Topic 20Should We Celebrate Western Festivals

Topic 20Should We Celebrate Western Festivals
Topic 20Should We Celebrate Western Festivals

Topic 20 Should We Celebrate Western Festivals?

With the booming of the globalization and the increase of the

inter-cultural communications, a lot of Western cultural phenomena can be seen in China, among which there is the popularity of the Western festi vals like Christmas, April Fool’s Days and Valentine’s Day and so on. The staunch lovers of these festivals are young people such as the high school and college students.

Attitudes toward the Western festivals are among the general public. Some people say that we should keep away from them and just leave them there. Other people contend that we need to be open-minded to the foreign festivals and learn some Western culture from them. As far as I am concerned, we should value our traditional festivals, which have been an integral part of the Chinese culture, and meanwhile, we can have a taste of the Western festivals just for fun. There are several reasons.

First of all, the traditional festivals have been the particular icons of Chinese culture. We have a lot of festivals such as Spring Festival, Lantern Festival, Dragon Boat Festival and so on. They are the most precious intangible cultural heritage that we have carried down from our ancestors. We, as a new generation in China, should shoulder the responsibility of protecting and rejuvenating them so that our offspring can enjoy and learn them in the long future. As we all know, the government also attaches importance to the traditional festivals. People in China will have a day off when a traditional festival comes.

Secondly, the traditional festivals are offering us the most important occasions or family reunion and the expansion of social connections. As is mentioned before, people do not have to go to work when they have the traditional festivals. As a result, they can go home and have a family party. They can fully enjoy the domestic bliss thanks to the traditional festivals.

What is more, the traditional festivals provide lucrative opportunities for the travel industry. People like to do traveling when they have some holidays. The economy also benefits from the traditional festivals.

Finally, a lot of foreigners are fascinated with our traditional festivals.

I think this is conducive to cross-cultural communication. We do not have to ward off the western festivals as if they were threats. We can enjoy our own culture and have a taste of the western festivals so that we can improve our strength.

To sum up, the world is getting smaller and smaller. We should protect our culture on the one hand and on the other hand, we can also celebrate the western festivals for the sake of cross-cultural communication.

westernblot详细图解

Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以

检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂:见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液:1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml;10%SDS 6.0 ml;β-巯基乙醇0.2 ml;ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液:甘氨酸2.9 g;Tris 5.8 g;SDS 0.37 g;甲醇200 ml;加ddH2O定容至1000 ml。

WB实验步骤

Western blotting实验步骤 1.蛋白质的样品制备: 取心肌组织50mg,待组织块自行溶解,用滤纸吸去其表面水分,将组织块放入玻璃匀浆器球状部位,用组织剪尽量将其剪碎,将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部,按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF(先加RIPA再加PMSF),将玻璃匀浆器插入冰中,匀浆约30分钟。 将心肌组织匀浆转移到离心管中,4℃12000g离心5分钟,收集上清(如有粘稠物进一步用超声处理),样品分装冻存于-20℃备用。 2 .测定蛋白浓度: 2.1 按50:1配置BCA工作液。 2.2 10ulC液(蛋白标准)+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。 2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中,在其他样品孔中加入10ul待测样品。 2.4 分别加PBS定容至20ul。 2.5 各孔中加入200ulBCA工作液,室温放置2小时。 2.6 用酶标仪测定蛋白浓度:测定A562,依标准曲线算出蛋白浓度。 3 SDS-PAGE电泳: 3.1 制胶: 按比例配制分离胶,缓缓地摇动溶液,使激活剂混合均匀,将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中,再在液面上小心注入一层水,以阻止氧气进入凝胶溶液中,静置40min。同前按比例配制浓缩胶,但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分,连续

