细胞传代培养(消化法)标准操作规程 一、原理 细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以,而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 二、材料和试剂 1. 无菌磷酸生理缓冲液(PBS) 2. 胰酶-EDTA溶液(0.05%胰酶-0.53mM EDTA-4Na): 以10ml分装于15 ml 无菌离心管中,保存于–20℃,使用前放在37℃水槽回温。 3. 新鲜培养基 4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 三、操作步骤 1. 传代前准备 (1)预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 (2)用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 (3)正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。 (4)点燃酒精灯:注意火焰不能太小。 (5)准备好将要使用的消毒后的空培养瓶。

(6)取出预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。(7)从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。 (8)打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。 2. 胰蛋白酶消化 (1)加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以盖住细胞最好,最佳消化温度是37℃。 (2)显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。 (3)吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液,注意更换吸管,加入新鲜的培养液。 3. 吹打分散细胞 (1)吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 (2)吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。 (3)平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心6-8分钟。 (4)弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 4. 分装稀释细胞 (1)显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量,必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。 (2)分装:将细胞悬液吸出分装至2~3个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。 (3)继续培养:用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。 5. 悬浮型细胞的传代 (1)吸出细胞培养液,放入离心管中,离心1000 rpm 5 分钟。

T细胞培养标准操作规程

百利药业生物药研发部 标准操作规程 题目:293T细胞传代培养操作规程 编号:SOP-M-e-003- 制定者:(签名)日期:年月日批准者:(签名)日期:年月日生效日期:年月日

题目:293T细胞培养操作规程 1 目的 293T细胞是常用于包装和扩增病毒载体的工具细胞,因此做好293T细胞的培养,为保证相关实验的正常进行提供必要条件。 2 适用范围本部门293T细胞培养 3 操作方法 将移液器和移液枪、15ml离心管、离心管架、75cm2新的细胞培养瓶放于生物安全柜中,按照生物安全柜的标准操作规程,将生物安全柜的紫外开启半小时。 将含10%胎牛血清和100U/ml双抗的DMEM及PBS放于37℃水浴锅中预热。 培养箱中取出,先用75% 3.2.1将已长到80%-90%的293T细胞培养瓶从37℃,5%的CO 2 的酒精喷洒于瓶表面,将细胞培养瓶旋转放于生物安全柜中,用无菌的移液管吸净其中的培养基,加5ml的预热的PBS洗涤一次,吸净PBS。 3.2.2将含%tyption用PBS稀释两陪到五倍,向该75cm2的细胞瓶中加入3ml稀释好的%tyption,让其充分平铺于细胞表面。盖好瓶盖,将细胞瓶放在显微镜下观察,直到细胞变圆,加含10%胎牛血清的DMEM终止反应,用移液管轻轻将瓶上的细胞吹下,将细胞液移到15ml无菌的离心管中,1000rpm离心3分钟。 3.2.3将离心上清吸弃掉,用手指轻轻拍打离心管底将底部细胞分散开,再加3mlDMEM 培养基将分散的细胞重悬稀释开,取一定量的细胞液进行n倍稀释后计数,按照细胞计数标准操作规程进行。 3.2.4计数好之后细胞传代密度按照2~5×104个细胞/cm2进行传代培养,每个75cm2的 培养箱中培养。 培养瓶中加10mlDMEM培养基,放于37℃,5%的CO 2 3.2.5 24小时后观察细胞状态,待细胞长到80%-90%时进行下一次传代培养。

常规细胞培养方法(原代培养和传代培养)

原代上皮细胞与原代成纤维细胞培养的分离纯化 2010-12-02 10:29 来源:PriCells 点击次数:335 关键词:上皮细胞成纤维细胞培养分离纯化 分享到:收藏夹腾讯微博新浪微博开心网 PriCells- 原代上皮细胞与原代成纤维细胞培养的分离纯化 原代细胞、传代细胞绝大多数都呈混合生长,既有上皮样细胞又有纤维样细胞,纤维样细胞又包括成纤维细胞、肌细胞、骨细胞、滑膜细胞等。混杂的细胞会直接影响实验结果。 在体外培养原代细胞时,为了保证实验结果的可靠性、一致性、稳定性、和可重复性,要求采用单一种类细胞来进行实验,这样才能对某一细胞的功能、形态等变化进行一系列研究,因而培养细胞的纯化就成为实验研究的重要一步,甚至需要从混杂的细胞群中分离出单个细胞来进行培养和开展实验研究。 一、原代细胞增殖优势纯化方法:

自然纯化是利用某一种类细胞的增殖优势,在长期传代过程中靠自然淘汰法,不断排挤其他生长慢的细胞,靠自然增殖的潜力,最后留下生长优势旺盛的细胞,达到细胞纯化的目的。但这种方法常无法按照需要和实验要求及研究目的来选择细胞。此法花费时间长,留下的往往是成纤维细胞。仅有那些恶变的肿瘤细胞或突变的细胞可以通过此方法而保留下来的,不断纯化而建立细胞系。 二、原代细胞常用纯化方法: 人工纯化是利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件,抑制其他细胞的生长从而达到纯化细胞的目的。 1 、细胞时间差酶消化法: 酶消化法是比较常用的纯化方法,不仅对贴壁细胞可行,能利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同,是两者分开,达到纯化的目的;另外对贴壁细胞与半贴壁细胞及黏附细胞间的分离纯化也是十分有效的。

组织细胞培养

组织细胞培养概述 组织细胞培养一般泛指所有的体外培养,包括组织培养、细胞培养和器官培养。其中,组织培养(Tissue Culture)指从活体内取出组织,模拟体内生理环境,在体外无菌、适当温度和一定培养条件下,使之生存和生长,并维持其结构和功能的方法。细胞培养(Cell Culture)则是指离散细胞的培养,这些细胞通过酶学的、机械的或化学方法从来源组织中获得,培养物是单个细胞或细胞群。器官培养(Organ Culture)是指以器官的原基、器官的一部分或整个器官为培养物,应用与组织培养相似的条件,使培养物保持着体内组织部分或全部组织学特征,在体外生存、生长并保持一定的功能。组织培养与细胞培养并无严格区别,组织培养可出现细胞单一化现象,即趋向变成单一类型细胞,最终也变成了细胞培养。细胞在培养过程中的生命活动是互相依存的,呈现着一定的“组织”特性。 (一)体外培养方式的分类 体外培养可分为原代培养和传代培养。原代培养,又称初代培养(Primary Culture),即对从生物体内取出的细胞、组织和器官进行实效培养的过程,这样的细胞称为原代细胞,通常只能培养10-50代左右即退化死亡。传代培养(Passage Culture),是指无论是否稀释,将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶。原代培养物经首次传代成功后即为细胞系(Cell Line)。如细胞系的生存期有限,则称之为有限细胞系(Finite Cell Line),而已获无限繁殖能力能够持续生存的细胞系,称连续细胞系或无限细胞系(Infinite Cell Line)。由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系,称该细胞的亚系(Subline)。 (二)体外培养细胞的分型 根据离体细胞在培养皿中生长时是否贴壁,可将体外培养细胞分为贴壁型和悬浮型两类。 1.贴壁型细胞:培养细胞需贴附在支持物上生长,大多数细胞属于此型,也称锚着依赖性细胞(anchorage-dependent cells)。细胞贴壁后,分化现象常变的不显著,易失去原有组织特征,形态上表现单一化。主要包括①上皮细胞

《细胞实验》02 原代细胞培养和传代培养的方法

原代细胞培养和传代培养的方法 原代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器:培养箱(调整至37℃),培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱(37℃) 材料:动物组织块 试剂:1640培养基(含20%小牛血清),0.25%胰酶,Hank′s液,碘酒 初代消化培养法 1. 准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面,紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局:点燃酒精灯,安装吸管帽。 3. 处理组织:把组织块置于烧杯中,用Hanks液漂洗2~3次,去除血污;如怀疑组织可能污染,可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切:用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块,以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角烧瓶中,结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化:或用恒温水浴,或置于37℃温箱消化均可,消化中每隔20分钟应摇动一次,如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离:在消化过程中见消化液发混浊时,可用吸管吸出少许消化液在镜下观察,如组织