平稳的注入凝胶溶液,然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡,静制60min以上以保证完全聚合。 3.2 预电泳:将聚合好的凝胶安置于电泳槽中,小心拔去梳子,加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。(目的是清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通)。 3.3 样品准备:首先计算上样体积,然后按样品:上样buffer=4:1的比例加入上样bufer混匀,沸水煮10分钟,冰上5分钟。 3.4 加样:预电泳后依次加入标准品(Marker)和待分析样品。(加样时间要尽量短,以免样品扩散,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。 3.5 电泳:加样完毕,选择80V恒压进行电泳,电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处(一般约20分钟),更换至100V恒压电泳,电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处,即停止电泳(一般约为1小时20分钟)。 4.转膜: 4.1 切胶:将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中,将目的蛋白所在区域切下来,测量其长宽,并记录。 4.2 剪膜和滤纸:按胶的尺寸剪膜和滤纸(滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm,PVDF 膜长宽较凝胶大0.5~1mm),滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟,膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟,然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟,进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。 4.3 向电转槽中倒入部分电转液,将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”(注意避免两边滤纸相互接触,以免发生短路)。从正极到负极按如下顺序排列:

westernblot原理及步骤

westernblot原理及步骤 1.western blot 即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上,然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术,现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 2.原理 简单来说就是原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息 3.步骤 (一)蛋白样品制备 培养的细胞(定性) 1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍(冷的PBS有可能使细胞脱落)。 2.对于6孔板来说每孔加200~300uL,60~80℃的1×loading buffer。 3.刮下的细胞在EP管中煮沸10min,期间vortex 2~3次。 4.用干净的针尖挑丝,将团块弃掉,如果没有团块但有拉丝现象,可将EP管置于0℃后在 5.14000~16000g离心2min,再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠,可使用1ml注射器反 6.复抽吸来降低溶液粘滞度,便于上样。 7.待样品恢复到室温后上样。 培养的细胞(定量) 1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍(冷的PBS有可能使细胞脱落)。

2.加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。 3.刮下的细胞收集在EP管后超声(100~200w)3s,2次。 4.12000g离心,4℃,2min。 5.取少量上清进行定量。 6.将所有蛋白样品调至等浓度,充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好,剩余溶液(溶于1×loading buffer)可以低温储存,-70℃一个月,-20℃一周,4℃1~2天,每次上样前98℃,3min。 (二)SDS-PAGE电泳 (1)清洗玻璃板 (2)灌胶与上样 (3)电泳 (三)转膜 (四)免疫反应 (五)化学发光,显影,定影 (六)凝胶图象分析将胶片进行扫描或拍照,用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

westernblot实验详细步骤(1)

Western Blot实验技术一、制胶 SDS-PAGE分离胶配方表 1、检查制胶器是否漏水,吸干玻璃中水分

2、配置分离胶,加入玻璃板中(注意:不能有气泡和杂物),距离玻璃上口1.5mL停止加胶。 3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡,凝胶后倒掉水,吸干水到浓缩胶插梳。 二、上样 1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。 2、拔梳子时垂直向上拔出,不可左右摇晃梳子。 3、拔完梳子后观察梳子孔,是否有缺口和歪,用针头拨正。 4、上样时从左到右依次上样。 5、若上样组不多时,左右第一孔不加样。 6、要预留Marker的上样孔。 三、电泳 四、转膜

PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride)是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的,膜孔径有大有小,随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 (转膜缓冲液:需4度预冷,现配现用,不能放太久。) 1、转印滤纸:全胶长8.5cm,宽5.5cm,需剪裁成7层滤纸,压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 2、海绵垫:在转膜液中平衡浸泡备用。 3、PVDF膜:剪裁8.5cm*5.5cm ,需在甲醇中浸润2min(活化膜上正电基团),然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 4、凝胶:凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3-5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩,导致出现转移的条带变形。 三明治夹心法:负极(黑)-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极(白) 转膜时间:通电恒流,60V,一个槽100mA左右,1h

(注意:在操作过程中用玻棒赶走气泡。 装置转膜仪时注意黑对黑(负对负),白对红(正对正)。 装置运行时需冰浴。) 五、封闭 在进行抗体杂交之前,需要先对转印膜进行封闭,以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。 封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂,本实验室常用的有5%BSA,10%脱脂奶等,至于选择哪一类封闭液,首先应考虑与检测目的相适应(做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭)。 1、将脱脂奶粉封闭液(1xTBST:脱脂奶粉=20mL:2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA 效果更好)倒好。 2、将PVDF膜取出放入封闭液中,盖子改好。 3、封膜一般常温1-2小时即可,也可4℃封闭过夜。 六、一抗 抗体反应主要采用间接法: 即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后,再加入标记的二抗进行杂交检测,标记二

Western Blot常见问题及处理总结

免疫细胞研究western blot Western Blot常见问题及处理总结 阿木 1、western blot 的优点 答:灵敏,可达ng级,用Ecl显色法理论上可达pg 级。方便,特异性高。 2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋 白? 答:原因有很多: a) 你的细胞中不表达这种蛋白质,换一种细胞;b) 你的细胞中的蛋白质被降解掉了,你必需加入PMSF,抑制蛋白酶活性;c) 你的抗体不能识别目标蛋白,多看看说明,看是否有问题。 3、我的细胞提取液有的有沉淀,有的很 清亮,为什么呢?

答:a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全,可以适当提高SDS 浓度,同时将样品煮沸时间延长,b) 也不排除你的抗原浓度过高,这时再加入适量上样缓冲 液即可。 4、我做的蛋白质分子量很小(10KD), 请问怎么做WB? 答:可以选择0.2μml的膜,同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起,再转移。 其他按步骤即可。 5、我的目的带很弱,怎么加强? 答:可以加大抗原上样量。这是最主要的。 同时也可以将一抗稀释比例降低。 6、胶片背景很脏,有什么解决方法?答:减少抗原上样量,降低一抗浓度,改

变一抗孵育时间,提高牛奶浓度。 7、目标带是空白,周围有背景,是为什 么? 答:你的一抗浓度较高,二抗上HRP 催化活力太强,同时你的显色底物处于一个临界点,反应时间不长,将周围底物催化完,形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低,或更换新底物。 8、我的胶片是一片空白,是怎么回事? 答:如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。 a) 二抗的HRP 活性太强,将底物消耗光;b) ECM底物中H2O2,不稳定,失活;c) ECL底物没覆盖到相应位置;d) 二 抗失活。

Westernblot基本操作步骤

W e s t e r n b l o t基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基,加入预冷的PBS洗一遍,加入的RIPA裂解液(含1mM PMSF(100×),每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片,六孔板每孔150-250μl,60mm×15mm 培养皿300-400μl,),于冰上裂解约5分钟,裂解总液12000rpm离心10 min。取上清,用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer,10×reducing,再用裂解液补齐到所需上样体积。离心,使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min,变性,之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准(BSA),配制成5mg/ml的蛋白标准溶液,10μl 分装,-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品,取10μl用PBS稀释至100μl,使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量,按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中,加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中(可以通过预实验摸索稀释倍数),加PBS 到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液,37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制: ①Runnig Buffer(1×):SDS Runnig Buffer(20×)50mL,加MiliQ水至1L; ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL(20%,v/v),加MiliQ水至1L; ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl(pH7.6):60.5g Tris-base,加入约30ml浓盐酸,调PH至7.6,加MiliQ 水至500ml。 TBS缓冲液(10×):1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液(1×):TBS缓冲液(10×)100ml+0.5ml Tween-20(0.05%,v/v),加MiliQ水至1L。 ④封闭液:5% BSA(5g/100ml,称取1g BSA至20ml TBST,充分混匀溶解) 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合,并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min,使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中,并在装置中加满Runnig Buffer(1×),内槽加入0.5mL 抗氧化剂,小心拔下梳子; ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品(总蛋白量20μg以上)。向marker孔中加入2.5μl marker(按照实验要求设定marker量),向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同(或相近)的上样体积,以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳

western blot实验经验总结

western blot实验经验总结 1.抗体的选择 对于国内的大多数实验室来讲,做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很简单,买进口抗体捉襟见肘,买国产抗体得需要大无畏的勇气,对于我所在的兰州地区的实验者而言,感触尤深。在这五年的western blot实验历程里,我先后用过进口抗体,进口抗体国内分装包装,国产抗体,质量良莠不齐。 进口抗体一般不会出现闪失:abcam品种全,质量过硬,但价高(3400元/100微升),而且说是100微升,但至多能吸出来90微升;Sigma的价最贵;比较有性价比的是CST的抗体,现在好像是2200元/100微升,我前后用过二十几种, 1:1000的稀释比下,还没有失过手,100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot 实验,还有一个优点是通常量比100微升多出来10微升,唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗体质量可以,但是选用Santa的单抗还是有风险,估计这也是业界共识了吧。 进口抗体国内分装包装我也用过不少,呵呵,毕竟是穷人(420元/100微升),大概好抗体的比例约为50%,如果能做出来,也存在一个问题,就是抗体大多只能用一次。我曾经把Santa的原装抗体和分装抗体做过比对(抗体品种,货号等完全一致),在都能做出来的前提下,原装抗体能重复使用的次数要多出许多。具体原因我已经揣测了好几年,不敢说出来,我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整个卖,也会有所不同。揣测归揣测,假如只为了发论文毕业走人,可以考虑选用进口分装的多克隆抗体。 国产抗体比较知名的就几家,但质量确实不敢恭维。western blot能做出来的确实不多,而且杂带多,背景不干净。我们周边的实验室大多买国产抗体做免疫组化,怎么说呢,应付硕士论文够了。 我也帮别人自制过抗体,再用抗原亲和纯化。效价非常不错,夸张的时候1:10000都能做出条带,唯一的麻烦是兔子太骚(骚臭),不知道这是不是“兔女郎”名号的来由。如果读书非常悠闲,老板又特别想拥有手工作坊的情况下,可以自己伺候折腾兔子来玩玩,刚开始的时候还是蛮有成就感的。只是单凭抗原表达和制备多抗,是不是可以写成论文毕业,估计因校而异了。 2.Western Blot设备 目前最好的垂直槽和转移槽还是Biorad(伯乐),尤其是MINI3好用,MINI4可以一次跑四块胶,但通常用不上,由此造成垂直缓冲液的浪费,而且MINI4用绿色塑料夹住玻璃板来组成内槽,容易漏液,塑料夹应该是有疲劳寿命的,估计日子一长,弹性就会改变,所以如果你们实验室刚买了MINI4,赶紧用,遭殃的肯定是某一级的师弟师妹们。 Biorad的一套系统得两万多,西部能玩得起伯乐的还真不多。好在咱中国人聪明,上海天能的外观和构造和伯乐的MINI3几乎一模一样,而且可以通用,不带电泳仪是5千多一套,挺好用的。唯一的不足是塑料寿命不如伯乐,胶架容易断裂。不过仔细算算,三套天能也就是一套伯乐的价格,值了。北京六一的垂直槽

WesternBlot原理和操作方法(全)讲解

Western Blot 原理和操作方法(全) Western Blot 工作原理 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol 的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广旱挠τ? SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基. 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部. 重要参数 ①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算: T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100% 其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml) ②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度: 蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%) <104 20-30

westernblot原理及步骤

westernblot原理及步骤 Western blot基本原理: 在电场的作用下将电泳分离的多肽从SDS-PAGE凝胶转移至一种固相支持体,然后用这种多肽的特异抗体来检测。 Western blot应用: 目的蛋白的表达特性分析; 目的蛋白与其他蛋白的互作; 目的蛋白的组织定位; 目的蛋白的表达量分析; 蛋白样品的制备: 1 水溶液提取法:稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大,是提取蛋白质最常用的的溶剂,操作相对麻烦,重复性一般; 2 有机溶剂提取法; 3 离心管柱提取法:超快速,易用,高产及重复性强; 4 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。 Western blot注意事项和常见问题:

1 我的细胞提取液有的有沉淀,有的很清亮,为什么呢? 答:有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全,可以适当提高SDS 浓度,同时将样品煮沸时间延长;也不排除你的抗原浓度过高,这时再加入适量上样缓冲液即可。 2 我做的蛋白质分子量很小(10 KD),请问怎么做WB? 答:可以选择0.2 μm的膜,同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起,再转移。 3 最后显色时用DAB好还是ECM好? 答:DAB 有毒,但是比较灵敏,是HRP 最敏感的底物;ECM结果容易控制,但被催化时灵敏度差一点,但如果达到阀值,就特别灵敏,可以检测pg 级蛋白,具体可以根据你实验的情况。 4 要验证某个细胞上有无该蛋白的存在,需要做免疫组化和western blot试验吗?做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗? 答:①免疫组化可以用来进行定位,但是不能精确定量,而且有时会有假阳性,不易与背景区分;Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子,进行定量,但是不能定位。