已分散成细胞团或单个细胞,立即终止消化,随即通过适宜不锈钢筛,滤掉尚未充分消化开的组织块。低速(500~1000转/分)离心消化液5分钟,吸出上清,加入适量含有血清的培养液。 7. 计数:用计数板计数,如细胞悬液细胞密度过大,再补加培养液调整后,分装入培养瓶中。对大多数细胞来说,pH要求在7.2~7.4范围,培养液呈微红色,如颜色偏黄,说明液体变酸,可用NaHCO3调整。 8. 培养:置于36.5℃温箱培养,如用CO2温箱培养,瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞,纱布塞易生霉菌,每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切:把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中,用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污,吸静Hanks液,用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布:用弯头吸管吸取若干小块,置于培养瓶中,用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部,小块相互距离以0.5cm为宜,每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶,另瓶底向上,注意翻瓶时勿另组织小块流动,塞好瓶塞,置36.5℃温箱培养2小时左右(勿超过4小时),使小块微干涸。 4. 培养:从微箱中取出培养瓶,开塞,46度斜持培养瓶,箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许,然后缓缓再把培养瓶翻转过来,让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。 传代培养法 原理 细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时 也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。传代培养也是一种将细胞种保存下去

BHK-21传代细胞培养

BHK-21传代细胞培养 BHK是仓鼠肾细胞 [原理] 细胞在培养瓶壁上长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。 [材料和试剂] 1、细胞:贴壁BHK-21细胞株 2、试剂:0.25%胰蛋白酶、配制好的DMEM培养液、小牛血清、双抗溶液、7.5%碳酸氢钠 3、仪器和器材:倒置显微镜,培养箱、培养瓶、胶塞、量筒、注射器、针头、酒精灯、污物缸等 [操作步骤] 1、应需要计算好培养液的总用量,按10%的比例加入血清,按1%的比例加入双抗。用7.5% 的碳酸氢钠调PH至7.0~7.2左右。 2、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 3、加入0.25%胰酶溶液,使瓶底细胞都浸入溶液中为宜。 4、瓶口塞好胶塞,平放在实验台上。约2~3分钟会看到贴壁细胞层出现细针孔空隙,赶紧 将胰酶弃去,加入少量培养液终止消化。 5、用注射器将贴壁的细胞反复吹打,使其均匀分散成悬液,再加入足量的培养液,分成两 到三瓶。塞好胶塞,置37℃温箱中继续培养。 细胞培养常用溶液的配制 一、青、链霉素溶液 青霉素钠盐(80万IU/瓶) 5瓶 链霉素(100万IU/瓶) 4瓶 将两者溶于400ml0.9%的无菌生理盐水,分装小瓶,-20℃保存。双抗在培养基中

的终浓度为100IU/ml为宜。 二、7.5%碳酸氢钠溶液的配制 称取碳酸氢钠7.5g,加入超纯水使总体积为100ml。高压灭菌,分装于小瓶中,4℃贮存。 三、1%酚红溶液的配制 首先配制1mol/L的NaOH溶液。称取NaOH4.0g,加入100ml超纯水,使NaOH 完全溶解,在室温或4℃贮存(最好现用现配)。配制好NaOH溶液后,再称取1.0 g 酚红置研钵中,加1mol/L的NaOH(不多于7.0ml),研磨使酚红完全溶解,加超纯水至100ml,高压消毒,在室温或4℃贮存。 四、0.25%胰蛋白酶溶液的配制 氯化钠8.0g 氯化钾0.2g 柠檬酸钠(Na3C6H5O7?5H2O) 1.12g 磷酸二氢钠(NaH2PO4?2H2O) 0.056g 碳酸氢钠 1.0g 葡萄糖 1.0g 胰蛋白酶(1:250) 2.5g 超纯水加至1000ml 放4℃冰箱过夜,待胰蛋白酶充分溶解后,用0.2um微孔滤膜过滤除菌,分装于小瓶中,-20℃保存。 四、GIBCO的低糖DMEM粉剂配制: 1.将干粉培养基倒入一干净的大容器内,先加入约终体积一半的超纯水;用水洗包装袋面 2次,倒入培养液中,以保证所有干粉都溶解成培养液。磁力搅拌或人工搅拌使之完全溶解。 2.根据包装袋上的说明补加所需量的丙酮酸钠、谷氨酰胺。 3.加水定容到终体积。 4. 用无菌0.2um滤膜过滤除菌,分装于无菌血清瓶中,4℃冰箱保存。同时将少量滤液装 到无菌瓶或接种细菌培养基,37℃培养,48小时以后检查有无细菌生长。