最详细的WesternBlot过程步骤详解

最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解

最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解 Pleasure Group Office【T985AB-B866SYT-B182C-BS682T-STT18】

Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下(二抗用HRP标记):反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带。

WB操作步骤-自己整理

Western Blot 相关实验方法与试剂(湿转法) 人工肝实验室学习姚瑶 (一)目的蛋白提取: (1)单层贴壁细胞总蛋白的提取: 1、倒掉细胞培养液,加入Hanks液洗涤一次后倒掉,根据所用细胞决定是否用胰酶消化,加入适量(约5ml)新鲜细胞培养液后,将贴壁细胞吹起,并转移至4支离心管内,配平后,1500转离心10min。 2、倒掉上清,用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀,1500转离心10min。 共洗三次,每次十分钟。 3、倒掉上清,吸净,每管加入50ul 细胞裂解液RIPA,吹散,加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠,故应尽快转移至1.5ml EP 管内,-20℃裂解30min。 4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。(可不做) 5、4℃,12000转离心10min。 6、将上清转移至0.5ml EP管中,每管100ul,冰浴待用。 (2)组织中总蛋白的提取: 1、取约100mg肝组织于研磨器内,加入500ul 细胞裂解液RIPA,研磨后吸出于1.5ml EP管内,再加入500ul RIPA,研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。

2、配平后,4℃,14000转离心10min。 3、将上清分装于0.5ml EP管内,每管100ul,冰浴待用(二)蛋白含量的测定: 1、稀释标准品:10ul标准品C液+90ul PBS溶液,混匀。 2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内,并用PBS将各孔补足20ul。 3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul,(可采用倍比稀释法),并用PBS将各孔补足20ul。 4、配制工作液:按A液:B液=50:1配制适量工作液,每孔加入200ul。 5、37℃水浴30min。 6、酶标仪测定各孔OD值(A570,Mode1)。 7、绘制标准曲线,计算样品蛋白浓度。 (三)SDS-PAGE电泳: (1)清洗玻璃板 (2)灌胶与上样: 1、配胶:根据目的蛋白的大小,决定分离胶的浓度。

wb原理步骤及总结

实验原理 蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上,然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术,包括三个部分:SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白质的电泳转移,免疫印迹分析。 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量,SDS是阴离子去污剂,能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏其高级结构。SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1,由于SDS带有大量的负电荷,与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别,使各种蛋白质带有相同密度的负电荷,形似长椭圆棒,蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。因此,利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线,可以求得未知蛋白的相对分子质量。 电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中,探针分子很难通过凝胶孔,将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。方法有两种:①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间,通电10~30min可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间,浸在转移装置的缓冲液中,通电2~4h或过夜可完成。固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。 蛋白质转移到固定化膜上之后,通过蛋白质染料如丽春红S检测膜上的总蛋白,或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量,以验证转移是否成功。用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白,分为4步:①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区,以防止作为探针的抗体结合到膜上,出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育,使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物,适当保温,膜上便可见到颜色反应,检测出抗原蛋白区带。 主要溶液 10%分离胶 水 3.3mL、30% 丙烯酰胺混合液 4.0mL、1.0mol/L Tris(pH8.8)2.5mL、10% SDS 0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED 0.004mL 5%浓缩胶 水 2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/LTris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL 1×Tris –甘氨酸电泳缓冲液 Tris碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS 1g,用去离子水定容至1L 2×SDS凝胶加样缓冲液 Tris-HCl(pH6.8) 100mmol/L,β-巯基乙醇10%,10%甘油,0.01%溴酚蓝,10%SDS 转移缓冲液 Tris 2.45g,甘氨酸11.25g,甲醇100mL,加去离子水至1L TBST Tris 1.21g NaCl 8.77g,Tween-20 1mL,加去离子水至1L Stripping 1.3mL Tris (pH 6.8),4mL10%SDS,140μlβ-巯基乙醇,用水定容到20mL 实验步骤 1 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 ⑴凝胶配置 ①分离胶的配置:将配置好的分离胶液混匀后迅速倒入胶槽中,至距离短玻璃板顶端约2cm 处,停止灌胶。检查是否有气泡,若有用滤纸条吸出。然后在胶液界面上加蒸馏水进行水封。15~30min后,凝胶和水封层界面清晰,说明胶已经聚合完全,然后用滤纸吸取水封层,滤纸切勿接触到凝胶面。(使蛋白样品分离) ②浓缩胶的配置:将配置好的浓缩胶灌注在分离胶之上,直至短玻璃板的顶端,然后插入样品

WB实验步骤

蛋白电泳(制胶、SDS-PAGE电泳) 实验材料: SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer(还原,5×)、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水 实验仪器、耗材: 蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒(可在微波炉里加热使用) 配制溶液: ●配制10%APS溶液:-20度保存 0.5g APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25ml蒸馏水 ●配制200 ml电泳缓冲液:CW0045 Tris-Glycine SDS(ph8.3,10×) 20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水 ●配制1 ml loading buffer: 200 ul 5×loading buffer +800 ul蒸馏水 实验步骤: 一.制胶: 1.参照凝胶模具说明书,装配好凝胶模具。 2.根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。 3.配制10%分离胶: 将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。 加入10%APS和TEMED,轻轻搅拌使其混匀,避免产生气泡。 配制SDS-PAGE分离胶

4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶,加入蒸馏水水封。静置40分钟 至1小时。 5.待分离胶凝固后(水层胶层中间出现折线),倒掉蒸馏水,用滤纸将水溶液吸干。 6.配制5%浓缩胶: 7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面,直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。 注意:灌胶速度要快,防止凝胶。 8.将梳子插入凝胶内,避免产生气泡。静置20分钟,等待浓缩胶聚合。 9.待凝胶聚合后,小心地拔出梳子,以免破坏加样孔。赶走气泡。 二.SDS-PAGE电泳: 1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。 2. 制备样品: 1)蛋白样品: 根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果,计算蛋白提取液加入量,制备上样溶液。 蛋白提取液+ 5×上样缓冲液+ 蒸馏水,上样量为40-60ug。 制备的样品,煮沸5分钟,12,000 rpm离心5分钟,取上清,上样。

WB实验问题

Western Blot问题指南 时间:2011-05-13 08:55 来源:网络作者:admin点击:3679次 根据问题的类型主要分成以下几类(以下资料权作参考,请勿盲目模仿!); 1.参考书 推荐A.对初学者看什么资料比较好?解答:《抗体技术实验指南》和Antibodies (a laboratory manual , 根据问题的类型主要分成以下几类(以下资料权作参考,请勿盲目模仿!); 1. 参考书推荐 A. 对初学者看什么资料比较好? 解答:《抗体技术实验指南》和Antibodies (a laboratory manual,wrote by Ed Harlow ,david lane )两本书不错。 2. 针对样品的常见问题 B. 做线粒体膜UCP蛋白的Western Blot (以下简写成Western Blot),提取线粒体后冻存(未加蛋白酶抑制剂),用的博士德的一抗,开始还有点痕迹,现在越来越差,上样量已加到120 口g,换了个santa cloz 的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制剂单力口PMSF亍吗? 解答:怀疑是样品问题,可能是:1,样品不能反复冻融;2,样品未加蛋白酶抑制剂。同时,建议检查Western Blot过程,提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说,一般加PMSF就可以了,最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。 C. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗? 解答:当然可以,有的甚至可以同时测几十种样品。 D. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白,操作需要注意什么? 解答:如果是膜蛋白和胞浆蛋白,所用的去垢剂就要温和得多,这时最好加上NaF去抑 制磷酸化酶的活性。 E我的样品的蛋白含量很低,每微升不到1微克,但是在转膜时经常会发现只有一部分 蛋白转到了膜上,就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在,只是颜色变淡了, 有什么办法可以解决? 解答:你可以加大上样量,没有问题,还有转移时你可以用减少电流延长时间,多加5—10%甲醇。 F. 想分离的蛋白是分子量260kd的,SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适?积层胶的 浓度又该用多少?这么大分子量的蛋白容易作Wester n Blot吗? 解答:260kd的蛋白不好做,分离胶用6%, Stacking Gel 3.5 %。 G. 如果上样量超载,要用什么方法来增加上样量?如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。 解答:可以浓缩样品,也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超载30%是不会有问题的。如果已经超了不少了,而且小分子量的也要,可以考虑加大胶的厚度,可以试试1.5m m的comb。