原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项

原代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器:培养箱(调整至37℃),培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱(37℃)材料:动物组织块 试剂:1640培养基(含20%小牛血清),0.25%胰酶,Hank′s液,碘酒 原代消化培养法 1. 准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面,紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局:点燃酒精灯,安装吸管帽。 3. 处理组织:把组织块置于烧杯中,用Hanks液漂洗2~3次,去除血污;如怀疑组织可能污染,可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切:用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块,以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角烧瓶中,结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化:或用恒温水浴,或置于37℃温箱消化均可,消化中每隔20分钟应摇动一次,如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离:在消化过程中见消化液发混浊时,可用吸管吸出少许消化液在镜下观察,如组织已分散成细胞团或单个细胞,立即终止消化,随即通过适宜不锈钢筛,滤掉尚未充分消化开的组织块。低速(500~1000转/分)离心消化液5分钟,吸出上清,加入适量含有血清的培养液。 7. 计数:用计数板计数,如细胞悬液细胞密度过大,再补加培养液调整后,分装入培养瓶中。对大多数细胞来说,pH要求在7.2~7.4范围,培养液呈微红色,如颜色偏黄,说明液体变酸,可用NaHCO3调整。 8. 培养:置于36.5℃温箱培养,如用CO2温箱培养,瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞,纱布塞易生霉菌,每次换液时需要换新塞。 原代组织块培养法 1. 剪切:把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中,用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污,吸静Hanks液,用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布:用弯头吸管吸取若干小块,置于培养瓶中,用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部,小块相互距离以0.5cm为宜,每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。

Hela细胞传代培养

Hela细胞传代培养

Hela细胞传代培养 实验目的:掌握动物细胞培养的基本原理和方法。 实验用具:每组用具(移液枪一把,一盒枪头,长吸管一包(4-6根),培养瓶1个【4-8人为一组,看细胞数量来定,传代比例1;2最多1:3】。 实验药品:0.25%胰酶,D-Hanks,1640培养基 实验原理: HeLa 是Henrietta Lacks的简称,Henrietta Lacks 是一位患有子宫颈癌的美国妇女的名字,在她死后,该细胞走被广泛散发到各研究机构,并无限次地繁殖分裂下去。 实验前的准备: RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素各100单位/毫升加三蒸水至 1000ml, 过滤除菌。调节pH值至7.2临用前加血清(终浓度 10%) 消化液的配置:

胰蛋白酶是一种黄白色粉末,用灭菌的D-hanks配置。配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25%。用滤器过滤除菌 D-hanks配方: 氯化钠 8.0g 氯化钾 0.4g 磷酸氢二钠(Na2 HPO ·7H2 O) 0.06g 磷酸二氢钾0.06g NaHCO3 0.35 g EDTA二钠 0.2 g 酚红 0.02 g 三蒸水定容到1000毫升。PH调整到8.0。 血清的准备与添加 ●优质血清的标准:透明,淡黄色,无沉淀 物,无细菌、支原体、病毒污染。 ●血清的灭活(消除补体活性):56 ℃水 浴,30 分钟 培养用具的准备: 所用器具高压灭菌,D-hanks缓冲液。 酶液,培养液。 实验步骤:

1.打开超净台,把实验中所需用具放到超净台上。 2.从冰箱中取出0.25%胰酶、培养基。可以把胰酶和培养基的瓶盖拧松备用。 3.取待传代的细胞,倒掉旧的培养基,移液枪加入胰酶2ml(加入的量以覆盖整个细胞培养面为宜)。轻轻摇动 4. 1-2分钟后迅速将消化液倒掉。 注意:此步消化时间需要根据每次培养的细胞不同状态灵活掌握,没有固定时间。消化时间长短是实验成败的关键,宁可短消化,不能过消化。否则细胞会变死。在倒置显微镜下观察,当细胞质回缩,胞间间隙加大为消化适宜。 5.取培养基5 ml加入培养瓶终止消化,轻轻摇动,如果瓶壁依然有细胞未脱落,用长吸管反复轻轻吹打培养瓶壁,制备细胞细胞悬液。吹打的部位均匀,从上到小,从左到右,顺序进行吹打,保证各个部位的培养细胞均能吹打到,成片的细胞已经分散成小的细胞团或者单细胞便停止吹打。吹打时用力不要过猛,尽量不要出现气泡,以免损伤细胞。 6.至所有细胞从培养瓶壁脱落下来,轻轻摇匀,

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