WB实验原理

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹技术 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro等建立,主要用于测定蛋白质亚基分子量。Western 印迹是在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳基础上,将电泳分离的蛋白组分从凝胶转移至一种固相支持物上,应用抗体可与附着于固相支持物上的靶蛋白发生特异性反应的特点,针对特定蛋白进行鉴别和定量。 原理 1.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS是一种阴离子去污剂,作为变性剂和助溶剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂,例如巯基乙醇和二硫苏糖醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后,蛋白质分子被解聚,使其氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。在水溶液中蛋白质-SDS胶束的长度与亚基分子量的大小成正比。因此这种胶束在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响,而主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD~200KD之间时,电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此可见,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅可以分离蛋白质,而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。 2.Western 印迹 在Western印迹法中,待测样品溶解于去污剂和还原剂的溶液中,经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后被转移到固相支持物上(常用硝酸纤维素滤膜),然后可被染色。随后滤膜可与抗靶蛋白的一抗反应。最后,结合上的抗体可用多种二级免疫学试剂(与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的A蛋白或抗免疫球蛋白)检测。Western 印记法可测出1-5ng中等大小的待检蛋白。 方法 1.样品的制备 从细胞中提取蛋白质样品用于Western印记的方法有两种,一是可以在加样缓冲液中直接溶解完整细胞;二是制备细胞提取液。可根据不同的目的采用不同的方法。如果仅是定性实验,可应用第一种方法;如果需测定蛋白含量并进行定量实验,可应用后一种方法。1.1 凝胶加样缓冲液裂解哺乳动物细胞和组织制备蛋白质样品 1)裂解细胞或组织 a.单层培养细胞:用PBS缓冲液漂洗细胞2次,弃去洗液并吸尽残余的PBS液体, 加入一定体积(50~200μl)的加热到85℃的1×SDS凝胶加样缓冲液[50mmol/L Tris.Cl(pH 6.8), 100mmol/L 二硫苏糖醇(DTT), 2% SDS, 0.1% 溴酚蓝,10%甘油] 溶解细胞,用细胞刮刀把粘稠状的细胞裂解物收集于一个微量离心管中,用于步骤2)。 b.悬浮培养细胞:用冷的PBS充分洗涤细胞后,去尽残液,加入一定体积用冰预冷 的悬浮缓冲液[0.1mol/L NaCl,0.01mol/L Tris.Cl(pH 7.6),0.001mol/L EDTA (pH 8.0),1μg/ml Aprotinin,100μg/ml PMSF],涡流振荡混匀后,加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液[100mmol/L Tris.Cl(pH 6.8), 200mmol/L 二硫苏糖醇(DTT), 4% SDS, 0.2% 溴酚蓝,20% 甘油],混匀后,用于步骤2)。

Western_Blot操作步骤

Western Blot操作步骤 一、 Western blot 实验步骤概述 1. 组织取材:组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA),PMSF(每克组织30μl,10 mg/ml PMSF),利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃ 4. 加入PMSF(每克组织30μl,10 mg/ml PMSF),冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g(约15,000转)15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度),并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳(浓缩胶20mA,分离胶35mA) 12. 电转膜仪转膜(100mA 40分钟) 13. 膜用丽春红染色,胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 二、 Western具体实验步骤 Western,也称Western blot、Western blotting、Western印迹,是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation):可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白,例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等,可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白,也可以使用试剂盒进行抽提。收集完蛋白样品后,为确保每个蛋白样品的上样量一致,需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同,需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用北京博奥森生物技术公司生产的WIP细胞裂解液,可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。 2.电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制:SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制,也可以使用博奥森生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。

Western Blot常见问题及处理总结

免疫细胞研究westernblot WesternBlot常见问题及处理总结 阿木 1、westernblot的优点 答:灵敏,可达ng级,用Ecl显色法理论上可达pg级。方便,特异性高。 2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白? 答:原因有很多:a)你的细胞中不表达这种蛋白质,换一种细胞;b)你的细胞中的蛋白质被降解掉了,你必需加入PMSF,抑制蛋白酶活性;c)你的抗体不能识别目标蛋白,多看看说明,看是否有问题。 3、我的细胞提取液有的有沉淀,有的很清亮,为什么呢? 答:a)有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全,可以适当提高SDS浓度,同时将样品煮沸时间延长,b)也不排除你的抗原浓度过高,这时再加入适量上样缓冲液即可。 4、我做的蛋白质分子量很小(10KD),请问怎么做WB? 答:可以选择0.2μml的膜,同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起,再转移。其他按步骤即可。

5、我的目的带很弱,怎么加强? 答:可以加大抗原上样量。这是最主要的。同时也可以将一抗稀释比例降低。 6、胶片背景很脏,有什么解决方法? 答:减少抗原上样量,降低一抗浓度,改变一抗孵育时间,提高牛奶浓度。 7、目标带是空白,周围有背景,是为什么?答:你的一抗浓度较高,二抗上HRP催化活力太强,同时你的显色底物处于一个临界点,反应时间不长,将周围底物催化完,形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低,或更换新底物。 8、我的胶片是一片空白,是怎么回事? 答:如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。 a)二抗的HRP活性太强,将底物消耗光;b)ECM 底物中H2O2,不稳定,失活;c)ECL底物没覆盖到相应位置;d)二抗失活。 9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢? 答:a)可能是红灯造成的,胶片本来就被曝光了,可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.; b)显影时间过长。 10、DAB好还是ECM好?

westernblot原理及步骤

一、配胶 原理: 30% acrylamide mix:产生凝胶的基本物质 1.5M Tris(ph 8.8) :使分离胶PH为8.8(与甘氨酸的pka接近,从而使不同分子量的蛋白产生不同的电泳速度,从而使不同分子量的蛋白分开)1.0MTris(ph 6.8):使浓缩胶PH为6.8(可以通过甘氨酸和氯离子的作用产生压缩,从而使蛋白条带压细) 10% SDS阴离子去污剂:断裂分子内和分子间氢键,破坏蛋白质二三级结构,消除蛋白质在迁移过程中结构的影响。与蛋白质形成SDS-蛋白质复合物,由于SDS带有大量负电荷,蛋白质本身的电荷被掩盖,从而消除蛋白质迁移过程中自身电荷的差异造成的影响。同时能够助溶,蛋白质变为亲水,容易在水相中迁移。每克多肽可以与1.4g 去污剂结合,当分子量在15kd-200kd之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,logMW(分子量)=K-bx(迁移率)AP:提供acr丙烯酰胺和bis亚甲丙烯酰胺聚合的氧自由基,是acr 和bis聚合的引发剂 TEMED:催化AP释放氧自由基,是反应的催化剂 1、清洗干净1.5mm或1mm玻璃板,检漏(有豁口和字的朝上) 2、倒掉水,配10ml 10%的分离胶(1.5mm板需要7ml,1mm 板需要4.5ml) 10%方案如下: H2O 4.0ml

30% acrylamide mix 3.3ml 1.5M Tris(ph 8.8) 2.5ml 10% SDS 0.1ml 10% ammonium persulfate 0.1ml TEMED 0.004ml 3、混合后上下摇晃,注意不要放在手中配(否则温度太高凝固的快),静置15s后用1ml枪二档吸一档打(在一角加即可,不用来回加,否则容易出气泡。不过出气泡了也没事,加水压一下就浮上来了) 4、加进玻璃板中,随后均匀来回加水到满 5、等待20分钟 6、倒掉水,将架子倒置过来让水排干,用纸巾擦拭斜角(一定要擦干净所有的水!否则两层胶之间出现水层就废了),同时配浓缩胶4ml H2O 2.7ml 30% acrylamide mix 0.67ml 1.0M Tris(ph 6.8) 0.5ml 10% SDS 0.04ml 10% ammonium persulfate 0.04ml TEMED 0.004ml 7、加满分离胶后插入1.5mm或1mm的梳子,注意不要有气泡,

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